Name: Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a infectar células HeLa com vírus vaccinia e extrair RNA em múltiplos pontos temporais para análise de expressão gênica viral e do hospedeiro. Este protocolo estabelece a base para estudos de interações vírus-hospedeiro.

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Parte 1: Configurando a infecção <ol><li> Cultivar células HeLa em frascos e espere até que as células são aproximadamente 80% confluentes. </li><li> Prepare o suficiente meio de crescimento viral para o experimento: DMEM regular com 2% FBS e sem antibióticos acrescentou. </li><li> A infecção pode ser realizada com o estoque bruto de um vírus vaccinia com um título conhecido, ou sacarose purificada vírus com um título conhecido, se você estiver preocupado com a expressão do gene host. </li><li> Se você estiver usando vírus sacarose purificada, prossiga diretamente para a parte 2. </li><li> Se você estiver usando uma ação do vírus vaccinia bruto, pouco antes da infecção, sonicate uma alíquota do vírus em um sonicador copo com um banho de gelo e principalmente um pouco de água. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sonicado em torno de 30W por 20 segundos. </li><li> Vortex do tubo e repetir a sonicação 3 vezes, acrescentando mais gelo se necessário para manter o copo cheio de gelo e refrigerada. </li><li> Vortex entre cada passo sonicação. </li><li> Proceda a parte 2. </li></ul></li><li> Alternativamente, se você não possuir um sonicador copo, misture um volume igual de o estoque de vírus bruto e tripsina 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Vortex vigorosamente. </li><li> Incubar o vírus mix de ações / tripsina a 37 ° C banho-maria por 30 minutos. </li><li> Vortex em intervalos de 5-10 minutos. </li><li> Proceda a parte 2. </li></ul></li></ol> Parte 2: células Infectando <ol><li> Calcular a quantidade de partículas virais necessários para infectar a monocamada na multiplicidade desejado de infecção (MOI). Normalmente, uma alta MOI (entre 5 e 10) é usado para timecourses infecção. </li><li> Adicione a quantidade desejada de vírus sacarose purificada ou vírus bruto tripsinizados a 37 ° C viral meios de crescimento e misture bem. Você deve usar a mídia apenas o suficiente para cobrir o fundo do balão. Por exemplo, 10 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. </li><li> Remova a mídia a partir de células e enxágüe com temperatura ambiente PBS. </li><li> Adicione o vírus / media o crescimento viral em cada balão. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agite, placas de inclinação e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO2 de 5% por 1 hora. </li><li> Placas de inclinação e agite a cada 15 minutos para espalhar vírus de maneira uniforme e manter as células úmido. </li><li> Para um ponto no tempo 0hr/Mock, adicione o meio de crescimento viral só, sem vírus acrescentou. </li></ul></li><li> Após a incubação de 1 hora, retire a mídia que contém o vírus, e lavar três vezes com PBS em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a quantidade máxima de meio de crescimento viral em cada balão. Por exemplo, 30 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. Começar a contar isso como o ponto de tempo 0 hr. </li></ol> Parte 3: células colheita <ol><li> Verifique as células sob um microscópio e observe qualquer efeito citopático (CPE). </li><li> Remova a mídia e lavar as células com 30 mL de PBS à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 15 mL de tripsina para as células e incubar por 2-5min a 37 ° C. </li><li> De seleção em microscópio para desprendimento de células e toque em frasco suavemente para deslocar as células. </li><li> Transferência de células com uma pipeta estéril sorológica em um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Lavar o balão com um volume igual de meio de crescimento celular, e adicione a mídia para as células tripsinizados no tubo cônico. </li><li> Centrifugar as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova a tripsina / media a partir do pellet celular. </li><li> Ressuspender o pellet celular em qualquer reagente Trizol ou o tampão de lise do seu kit desejado isolamento do RNA. </li><li> Se você estiver usando TRIzol, dividir a amostra em 1 mL em alíquotas de 1,5 ml tubos Eppendorf rotulado e congelar a -80 ° C. </li><li> Repita o procedimento para todos os momentos, a colheita um frasco por ponto de tempo. </li></ol> Parte 4: extração de RNA de amostras em TRIzol <ol><li> Neste ponto, as amostras devem ser ressuspendidos em reagente Trizol e pronto para ser processado. </li><li> Adicionar 200μL do reagente Separação de Fase BCP para cada 1 mL de TRIzol em cada tubo. Você pode precisar de transferir a amostra para um tubo maior se você estiver começando para fora com uma grande quantidade de TRIzol. </li><li> Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. Você deve estar se recuperando aproximadamente 600μL para cada 1mL de TRIzol você começou com. </li><li> Fazer uma segunda extração fenol / clorofórmio, desta vez utilizando 500μL de clorofórmio por 1 ml TRIzol, em vez de BCP. </li><li> Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. </li><li> Adicionar 20μg de acrilamida linear para cada amostra. A acrilamida linear age como uma transportadora e ajuda a precipitar o RNA. </li><li> Adicionar 500 &amp; micro; L de isopropanol por 1 ml de TRIzol você começou com a cada amostra e misture bem. </li><li> Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Centrifugar em microcentrífuga à velocidade máxima, por 10-15 minutos. </li><li> O pellet de RNA será visível na parte inferior do tubo. Com muito cuidado, remover o sobrenadante do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Não perturbar o pellet. </li><li> Lave o pellet com 1 mL de etanol 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Adicionar 1 mL de etanol 70% para o sedimento. </li><li> Centrifugar a velocidade máxima 14.000 g por 5-7 minutos. </li><li> Com muito cuidado, remover o etanol do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Verifique se o pellet é visível na parte inferior do tubo. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li></ul></li><li> Repita o passo de lavagem. Após o sobrenadante é descartado, marcar onde pellet é no tubo. </li><li> Ar seco pellet por não mais que 5 minutos. Não overdry, ou o RNA será difícil reconstituir! </li><li> Se você deseja seguir o tratamento DNase opcional para remover qualquer DNA restante da amostra, ressuspender o sedimento em 17μL de água livre de nuclease. Caso contrário, ressuspender o sedimento em 20μL de água livre de nuclease e continuar para o passo 22. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Usando o Qiagen RNase set DNase, adicione 2μL buffer RDD e 1μL reconstituído RNase DNase I da RNA ressuspendido. Misture delicadamente. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Adicione 2μL de 2,5 mM EDTA e incubar a 65 ° C por 5 minutos para inativar a DNase. Não exceda o tempo de inativação ou temperatura as vezes mais longos / temperaturas mais elevadas podem causar a degradação do RNA. </li><li> Verificar a concentração de RNA por espectrofotometria. </li><li> Conservar a amostra de RNA a -80 ° C. </li><li> (QC Opcional) Verifique a qualidade do RNA usando um Bioanalyzer Agilent, ou executando a amostra em um gel desnaturante e verificar as leituras OD. (260nm e 260/280 ratio) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Passos crítica Parte 1 &amp; 2 Existem vários passos críticos para a criação de uma infecção vaccinia síncrona, a sonicação ser o primeiro cuidado (ou trypzinizing) do vírus, a fim de desagregar as partículas do vírus. Vaccinia é altamente propensos a agregar, e ruptura de partículas do vírus é importante para assegurar mesmo a infecção de células. A fim de alcançar uma infecção síncrono, uma alta MOI (superior a 2) deve ser usado para garantir que cada célula é infec...

<table><tbody><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Reagentes semelhantes, como o TriPure da Roche, também funcionam.</td></tr><tr><td>Reagente de Separação de Fases BCP</td><td>Reagente</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de DNase Isento de RNase</td><td>Reagente</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>O tratamento com DNase é uma etapa opcional.</td></tr></tbody></table>

infecção pelo vírus vaccinia e análise temporal da expressão gênica de vírus: parte 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 1 de 3.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

A família Poxviridae consiste em vírus grandes que contêm DNA de fita dupla e que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros de ...

Infecções em curso temporal de células HeLa utilizando o vírus vaccinia começam com o preparo das infecções virais, infecção das células e, em seguida, colheita do RNA das células infectadas em diversos pontos temporais após a infecção. Esse RNA pode posteriormente ser amplificado para hibridização em microarranjos, visando a análise da expressão gênica. Olá, sou Judy Ann do laboratório de Kate Irvins no Whitehead Institute for Biomedical Research.Hoje vamos mostrar um procedimento para infecção em curso temporal com o vírus vaccinia em células de mamíferos e a subsequente extração de RNA das células infectadas em diferentes pontos de tempo após a infecção. Esta técnica é uma etapa inicial de um protocolo maior destinado a extrair e amplificar RNA, a fim de avaliar a expressão gênica do vírus durante a infecção, o que será concluído em dois outros vídeos do JoVE. Então, vamos começar: para preparar a infecção, cultive células HeLa em frascos e aguarde até que as células estejam aproximadamente 80% confluentes.Em seguida, certifique-se de preparar meio de crescimento viral suficiente para o experimento. Utilizando DMEM comum com 2% de FBS e sem antibióticos adicionados, a infecção p

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Biologia

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.

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Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 3 descreve o processo de rotulagem fluorescente do RNA amplificado a partir do host e as amostras virais por acoplamento alílico amino de corantes. Parte 3 de 3.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

Novos fatores hospedeiro envolvidos na infecção viral podem ser identificados através de células baseado em perda de todo o genoma da função de triagem RNAi.

RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Oncolíticos vírus são promissores para o câncer de terapêutica. A capacidade de determinar a infectability de amostras de tecido vivo obtidos de pacientes antes do tratamento é uma vantagem exclusiva dessa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve como processo de tecidos...

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