Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Bem, o que é realmente único no ensaio Teer é que ele permite visualizar diretamente células T específicas de antígenos. O te, o teer é o principal aspecto único do nosso ensaio. Isso vem acompanhado de uma etapa de amplificação que fazemos.

Sabe, isolamos as células T e depois as cultivamos em um ambiente que enriquece a amostra para as células T que nos interessam. Então, é, é, conseguimos rotular especificamente só essas células e visualizá-las em um citômetro de fluxo. Então, com ensaios anteriores, como CSFE ou ensaios de proliferação que existem há décadas, o que você obtém é uma espécie de medição geral em massa do que está acontecendo com toda a população de células T.

Mas você tem milhões de células T no corpo e elas veem um conjunto totalmente diverso de padrões. Se você tiver sorte, talvez uma em cada duas a 300.000 células da amostra seja a que você está analisando. E é por isso que esse ensaio faz essas etapas de enriquecimento.

E então, com um número de teste, e porque você está colorindo diretamente, você pode visualizar para longe do fundo uma população que representa menos de 1% do total de células. E assim, você pode ver diferenças muito, muito pequenas e obter uma contagem bastante precisa do número de células T que estão naquela amostra de sangue, sabe, que estão naquele indivíduo que reconhecem seu padrão de interesse. Mas não para por aí, porque os teters também permitem que você não só rotule essas células T, mas as isole para análise posterior.

E os teers que você usa são realmente feitos aqui na BRI, correto? Sim. Somos um dos poucos laboratórios no país que conseguiram alcançar a classe dois de teers. Nossa intenção é distribuir esses reagentes a custo para quaisquer laboratórios interessados em importar essa tecnologia.

Quais você diria que são os aspectos mais difíceis ou desafiadores desse ensaio quando se trata de replicá-lo em outros laboratórios? Bem, pensando bem, na verdade há dois, o crescimento das células T. É algo que realmente é uma espécie de arte.

Você tem decisões quase diárias sobre se as células precisam de nutrientes adicionais ou de espaço extra para crescer. E a segunda parte, que acho que provavelmente é a mais difícil para um operador inexperiente, é a análise de dados. É meio que descobrir qual parte do sinal realmente é uma resposta positiva e qual parte é inerente a, sabe, física e atração.

E o fato de tudo ter algum grau de aderência é algo que, novamente, exige muita experiência, especialmente em contextos onde a resposta geral será um pouco fraca. Como as informações que você vai gerar com esse ensaio têm potencial para beneficiar os pacientes neste momento? Uma das primeiras marcas que surgem em qualquer paciente autoimune é uma espécie de constelação de anticorpos específicos para essa doença.

Sabemos, pelos fundamentos fundamentais da imunologia, que onde houver uma resposta de anticorpos, sempre há uma resposta de células T primeiro. Então, se pudéssemos olhar para indivíduos em risco e ver esse aumento na atividade das células T que precederia a formação de anticorpos, isso nos ajudaria a definir um novo nível de risco ou que os indivíduos estejam caminhando para ter autoanticorpos, o que, com sorte, abriria uma janela para terapias interventivas. Esse procedimento purificará e expandirá as células T CD4 positivas específicas de antígeno e visualizá-las usando reagentes teters e equipamentos de biossegurança de fluxo laminar classe dois.

Este será o principal espaço de trabalho para o procedimento. Tubos cônicos de 50 mililitros para isolamento PBMC, um XPBS. Deve ser um pacote fol livre de cálcio e magnésio mais fol enrolado em papel alumínio para proteger contra recipientes aerossóis CoStar 10 mil com pipetas leves com inserções de 50 mil, usados para evitar contaminação sanguínea da centrífuga.

Pipetas de transferência centrífugas GS seis R, pipetas Pasteur tampão hemolítico contendo 8,3 gramas por litro. Cloreto de amônio 1,0 grama por litro. Bicarbonato de sódio 0,04 gramas por litro DI EDTA sódio azul trian 0,2% solução em PBS HEMO-CITÔMETRO 15 mililitros tubo cônico funcionando com tampão contendo PBS suplementado com dois milimolares EDTA mais cinco gramas por litro.

BSA max CD quatro kit de isolamento dois comprado do bloco de ímãs EP da Milin biotech adquirido da stem cell technologies. Outras plataformas de enriquecimento de células magnéticas poderiam ser usadas com igual eficácia. Tubo de polipropileno de cinco mililitros RPMI 1640 suplementado com 25 milimolares de hippies usado para fabricar soro humano em pool de meio T-cell usado para complementar a tira de caneta do meio T-cell usada para suplementar meio T-cell 500 mililitros filtro de tampa de garrafa de 0,22 micron estéril de 48 poços usado para cultura de expansão in vitro, incubadora de CO2 de grau 37, solução de 20 miligramas por mililitro de peptídeo sintético contendo o epítopo de interesse.

Tubo de fax de cinco mililitros de poliestireno carregado com peptídeos de classe dois, teer usado para visualizar células T específicas de antígeno, anti-CD três, anti-CD quatro e anti-CD 25 usadas para revestir células T específicas de antígeno. Fax do citometro de fluxo de calibre ou equivalente antes de iniciar o procedimento. Reúna todos os materiais e equipamentos no seu espaço de trabalho.

A demonstração a seguir cobrirá os passos a seguir. Isolamento de PBMC, separação de células T CDquatro positivas em cultura de expansão vitro visualizando células T por teem ou coloração. Passo um isolamento PBMC.

Pegue uma amostra de sangue. O sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anticoagulado com heparina na proporção de um para 50 para evitar a coagulação; espere um rendimento de cerca de 1 milhão de PBMC por mililitro de sangue. Cerca de 40% deles serão células T CD4 positivas.

Aliquota o sangue em tubos cônicos de 50 mililitros. 25 mililitros de sangue por tubo. Misture suavemente o sangue antes da coagulação da ALI para distribuir o plasma.

Adicione PBS elevando o volume total para 40 mililitros e faça a base secando 11 mililitros de fial inseridos no tubo sanguíneo e removendo cuidadosamente o auxílio da pipeta. O fial vai drenar lentamente para o fundo do tubo. Quando o nível estiver equilibrado, remova lentamente a pipeta do tubo de sangue, descarte a tampa dos tubos de sangue e entre no aerossol dos cilindros.

Feche firmemente os recipientes e centrifuge a 900 vezes G por 20 minutos sem pausa. É fundamental que nenhuma ruptura seja aplicada ao final desse spin, pois a força de ruptura perturbará a camada de células após o spin. O PBMC deve formar uma camada branca distinta entre o plasma amarelo acima e o fial transparente abaixo.

Retirar suavemente a camada de glóbulos brancos usando uma pipeta de transferência e transferir para o novo tubo. Um pouco de plasma e fial podem ser extraídos com o PBMC, mas evite extrair qualquer camada de glóbulos vermelhos. Normalmente, dois tubos sanguíneos podem ser combinados em um único tubo celular nessa etapa.

Para aumentar o tamanho do pellet, adicione PBS elevando o volume total para 15 mililitros e centrifuge a 500 vezes G por 15 minutos em semi-baixa e aerossol dos cilindros aspire líquido usando uma pipeta de pasta, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Trate com buffer hemolítico adicionando de cinco a seis mililitros a cada tubo e misturando suavemente para remover os aglomerados. Incube por no máximo cinco minutos.

Adicione PBS elevando o volume total para 50 mililitros e centrifuge a 230 vezes G por 10 minutos. Em rotações baixas, os cilindros de aerossol não são mais necessários para essas rotações mais lentas. Lave o líquido duas vezes, aspire o líquido usando um tubo cheio de pipeta de pasto com PBS e centrifuge a 230 vezes G por 10 minutos antes da etapa final de lavagem, remova uma aliquota de células ressuspensas, dilua com azul triano e conte usando um hemonômetro de citômetro.

Essa contagem de células ditará os volumes de reagentes usados na separação das células T. Passo dois, separação positiva de células T CDquatro em CD, aspirar líquido e adicionar um buffer contínuo para elevar o volume total para 40 microlitros por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 microlitros de tampão mais o volume residual do pellet.

Transfira esse volume para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione um coquetel de anticorpos dos quatro kits de isolamento do CD, 10 microlitros por tubo de 10 milhões de células e coloque no gelo por 10 minutos. Remova o tubo do gelo, remova a tampa e adicione 30 microlitros de tampão em funcionamento a cada 10 milhões de células.

Adicione contas magnéticas do kit de isolamento CD 4. 20 microlitros por 10 milhões de células tapar o tubo e colocar no gelo por 15 minutos. Adicione 10 volumes de buffer em funcionamento para lavar e centrifugar a 230 vezes G por 10 minutos.

Durante a centrifugação, instale o ímã e o tubo de polipropileno de cinco mililitros no seu espaço de trabalho. Aspire líquido de pellets de células. Adicione dois mililitros de buffer funcionando e remova os grumos usando uma pipeta de transferência.

Usando a mesma pipeta de transferência, as células transferem para o tubo de cinco mililitros e incubam no ímã por 15 minutos. Decante cuidadosamente a fração de células T CD4 positivas para um tubo de 15 mil marcado, invertendo o ímã e esvaziando tudo, exceto a última gota. Adicione mais dois mililitros de buffer de funcionamento ao tubo de cinco mililitros e remova do ímã.

Enxágue suavemente as quatro células negativas do CD das laterais do tubo e transfira para um tubo marcado de 15 mil. Adicione dois mililitros de meio de células T a cada tubo. Remova as alíquotas para contagem de células e centrifuge a 230 vezes G por 10 minutos.

Dilua as alíquotas celulares com azul de trian e conte usando um hemorocitometro. Essas contagens celulares determinarão o número de poços usados para a cultura de expansão. Passo três.

A cultura de expansão in vitro aspira líquido dos pellets celulares CD quatro positivos e CD quatro negativos com base na contagem celular. Adicione mídia às quatro células CDpositivas para ajustar o volume para 3 milhões de células por mil. Adicione mídia ao CD quatro células negativas para ajustar o volume para 10 milhões de células por mil.

A cultura de expansão requer 3 milhões de células CD quatro negativas por poço e de dois a 3 milhões de células CD quatro positivas por poço. Normalmente, células CD4 positivas são a população limitante. Aliquota CD quatro células negativas no número apropriado de poços em uma placa de 48 poços.

Adicionando 300 microlitros a cada um, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus por uma hora. Remova a placa, a incubadora, lave os poços adicionando 500 microlitros de meio fresco e pipeteando suavemente de 12 a 20 vezes usando uma pipeta de transferência e remova todo o líquido. Essa lavagem deixa uma camada de células aderentes apresentadoras de antígeno.

Quando a lavagem estiver pronta, adicione apenas o suficiente para molhar o fundo de cada um, cerca de 100 microlitros. Caso contrário, as células aderentes à A vão secar. Adicione de dois a 3 milhões de células CD, quatro células positivas em cada poço, se necessário.

Adicione mais meios para elevar o volume total em cada poço para um mililitro. Adicione o peptídeo desejado a cada um. Poço. A concentração típica para estimulação é de 10 microgramas por mililitro.

Placar o lugar final em uma incubadora de 37 graus por sete dias. Depois de sete dias. Adicione 50 microlitros de hemo-IL, dois em cada poço em cada dia seguinte.

Monitore o crescimento celular usando um microscópio para alimentar poços que ainda não estejam confluentes, removendo metade do meio, adicionando meio novo e 50 microlitros de IL, dois poços confluentes divididos, suspendendo novamente as células, movendo metade das células para um poço vazio. Adicionando meio fresco e 50 microlitros de células de retorno IL duas à incubadora. As células em expansão estarão prontas para a coloração do teer após 13 a 15 dias de cultura.

Passo quatro, visualizar células T por meio de coloração teer, comprar ou montar teters para corresponder ao peptídeo. Combinações MHC usadas para estimular as células T CD4 positivas. Remova a placa da incubadora.

Cuidadosamente retire metade da mídia de cada um. Transferir uma aliquota de células de cada poço, tipicamente 75 microlitros ou cerca de 50.000 células, para um tubo de poliestireno de cinco mililitros, adicionar um microlitro a cada 50 microlitros de volume total e colocar em incubadora de 37 graus por uma hora. Também é recomendável tingir uma segunda aliquota de cada poço com um teer descompatal como células de controle negativo com anticorpos anti-CD três, anti-CD quatro e anti-CD 25.

Marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos podem ser utilizados. No entanto, não use anticorpos marcados com PE, pois esse canal deve ser reservado para os teems neste momento. Além disso, rotule qualquer controle de cor ou isotipo com células extras.

Incube células marcadas por anticorpos por 15 a 30 minutos a quatro graus. Lave cada tubo com 0,5 a um mililitro de tampão em funcionamento e centrifuge a 230 vezes G por 10 minutos. Decante cuidadosamente o líquido dos tubos de fax, calibre o citômetro de fluxo usando esferas de referência, tubos de controle de cor única, controles de isotipo, etc.

Analise cada tubo usando o citômetro de fluxo. As células tetra positivas devem ser uma população distinta entre as células T CD quatro positivas expandidas. Células tetrapositivas geralmente são CD25 positivas e frequentemente CD 4 altas.