Name: Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a sintetizar cDNA a partir de RNA de células HeLa infectadas com vírus Vaccinia. Este protocolo detalha transcrição reversa e amplificação para análise de expressão gênica viral e do hospedeiro.

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Parte 1: síntese de cDNA a partir de RNA <ol><li> Antes de usar o Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, adicionar o volume recomendado de etanol a 100% para os buffers de lavagem. </li><li> PCR em tubo de reação, adicione entre 100ng de 5μg de RNA total e 1μl de T7 oligo primer (dT). Trazer o volume até 12μl com água livre de nuclease. </li><li> Incubar as amostras a 70 ° C por 10 min em um termociclador. </li><li> Remover amostras de RNA a partir de 70 ° C e centrifugar brevemente. Colocar no gelo. </li><li> Preparar o 1 º Strand master mix Síntese e manter a temperatura ambiente (com excesso de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 1) </li><li> Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente. </li><li> Transferência 8μl do Mix Master para cada amostra de RNA. Mix pipetando cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 42 ° C por 2 horas no termociclador. </li><li> Brevemente centrifugar amostras e colocar no gelo. Prosseguir imediatamente para a próxima etapa de síntese de dsDNA. </li><li> Prepare o 2 º Strand master mix de síntese sobre gelo (com sobrecarga de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 2) </li><li> Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente. </li><li> Transferência Pipete 80 para cada amostra e misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 16 ° C por 2 horas no termociclador. </li><li> Após a incubação de 2 horas, prosseguir com a etapa de clean-up cDNA ou congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol> Parte 2: Double-stranded cDNA clean-up <ol><li> Remover o Pure cDNA do frigorífico e deixe-o atingir a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Agitar o frasco plenamente ressuspender o cDNA magnética contas obrigatórias antes do uso. </li><li> Alíquota de água livre de nuclease em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos durante a incubação prévia 2hr. </li><li> Adicionar 180μl de Pure cDNA de cada amostra, e misturar completamente por pipetagem cima e para baixo. Transferir as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Continue a misturar as amostras agitando a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixe placa no stand por aproximadamente 6 minutos, ou até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Adicionar 150μl tampão de lavagem cDNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não se dispersa nesta etapa, devido à baixa tensão superficial da solução de lavagem. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Repita a lavagem de cada vez 2 º com tampão de lavagem 150μl cDNA. </li><li> Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 2 minutos no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry! </li><li> Eluir o cDNA dos grânulos adicionando 18μl da água livre de nuclease pré-aquecido a cada amostra. </li><li> Agitar vigorosamente a placa por 3 minutos no agitador orbital, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer. </li><li> Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. </li><li> Transferir cuidadosamente o cDNA eluída (~ 16μl) para uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR). </li><li> Prosseguir diretamente para a etapa seguinte, ou congelar o cDNA a -20 ° C. </li></ol> Parte 3: transcrição in vitro (IVT) <ol><li> Prepare a mistura mestre IVT à temperatura ambiente. (Tabela 3) </li><li> Pipeta suavemente o Mix Master ou filme para misturar e centrifugar brevemente. </li><li> Adicionar 24μl de cada amostra, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 37 ° C por 14 horas em um termociclador, então segure a 4 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa. </li></ol> Parte 4: ARNA clean-up após IVT <ol><li> Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso. </li><li> Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente (Tabela 4) Isso pode ser feito antes do tempo -. A mistura preparada ligação pode ser armazenado em temperatura ambiente por até uma semana. </li><li> Misture bem em vórtice. </li><li> Alíquota do tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos. </li><li> Adicionar 70μl da mistura obrigatória ARNApara cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Repita a lavagem de cada vez 2 º com 100μl de solução de lavagem ARNA. </li><li> Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras! </li><li> Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 40μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra. </li><li> Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer. </li><li> Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo-up amino-alil ARNA incorporadas. </li><li> Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR). </li><li> (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA das amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop. </li><li> Imediatamente continue para a próxima etapa, ou armazenar a ARNA a -80 ° C. </li></ol> Tabela 1: 1 Strand cDNA º Mix Master Síntese <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Montante para uma reação </td></tr><tr><td> Tampão Strand 10X Primeiro </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Inibidor ribonuclease </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Script da Matriz </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 2: 2 ª Strand cDNA Mix Master Síntese <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Montante para uma reação </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 63 mL </td></tr><tr><td> Tampão 10X Segundo Strand </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> DNA Polimerase </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 3: IVT Master Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Montante para uma reação </td></tr><tr><td> aaUTP solução (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> T7 UTP solução (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> T7 Tampão de reacção 10X </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> T7 Mix Enzyme </td><td> 4 mL </td></tr></tbody></table> Tabela 4: ARNA Mix Binding <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Montante para uma reação </td></tr><tr><td> Beads RNA Binding * </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Bead * Solução ressuspensão </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Isopropanol 100% ** </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> ARNA Concentrado de tampão de ligação </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> * Mix as contas RNA ligação com a solução de ressuspensão primeira conta. ** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Passos crítica A segunda etapa de amplificação não é aconselhável como preconceitos em dados de matriz foram observados. Misturando com cuidado a cada passo enzimático (1 ª e 2 ª vertente de síntese de cDNA, FPI) é fundamental para a obtenção de rendimentos de amplificação boa, como é de incubação de cada etapa enzimática na temperatura adequada. A cycler PCR com tampa aquecida ajustável é o preferido - desvios ainda tão pequeno quanto 2-3 graus durante IVT em um forno de...

<table><tbody><tr><td>Kit de amplificação de aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Reagente</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Para 20 reações</td></tr><tr><td>Kit de amplificação de aRNA Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Reagente</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Para 100 reações, em formato de placa de 96 poços</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Outro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Ou espectrofotômetro equivalente</td></tr></tbody></table>

infecção pelo vírus vaccinia e análise temporal da expressão gênica de vírus: parte 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.

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A família Poxviridae consiste em vírus grandes com DNA de fita dupla que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros de ...

Olá, sou Judy Yen do laboratório de Kate Rubins no Whitehead Institute for Biomedical Research. Após infectar células HeLa com o vírus vaccinia e isolar o RNA total, conforme mostrado em um protocolo em vídeo anterior do JoVE, o RNA viral pode ser isolado e amplificado utilizando transcrição reversa e transcrição in vitro; o RNA amplificado será usado posteriormente na análise por microarranjo da expressão gênica viral e do hospedeiro. Então, vamos começar.Para iniciar esta síntese de cDNA a partir do RNA, adicione o volume recomendado de etanol a 100% aos tampões de lavagem antes de usar o kit ambient amino allele message AMP dois em um tubo de reação de PCR. Adicione entre 100 nanogramas e cinco microgramas de RNA total e um microlitro do iniciador oligo T sete. Complete o volume até 12 microlitros com água livre de nucleases. Incube as amostras a 70 graus Celsius por 10 minutos em um termociclador.Em seguida, remova as amostras de RNA do centrifugador a 70 graus Celsius. Imediatamente após a centrifugação, coloque as amostras em gelo. Prepare a mistura mestra para a síntese da primeira fita com uma sobra de volume de 10% para compensar erros de pipetagem.Deixe-o em temperatura a

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