Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

Olá, sou Judy Y, do laboratório de Kate Rubins no Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica. Aqui, demonstramos como rotular as amostras de RNA antisense coletadas de células hela infectadas pelo vírus vaccinia e vírus por amino todo o acoplamento LEO de corantes. Em seguida, mostramos como limpar o RNA A marcado e prepará-lo para ser hibridizado para análise de microarray da expressão gênica.

Os vídeos anteriores de Joe destacam como realizar as etapas de isolamento total de RNA de infecções virais e amplificação e amplificação de RNA. Então vamos começar. Para iniciar uma marcação de RNA, primeiro adicione um micrograma das amostras de RNA A em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Seque as amostras a vácuo em fogo baixo ou nenhum até que estejam completamente secas. Tampe cada tubo assim que estiver seco. É importante não secar demais as amostras depois de secas.

Adicione nove microlitros de tampão de acoplamento a cada tubo e ressuspenda o RNA A por um vórtice suavemente por um minuto, centrifugue brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo e, em seguida, deixe a amostra descansar no gelo. Em seguida, adicione 22 microlitros de DMSO de alta qualidade a cada tubo de SCI três ou S cinco corante um tubo de corante é suficiente para duas amostras. O S SI três matrizes para rotular suas amostras de referência e o corante SCI cinco é para rotular suas amostras de teste.

Vortex os corantes para misturar bem. Lembre-se de manter os corantes no escuro até a hora de usar. Não prepare o corante antes de uma hora antes de usar e certifique-se de que nenhuma água entre na mistura de DMSO em nenhum momento.

Agora, a 11 microlitros da mistura de corante D-M-S-O-S preparada para cada amostra bem misturada por vórtice. Incube suavemente por 30 a 45 minutos em temperatura ambiente. Cubra as amostras com papel alumínio ou guarde-as em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.

Após a incubação a 4,5 microlitros de hidroxilamina para cada amostra para extinguir a reação bem misturada por vórtice. Incube suavemente por mais 15 minutos de temperatura da vassoura. Cubra as amostras com papel alumínio ou guarde-as em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.

Para limpar o rótulo, eles vórtice de RNA, os grânulos de ligação de RNA. Resumidamente, para obter uma mistura uniforme antes de usar, prepare a mistura de ligação de RNA A à temperatura ambiente. Misture bem a mistura de ligação por alíquota de vórtice do tampão de eluição de RNA A em um tubo de 1,5 mililitro e incubado de 50 a 60 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.

Adicione 70 microlitros da mistura de ligação de RNA A a cada amostra e misture bem por tubo somando para cima e para baixo três a quatro vezes após a mistura, transfira as amostras da placa de PCR para uma placa inferior redonda de 96 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de cem por cento de isopropanol a cada amostra e misture bem pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Agite suavemente a placa em um agitador orbital por pelo menos dois minutos.

Para misturar completamente as amostras. Mova a placa para um suporte magnético. Para capturar as contas magnéticas.

Deixe o prato no suporte até que a mistura fique transparente e as contas de ligação tenham sido peletizadas. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar as esferas magnéticas. Em alternativa, retire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e elimine o sobrenadante.

O sobrenadante deve ser rosa brilhante ou azul brilhante neste ponto devido às moléculas de corante não incorporadas. Uma vez descartado o sobrenadante, remova a placa do suporte magnético. Agora adicione cem microlitros, uma solução de lavagem de RNA em cada poço e agite a placa por um minuto no agitador orbital em velocidade moderada.

As contas podem não se dispersar totalmente nesta etapa, retorne a placa para um suporte magnético. Para capturar as contas magnéticas. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar as esferas magnéticas.

Em alternativa, retire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e elimine o sobrenadante. Remova a placa do suporte magnético. Repita a lavagem uma segunda vez com 100 microlitros, uma solução de lavagem de RNA.

Após a segunda lavagem. Seque as contas agitando a placa durante um minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não seque demais as amostras eluem o RNA A dos grânulos adicionando 20 microlitros pré-aquecidos, tampão de eluição de RNA A.

Para cada amostra, agitar vigorosamente a placa no agitador orbital durante três minutos. Em seguida, verifique se as esferas magnéticas estão totalmente dispersas. Se não, continue tremendo.

Quando as contas magnéticas estiverem totalmente dispersas, mova a placa para um suporte magnético para capturar as contas magnéticas. O sobrenadante contém as amostras de RNA A marcadas limpas e deve ser rosa pálido ou azul pálido. Em seguida, transfira cuidadosamente o RNA aludido para uma nova placa de PCR ou tubos de PCR.

Neste ponto, você pode verificar a concentração de RNA e a quantidade de corante nas amostras medindo 1,5 microlitros em um espectrofotômetro NanoDrop. Usando o módulo de microarray, hibride imediatamente o RNA A marcado em uma plataforma de microarray de sua escolha. Ou, alternativamente, você pode armazenar o RNA A marcado a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para a hibridização.

Esta é uma leitura representativa do espectrofotômetro e um gráfico OD gerado usando o espectrofotômetro NanoDrop para medir a concentração da amostra e a incorporação do corante. Você pode ver os picos de OD em 260 nanômetros para calcular a concentração das amostras, bem como os dois picos em torno de 532 e 635 nanômetros representando os cinco corantes S3 e SCI, respectivamente. Acabamos de mostrar como marcar fluorescentemente amostras de RNA incorporadas com alelos imunológicos amplificados para hibridização de microraios.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de ressuspender o corante no DMSO menos de uma hora antes do acoplamento e garantir que nenhuma água entre na mistura de DMSO do corante, pois ela reagirá com o grupo ativo no corante. Também é importante lembrar de não secar demais o RNA, se necessário. As amostras podem ser secas até um a dois microlitros em vez de completamente secas e, em seguida, ressuspensas bem no tampão de acoplamento durante a reação de acoplamento.

Mantenha as reações no escuro com movimentos ocasionais e gire para baixo, se desejar. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

Não deixe de assistir aos outros vídeos desta série, onde mostramos como realizar uma infecção temporal com o vírus vaccinia e extração de RNA das amostras e o procedimento para amplificação linear de amostras de RNA.