Name: Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Aprenda a purificar e expandir células T CD4+ antígeno específicas do sangue periférico e visualizá-las usando tetrâmeros de MHC classe II. Este método permite identificar precisamente populações de células T específicas.

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Agradecemos a Dick Foley e Leigh Kimball para seus papéis-chave na filmagem e produção de vídeo.

1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC) <ol><li> Obter uma amostra de sangue - sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue - cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T. </li><li> Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distribuir o plasma </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 40 mL e underlay através da elaboração de 11 mL de Ficoll, inserindo no tubo de sangue, e com cuidado retirar a ajuda da pipeta pipeta. O Ficoll irá drenar lentamente para o fundo do tubo. Uma vez que o nível tem empatou, lentamente, remova a pipeta do tubo de sangue e descartar. </li><li> Cap os tubos de sangue e passar para as latas Aerosolve. Feche as vasilhas e centrifugar a 900 × g por 20 minutos - sem freio. É fundamental que nenhum freio é aplicado no final desta rodada como a força de travagem vai perturbar a camada de células. </li><li> Após a rodada, os PBMCs devem formar uma camada distinta em branco entre o plasma amarelo (acima) e Ficoll transparente (abaixo). Suavemente escumar camada de células brancas do sangue usando uma pipeta e transferir para novo tubo. Alguns plasma e Ficoll pode ser elaborado com a PBMCs, mas evitar a elaboração de qualquer um dos camada de células vermelhas. Normalmente, dois tubos de sangue podem ser combinados em um tubo de células nesta etapa para aumentar o tamanho da pelota. </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 500 × g por 15 minutos - de freio baixo em vasilhas aerosolve. </li><li> Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar o pellet </li><li> Tratar com tampão hemolítica adicionando 5-6 mL de cada tubo e misturar delicadamente para remover coágulos. Incubar por não mais que 5 minutos. </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 230 × g por 10 minutos - de freio baixo. Vasilhas Aerosolve não são mais necessários para esses spins mais lento. </li><li> Lave duas vezes: Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, preencha tubo com PBS e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Antes da etapa de lavagem final, retire uma alíquota de re-suspensão de células, diluir com azul de tripano, e contar com um hemocitômetro. Esta contagem de células vai ditar os volumes de reagentes utilizados na etapa de separação de células T. </li></ol> 2. CD4 + T * separação de células <ol><li> Aspirar líquidos e adicionar tampão de corrida para trazer o volume total de até 40 uL por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 uL de tampão mais o volume de pelotas residual. </li><li> Transferir este volume para um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Adicionar cocktail anticorpo do kit de isolamento CD4 - 10 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 10 minutos </li><li> Retire o tubo do gelo, retire a tampa e adicionar 30 uL de tampão de corrida por 10 milhões de células </li><li> Adicionar esferas magnéticas do kit de isolamento CD4 - 20 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 15 minutos </li><li> Adicionar dez volumes de tampão de corrida para lavar e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Durante a rodada, configurar o ímã e 5 mL em tubo de polipropileno seu espaço de trabalho </li><li> Aspirar líquido de pellet celular, adicione 2 mL de tampão execução e remover pedaços usando uma pipeta </li><li> Usando a mesma pipeta de transferência, a transferência de células dentro do tubo de 5 mL e incubar no ímã para 15 minutos </li><li> Decantar com precaução o CD4 + fração de células em um tubo de 15 mL marcada pelo ímã invertendo o esvaziamento e todos, mas a última gota </li><li> Acrescentar ainda 2 ml de tampão de corrida para o tubo de 5 mL e retire do ímã </li><li> Gentilmente lavar o CD4-células fora dos lados do tubo e transferir para um tubo de 15 mL marcada </li><li> Adicionar 2 mL médio de células T a cada tubo, remova alíquotas para contagem de células e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Diluir alíquotas celular com azul de tripano e contar com um hemocitômetro. Estas contagens de células vai ditar o número de poços utilizados para a etapa de expansão da cultura. </li></ol> * Alternativamente, MACS colunas e contas (Miltenyi Biotec), o separador de células AutoMACS (Miltenyi Biotec), ou Robosep separador de células (Cell Stem Technologies) pode ser usado de acordo com instruções fabrica no lugar de passos 2,2-2,11. 3. Cultivo in vitro de Expansão <ol><li> Aspirar o líquido do CD4 + e de células CD4 e pellets, com base na contagem de células, adicionar meios de cultura (tipicamente 3 milhões CD4 + células por mL e 10 milhões de CD4-células por mL funciona bem para criar a cultura). A cultura de expansão requer 3-5000000 CD4-células por poço e 2-3000000 CD4 + células por poço em um volume total de 1 mL da cultura em media uma placa de cultura de 48 também. Normalmente, células CD4 + estão limitando a população </li><li> Se desejar, irradiar os CD4-células (5000 Rad s). Alíquota CD4-células para o número apropriado de poços em um prato bem, adicionando 48 mL a cada 300-500. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 1 hora. O aderente CD4-células servirão como células apresentadoras de antígenos na cultura de expansão. </li><li> Remova a placa da incubadora. </li><li> Lavar os poços por adição de 500 uL de mídia fresco e cuidado pipetando para cima e para baixo 12-20 vezes usando uma pipeta de transferência e remoção de todo o líquido. Esta lavagem vai deixar para trás uma camada de células aderentes antígeno apresentando. </li><li> Quando a lavagem estiver completa, adicione mídia apenas o suficiente para molhar a parte inferior de cada bem (cerca de 100 uL) - caso contrário, as células aderentes vai secar </li><li> Adicionar 2-3000000 células CD4 + a cada poço. Se necessário, adicione mídia adicional para trazer o volume total em cada poço até 1 mL. </li><li> Adicione o peptídeo desejado para cada poço. A concentração típica para a estimulação é de 10 ug / mL final. </li><li> Colocar a placa em uma incubadora de 37 ° C por 7 dias. </li><li> Após 7 dias, adicionar 50 uL de Hemogen IL-2 (ou equivalente, como recombinante IL-2, 10 IU / mL) a cada poço. </li><li> Em cada dia subseqüente, monitorar o crescimento de células usando um microscópio. Alimentar poços que ainda não são confluentes, removendo metade dos media, acrescentando novas mídias e 50 uL de IL-2. Dividir poços confluentes pela ressuspensão das células, movendo-se metade das células para um poço vazio, agregando novas mídias e 50 uL de IL-2. Retorno células a incubadora. </li><li> As células expansão estará pronto para tetrâmero após 13-15 dias de cultura. </li></ol> 4. Visualizando células T através da coloração tetrâmero <ol><li> Comprar ou montar tetrâmeros para combinar com as combinações de peptídeo / MHC que correspondem à CD4 + estimulou as células T (veja a discussão de fontes de reagentes tetrâmero). Tetrâmeros devem ser ~ 0,5 mg / mL. </li><li> Retire a placa da incubadora </li><li> Cuidadosamente a tirar metade dos meios de comunicação de cada poço </li><li> Transferir uma alíquota de células de cada poço - geralmente 75 mL ou cerca de 50 mil células - em um tubo de poliestireno 5 mL FACS </li><li> Adicionar tetrâmero - tipicamente mL 1 por 50 volume de mL total - e colocar em 37 ° C incubadora de 1-2 horas. Também é aconselhável a manchar uma alíquota de segundo de células de cada poço com um tetrâmero incompatíveis como controle negativo. </li><li> Células etiqueta com anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 anticorpos adicionando 30-10 mL de cada anticorpo. Marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos podem ser usados. No entanto, não use anticorpos PE rotulados desde que este canal deve ser reservado para o tetrâmeros. Neste momento, também único rótulo controles de cor ou isotipo usando células extra. </li><li> Células anticorpo rotulado incubar por 15-30 minutos em gelo ou a 4 ° C. </li><li> Lavar cada tubo com 0,5 a 2 mL tampão de corrida e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Cuidadosamente decantar líquidos a partir de tubos FACS. Armazenar todos os tubos em um recipiente coberto (de preferência no gelo) para análise FACS subseqüentes. </li></ol> 5. Aquisição e Análise de fluxo citómetro <ol><li> Calibrar O citómetro usando pérolas de referência. </li><li> Verifique as configurações do instrumento: <ol><li> Usando células controle imaculada ou controles isotipo, ajustar a localização da porta de linfócitos viáveis ​​(FSC versus SSC). Remover auto-fluorescência de todos os canais pela centralização da população (alterando as configurações ganho) abaixo da primeira década em cada eixo. </li><li> Usando tubos de cor única de controle, centro de eventos dentro da quadrantes correto para cada cor (alterando as configurações de compensação). </li><li> Fazer um ajuste fino das configurações do instrumento usando um tubo manchado com um tetrâmero irrelevante. Em configurações específicas para o canal de PE podem precisar de ajustes, porque muitas vezes tetrâmeros mancha mais brilhante do que o controle de anticorpos. O tetrâmero irrelevantes devem mancha &lt;0,5% das células CD4 +. </li></ol></li><li> Aquisição de dados para cada tubo <ol><li> Coletar eventos para cada tubo de amostra e tubo de controle negativo </li><li> Adquirir e salvar pelo menos 20.000 eventos para Analysys </li></ol></li><li> Analisar os dados <ol><li> Importar arquivos de dados em FACS software de análise (por exemplo, software CellQuest, WinMDI, ou programa FlowJo). Comece sua análise através de um tubo manchado usando um tetrâmero irrelevante. </li><li> Plot FSC versus SSC e desenhar uma porta em torno dos linfócitos ao vivo (Figura 1, o painel superior esquerdo). </li><li> CD4 trama contra CD3 (linfócitos gated para mostrar ao vivo apenas) e desenhar portas em todo o CD3 + e CD4 + populações (Figura 1 painel superior direito). </li><li> CD4 enredo vs tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD3 + somente) e estabelecer os limites para que o quadrante CD4 + + tetrâmero população é menos de 0,5% (Figura 1 painel inferior esquerdo). </li><li> Plot CD25 versus tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD4 + apenas) e definir os limites do quadrante de modo que o CD25 + + tetrâmero população é inferior a 0,5% (Figura 1 painel inferior direito). </li><li> Analisar todos os tubos de amostra, sem alterar as portas. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "alt =" Figura 1 "width =" 600 "height =" 342 "/&gt; Figura 1. Representante controlo negativo resultados de coloração tetrâmero. O painel superior esquerdo mostra a frente scatter scatter lado versos eo portão tamanho de linfócitos (R1). O painel superior direito é fechado para R1 e mostra ant-CD4 versus anti-CD3 e CD3 + (R2) e CD4 + (R3) portões. O painel inferior esquerdo é fechado para R2 e shows anti-CD4 contra tetrâmero. O painel inferior direito é fechado para R3 e shows anti-CD25 contra tetrâmero. Os quadrantes para ambos os lotes tetrâmero foram ajustados para 0,5%. 6. Resultados representante <ol><li> As células tetrâmero positivo deve ser uma população distinta entre as células CD4 + expandido (Figura 2). </li><li> Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. </li><li> Em alguns casos, uma combinação MHC / peptídeo pode dar coloração de fundo (geralmente causadas por um peptídeo com baixa solubilidade). Coloração de fundo como pode ser diferenciado de um verdadeiro positivo porque o "falso positivo" células não são uma única população distinta em ambos os CD4 vs tetrâmero ou o CD25 versus parcelas tetrâmero (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> Figura 2. Coloração resultados positivos Representante tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. As células tetrâmero positivos aparecem como uma população distinta CD4 elevado na CD4 anti-versus tetrâmero painel e uma distinta população CD25 + sobre o anti-CD25 contra painel de tetrâmero. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figura 3" width="600" height="336"> Figura 3. Representante "falsos positivos" os resultados da coloração tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. O CD4 anti-versus painel mostra um tetrâmero coloração indistinta "mounded". O anti-CD25 contra tetrâmero mostra também uma coloração "mounded", sem tendência clara em direção a ser CD25 +.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II são conjugados proteína fl...

<table><tbody><tr><td>Capela de fluxo laminar Classe 2</td><td>equipamento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>equipamento</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>PBS 1X (sem Ca/Mg)</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>envolvido em papel alumínio para proteger da luz</td></tr><tr><td>Pipetador Pipet Aid XP</td><td>equipamento</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 mL</td><td>equipamento</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Cartuchos Aerosolve</td><td>equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>com inserções de 50 mL</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>equipamento</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>equipamento</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tampão hemolítico</td><td>Reagente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA dissódico</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,2% em PBS</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>equipamento</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>equipamento</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Tampão de corrida</td><td>Reagente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA</td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Células T CD4+ MACS II</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Ímã EasySep&amp;#174;</td><td>equipamento</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno de 5 mL</td><td>equipamento</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>com 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Soro humano em pool</td><td>Reagente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>coletado de doadores saudáveis, inativado pelo calor e filtrado</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Filtro de garrafa de 500 mL com poro de 0,22 mícron</td><td>equipamento</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Placa de 48 poços</td><td>equipamento</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C com CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>equipamento</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Peptídeo sintético de 20 mg/mL</td><td>Reagente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Síntese personalizada com qualquer fornecedor de peptídeos</td></tr><tr><td>Tubo FACS de 5 mL</td><td>equipamento</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Poliestireno</td></tr><tr><td>Tetramero de classe II carregado com peptídeo (conforme descrito)</td><td>Reagente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado pelo núcleo de tetrameros do BRI</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Reagente</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>Reagente</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo Facs Calibur</td><td>equipamento</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Ou equivalente</td></tr></tbody></table>

visualizando cd4 + antígeno específico células t usando mhc classe ii tetrâmeros

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados ​​por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II permitem a visualização direta de células T CD4+ antígeno-específicas por citometria de fluxo. Este método ...

Bem, o que é realmente único no ensaio Teer é que ele permite visualizar diretamente as células T específicas para antígenos. O te, o teer é o principal aspecto único do nosso ensaio. Isso é combinado com uma etapa de amplificação que realizamos.Você sabe, isolamos os linfócitos T e então os cultivamos em um ambiente que enriquece a amostra com os linfócitos T que nos interessam. Em seguida, conseguimos rotular especificamente apenas essas células e visualizá-las em um citômetro de fluxo. Assim, com ensaios anteriores, como o CSFE ou ensaios de proliferação que existem há décadas, o que se obtém são apenas medições globais do que está ocorrendo com toda a população de linfócitos T.Mas você possui milhões de células T no organismo, e elas reconhecem um conjunto inteiro e diversificado de padrões. Se tiver sorte, talvez uma em cada 200 a 300.000 células da amostra seja aquela que você está procurando. E é por isso que este ensaio realiza essas etapas de enriquecimento.E então, com um número de teste, e porque você está corando diretamente, é possível visualizar, mesmo com fundo baixo, uma população que representa menos de 1% do número total de células. Assim, é possível observar dife

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo demonstra um método para caracterizar células T de memória CD8+ específicas para o vírus da imunodeficiência símia (SIV) usando tetrâmeros de classe I do complexo de histocompatibilidade principal peptídico (pMHC-I). Um tetrâmero pMHC-I é um complexo de quatro moléculas de MHC-I ligadas a peptídeos específicos do SIV e conjugadas a um fluoróforo. Esses tetrâmeros se ligam seletivamente aos receptores de células T (TCRs) em células T CD8+ específicas para SIV, facilitando a...

Uma técnica de coloração de tetrâmero Peptide-MHC-I para analisar células T de memória CD8+ específicas para SIV

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Este protocolo descreve o uso da única cadeia de MHC classe I complexos para investigar interações moleculares na ativação de células T CD8 + humana: geração de engenharia apresentadoras de celulas que expressam cadeia única constrói, cultura de clone humano de células T CD8 + e experimentos de ativação de células T.

Uso da tecnologia de MHC única cadeia para investigar Co-Genealogia na ativação de células T humanas CD8 +

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a purificar e expandir células T CD4+ antígeno específicas do sangue periférico e visualizá-las usando tetrâmeros de MHC classe II. Este método permite identificar precisamente populações de células T específicas.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

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