Name: Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a infectar células HeLa com vírus vaccinia e extrair RNA em múltiplos pontos temporais para análise de expressão gênica viral e do hospedeiro. Este protocolo estabelece a base para estudos de interações vírus-hospedeiro.

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Parte 1: Configurando a infecção <ol><li> Cultivar células HeLa em frascos e espere até que as células são aproximadamente 80% confluentes. </li><li> Prepare o suficiente meio de crescimento viral para o experimento: DMEM regular com 2% FBS e sem antibióticos acrescentou. </li><li> A infecção pode ser realizada com o estoque bruto de um vírus vaccinia com um título conhecido, ou sacarose purificada vírus com um título conhecido, se você estiver preocupado com a expressão do gene host. </li><li> Se você estiver usando vírus sacarose purificada, prossiga diretamente para a parte 2. </li><li> Se você estiver usando uma ação do vírus vaccinia bruto, pouco antes da infecção, sonicate uma alíquota do vírus em um sonicador copo com um banho de gelo e principalmente um pouco de água. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Sonicado em torno de 30W por 20 segundos. </li><li> Vortex do tubo e repetir a sonicação 3 vezes, acrescentando mais gelo se necessário para manter o copo cheio de gelo e refrigerada. </li><li> Vortex entre cada passo sonicação. </li><li> Proceda a parte 2. </li></ul></li><li> Alternativamente, se você não possuir um sonicador copo, misture um volume igual de o estoque de vírus bruto e tripsina 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Vortex vigorosamente. </li><li> Incubar o vírus mix de ações / tripsina a 37 ° C banho-maria por 30 minutos. </li><li> Vortex em intervalos de 5-10 minutos. </li><li> Proceda a parte 2. </li></ul></li></ol> Parte 2: células Infectando <ol><li> Calcular a quantidade de partículas virais necessários para infectar a monocamada na multiplicidade desejado de infecção (MOI). Normalmente, uma alta MOI (entre 5 e 10) é usado para timecourses infecção. </li><li> Adicione a quantidade desejada de vírus sacarose purificada ou vírus bruto tripsinizados a 37 ° C viral meios de crescimento e misture bem. Você deve usar a mídia apenas o suficiente para cobrir o fundo do balão. Por exemplo, 10 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. </li><li> Remova a mídia a partir de células e enxágüe com temperatura ambiente PBS. </li><li> Adicione o vírus / media o crescimento viral em cada balão. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agite, placas de inclinação e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO2 de 5% por 1 hora. </li><li> Placas de inclinação e agite a cada 15 minutos para espalhar vírus de maneira uniforme e manter as células úmido. </li><li> Para um ponto no tempo 0hr/Mock, adicione o meio de crescimento viral só, sem vírus acrescentou. </li></ul></li><li> Após a incubação de 1 hora, retire a mídia que contém o vírus, e lavar três vezes com PBS em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar a quantidade máxima de meio de crescimento viral em cada balão. Por exemplo, 30 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. Começar a contar isso como o ponto de tempo 0 hr. </li></ol> Parte 3: células colheita <ol><li> Verifique as células sob um microscópio e observe qualquer efeito citopático (CPE). </li><li> Remova a mídia e lavar as células com 30 mL de PBS à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 15 mL de tripsina para as células e incubar por 2-5min a 37 ° C. </li><li> De seleção em microscópio para desprendimento de células e toque em frasco suavemente para deslocar as células. </li><li> Transferência de células com uma pipeta estéril sorológica em um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Lavar o balão com um volume igual de meio de crescimento celular, e adicione a mídia para as células tripsinizados no tubo cônico. </li><li> Centrifugar as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova a tripsina / media a partir do pellet celular. </li><li> Ressuspender o pellet celular em qualquer reagente Trizol ou o tampão de lise do seu kit desejado isolamento do RNA. </li><li> Se você estiver usando TRIzol, dividir a amostra em 1 mL em alíquotas de 1,5 ml tubos Eppendorf rotulado e congelar a -80 ° C. </li><li> Repita o procedimento para todos os momentos, a colheita um frasco por ponto de tempo. </li></ol> Parte 4: extração de RNA de amostras em TRIzol <ol><li> Neste ponto, as amostras devem ser ressuspendidos em reagente Trizol e pronto para ser processado. </li><li> Adicionar 200μL do reagente Separação de Fase BCP para cada 1 mL de TRIzol em cada tubo. Você pode precisar de transferir a amostra para um tubo maior se você estiver começando para fora com uma grande quantidade de TRIzol. </li><li> Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. Você deve estar se recuperando aproximadamente 600μL para cada 1mL de TRIzol você começou com. </li><li> Fazer uma segunda extração fenol / clorofórmio, desta vez utilizando 500μL de clorofórmio por 1 ml TRIzol, em vez de BCP. </li><li> Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. </li><li> Adicionar 20μg de acrilamida linear para cada amostra. A acrilamida linear age como uma transportadora e ajuda a precipitar o RNA. </li><li> Adicionar 500 &amp; micro; L de isopropanol por 1 ml de TRIzol você começou com a cada amostra e misture bem. </li><li> Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Centrifugar em microcentrífuga à velocidade máxima, por 10-15 minutos. </li><li> O pellet de RNA será visível na parte inferior do tubo. Com muito cuidado, remover o sobrenadante do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Não perturbar o pellet. </li><li> Lave o pellet com 1 mL de etanol 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Adicionar 1 mL de etanol 70% para o sedimento. </li><li> Centrifugar a velocidade máxima 14.000 g por 5-7 minutos. </li><li> Com muito cuidado, remover o etanol do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Verifique se o pellet é visível na parte inferior do tubo. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li></ul></li><li> Repita o passo de lavagem. Após o sobrenadante é descartado, marcar onde pellet é no tubo. </li><li> Ar seco pellet por não mais que 5 minutos. Não overdry, ou o RNA será difícil reconstituir! </li><li> Se você deseja seguir o tratamento DNase opcional para remover qualquer DNA restante da amostra, ressuspender o sedimento em 17μL de água livre de nuclease. Caso contrário, ressuspender o sedimento em 20μL de água livre de nuclease e continuar para o passo 22. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Usando o Qiagen RNase set DNase, adicione 2μL buffer RDD e 1μL reconstituído RNase DNase I da RNA ressuspendido. Misture delicadamente. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Incubar a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> (Tratamento DNase Opcional) Adicione 2μL de 2,5 mM EDTA e incubar a 65 ° C por 5 minutos para inativar a DNase. Não exceda o tempo de inativação ou temperatura as vezes mais longos / temperaturas mais elevadas podem causar a degradação do RNA. </li><li> Verificar a concentração de RNA por espectrofotometria. </li><li> Conservar a amostra de RNA a -80 ° C. </li><li> (QC Opcional) Verifique a qualidade do RNA usando um Bioanalyzer Agilent, ou executando a amostra em um gel desnaturante e verificar as leituras OD. (260nm e 260/280 ratio) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
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<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Passos crítica Parte 1 &amp; 2 Existem vários passos críticos para a criação de uma infecção vaccinia síncrona, a sonicação ser o primeiro cuidado (ou trypzinizing) do vírus, a fim de desagregar as partículas do vírus. Vaccinia é altamente propensos a agregar, e ruptura de partículas do vírus é importante para assegurar mesmo a infecção de células. A fim de alcançar uma infecção síncrono, uma alta MOI (superior a 2) deve ser usado para garantir que cada célula é infec...

<table><tbody><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Reagentes semelhantes, como o TriPure da Roche, também funcionam.</td></tr><tr><td>Reagente de Separação de Fases BCP</td><td>Reagente</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de DNase Isento de RNase</td><td>Reagente</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>O tratamento com DNase é uma etapa opcional.</td></tr></tbody></table>

infecção pelo vírus vaccinia e análise temporal da expressão gênica de vírus: parte 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 1 de 3.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

A família Poxviridae consiste em vírus grandes que contêm DNA de fita dupla e que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros de ...

Infecções em curso temporal de células HeLa utilizando o vírus vaccinia começam com o preparo das infecções virais, infecção das células e, em seguida, colheita do RNA das células infectadas em diversos pontos temporais após a infecção. Esse RNA pode posteriormente ser amplificado para hibridização em microarranjos, visando a análise da expressão gênica. Olá, sou Judy Ann do laboratório de Kate Irvins no Whitehead Institute for Biomedical Research.Hoje vamos mostrar um procedimento para infecção em curso temporal com o vírus vaccinia em células de mamíferos e a subsequente extração de RNA das células infectadas em diferentes pontos de tempo após a infecção. Esta técnica é uma etapa inicial de um protocolo maior destinado a extrair e amplificar RNA, a fim de avaliar a expressão gênica do vírus durante a infecção, o que será concluído em dois outros vídeos do JoVE. Então, vamos começar: para preparar a infecção, cultive células HeLa em frascos e aguarde até que as células estejam aproximadamente 80% confluentes.Em seguida, certifique-se de preparar meio de crescimento viral suficiente para o experimento. Utilizando DMEM comum com 2% de FBS e sem antibióticos adicionados, a infecção pode ser realizada com estoque recrutado de vírus vaccinia com título conhecido ou com vírus purificado em sacarose com título conhecido. Se você estiver preocupado com a expressão de genes do hospedeiro, e se estiver utilizando vírus purificado em sacarose, pule para a próxima sessão.Se você estiver utilizando um vírus vaccínia bruto, sonique e alíquote o vírus imediatamente antes da infecção, utilizando uma cuba de sonicação com um banho contendo principalmente gelo e um pouco de água, sonique por aproximadamente 20 segundos a 30 W. Vortexe o tubo e repita a sonicação três vezes, adicionando mais gelo conforme necessário para manter a cuba cheia de gelo e resfriada; certifique-se de fazer vortex entre cada etapa de sonicação. Se você não possuir uma cuba de sonicação, misture um volume igual do estoque de vírus bruto com 25 miligramas por mililitro.Agite vigorosamente com vórtex, incube o estoque viral e misture em banho-maria a 37 graus Celsius por 30 minutos. Vortex a cada cinco a 10 minutos para infectar as células. Primeiro, calcule a quantidade de partículas virais necessárias para infectar a monocamada na multiplicidade de infecção desejada.Ou MOI. Normalmente, utiliza-se um MOI alto entre cinco e 10 para cursos temporais de infecção. Em seguida, adicione a quantidade desejada de vírus purificado em sacarose ou vírus bruto de trips ao meio de crescimento viral pré-aquecido a 37 graus Celsius e misture bem.Deve-se usar quantidade suficiente de meio para cobrir apenas o fundo do frasco. 10 mililitros de meio seriam suficientes para um frasco T 1 75. Remova o meio das células e lave com PBS à temperatura ambiente.Adicione o vírus ou o meio de crescimento viral a cada frasco para um ponto de tempo simulado de zero hora. Adicione apenas o meio de crescimento viral, sem o vírus, gire suavemente e incline as placas, incubadas a 37 graus Celsius em um incubador com 5% de CO2 por uma hora. Certifique-se de inclinar e girar as placas a cada 15 minutos para distribuir o vírus uniformemente e manter as células úmidas.Após a incubação, remova o meio contendo o vírus e lave três vezes com PBS à temperatura ambiente. Adicione a quantidade máxima de meio de crescimento viral a cada frasco.Por exemplo, 30 mililitros de meio para um frasco T 175. Você pode começar a contagem desse ponto como seu ponto de tempo zero no momento desejado após a infecção. Verifique as células ao microscópio e anote quaisquer efeitos citopáticos ou ECP.Remova o meio e lave as células com 30 mililitros de PBS à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 15 mililitros de tripsina às células e incube por dois a cinco minutos. A 37 graus Celsius, verifique ao microscópio a dessondagem celular e bata suavemente no frasco para desprender as células.Transfira as células com uma pipeta serológica estéril para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o frasco com um volume igual de meio de crescimento celular e adicione o meio às células tratadas com tripsina no tubo cônico. Centrifugue as células a 500 Gs por cinco minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, remova o meio de triina do pellet celular, ressuspenda o pellet celular e adicione o reagente triol ou o tampão de lise do seu kit de isolamento de RNA desejado. Se estiver usando triol, divida a amostra em alíquotas de um mililitro em tubos eppendorf de 1,5 mililitro identificados e congele a menos 80 graus Celsius. Repita para todos os pontos de tempo.Coletar um frasco por ponto temporal. Neste momento, sua amostra deve estar suspensa novamente e pronta para ser processada com o reagente triol. Adicione 200 microlitros do reagente de separação de fases BCP.Para cada mililitro de triol em cada tubo, o BCP ou um bromo três cloro propano é usado no lugar do fenol. Para reduzir a contaminação por DNA genômico, pode ser necessário transferir a amostra para um tubo maior. Se você estiver iniciando com uma grande quantidade de triol, vortexe ou agite vigorosamente e incube em temperatura ambiente por dois a três minutos; após a incubação, centrifugue a amostra a 12.000 ×g por 15 minutos.Uma fase aquosa deve ser visível como uma camada clara na parte superior. Transfira a fase aquosa para um tubo novo. Você deve recuperar aproximadamente 600 microlitros para cada mililitro de triazol com que começou.Realize uma segunda extração com fenol-clorofórmio. Desta vez, utilize 500 microlitros de clorofórmio por um mililitro de triazol, em vez de BCP. A segunda extração com clorofórmio é utilizada para remover quaisquer vestígios de solvente orgânico da extração, pois até mesmo quantidades traço podem inibir etapas subsequentes de amplificação.Vortex ou agite vigorosamente, depois incube em temperatura ambiente por dois a três minutos. Centrifugue a amostra a 12.000 ×g por 15 minutos após a centrifugação. Transfira a fase aquosa para um tubo novo.Lembre-se, a fase aquosa é a camada clara na parte superior. Em seguida, adicione 20 microgramas de acrilamida linear a cada amostra. A acrilamida linear atua como carreadora e ajuda na precipitação do RNA.Adicione 500 microlitros de isopropanol por um mililitro de triol com o qual você iniciou a cada amostra e misture bem. Incube as amostras em temperatura ambiente por 10 minutos; após a incubação, centrifugue em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 10 a 15 minutos. O pellet de RNA será visível no fundo do tubo após a centrifugação.Com muita cautela, remova o sobrenatante do tubo usando um aspirador a vácuo ou manualmente com uma pipeta. Não perturbe o pellet. Lave o pellet com um mililitro de etanol 70% e centrifugue em velocidade máxima por cinco a sete minutos.Com muita cautela, remova o etanol do tubo usando um aspirador a vácuo ou manualmente com uma pipeta. Descarte o sobrenadante.Verifique se o pellet é visível na parte inferior do tubo. Repita esta etapa de lavagem após descartar o sobrenadante. Marque a posição do pellet no tubo.Seque o pellet ao ar por não mais de cinco minutos. Não seque em excesso, pois o RNA será difícil de reconstituir. Em seguida, se for planejado o tratamento com DNAse, suspenda o pellet em 17 microlitros de água livre de nucleases.Se o tratamento com D'S não for planejado, ressuspenda em 20 microlitros. Para o tratamento com D'S, utilize o conjunto KaiGen DNA livre de RNA. Adicione dois microlitros do tampão RDD e um microlitro do RNAs livre reconstituído.Os DNAs foram adicionados à suspensão de RNA e misturados suavemente, seguidos de incubação a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione dois microlitros de EDTA 2,5 milimolar e incube a 65 graus Celsius por cinco minutos. Para inativar o DNA, não exceda o tempo ou a temperatura de inativação, pois tempos mais longos e temperaturas mais altas podem causar degradação do RNA.Agora você concluiu o tratamento do DNA. Verifique a concentração de RNA por espectrofotômetro. Traços de fenol ou BCP podem ser detectados como um pico em 270 nanômetros além do pico padrão em 260 nanômetros.Ao medir a absorbância do RNA total após a extração, se tal contaminação aparecer, reextraia o RNA utilizando um método de extração de RNA com filtro ou coluna antes de prosseguir com a amplificação. Você pode armazenar a amostra de RNA a menos 80 graus Celsius. Se desejar, pode verificar a qualidade do RNA utilizando um bioanalisador da Agilent ou executando a amostra em um gel desnaturante e verificando as leituras de OD no bioanalisador.A boa qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA ou RIN. O RIN baseia-se em um sistema numérico de um a 10, sendo um o perfil mais degradado e 10 o mais intacto. Acabamos de mostrar como realizar uma infecção em curso temporal com o vírus vaccinia e como extrair o RNA de células infectadas em vários pontos de tempo após a infecção.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que existem várias etapas críticas para estabelecer uma infecção sincronizada por vaccínia. Primeiramente, a sonicação cuidadosa ou a tripsinização do vírus. É fundamental desagregar as partículas virais, já que a vaccínia tem grande tendência a se aglomerar, o que impediria uma infecção uniforme das células.Em segundo lugar, para se obter uma infecção assíncrona, deve-se utilizar uma MOI superior a dois, garantindo que cada célula seja infectada. Uma mistura de células infectadas e não infectadas resultará em múltiplas rodadas de infecção, misturas heterogêneas de pontos temporais e respostas transcricionais virais e hospedeiras assíncronas. Em terceiro lugar, a infecção deve ser realizada com volumes mínimos de meio, permitindo a absorção máxima do vírus pelas células.Além disso, agitar regularmente o frasco ou as placas de cultura a cada 10 minutos permite a distribuição do vírus pelo frasco e garante que as células não sequem. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.Certifique-se de assistir aos outros vídeos desta série, nos quais mostramos o procedimento para amplificação linear de amostras de RNA e a preparação e purificação de RNA marcado com fluorescência.

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Biologia

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Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Aprenda a infectar células HeLa com vírus vaccinia e extrair RNA em múltiplos pontos temporais para análise de expressão gênica viral e do hospedeiro. Este protocolo estabelece a base para estudos de interações vírus-hospedeiro.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

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