Name: Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a rotulagem de RNA antisense de células HeLa infectadas com vírus Vaccinia usando acoplamento amino alílico de corantes. Este método prepara amostras para análise de microarranjo de expressão gênica.

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Parte 1: ARNA rotulagem: acoplamento alílico amino dos corantes <ol><li> Adicionar 1μg das amostras em tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml. </li><li> Vácuo seco as amostras em fogo baixo ou nenhum até que estejam completamente secos. Cap cada tubo assim que estiver seca - não overdry! </li><li> Adicionar tampão de acoplamento 9μl a cada tubo e ressuspender o ARNA suavemente vórtex por 1 minuto. Centrifugar brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo, e depois deixar a amostra sentar no gelo. </li><li> Adicionar 22μl DMSO qualidade alta a cada tubo de Cy3 ou Cy5 corante. Um tubo de tinta é suficiente para duas amostras. O corante é Cy3 para a rotulagem suas amostras de referência, e os corantes Cy5 é para a rotulagem de amostras de teste. </li><li> Vortex os corantes para misturar bem. Manter os corantes no escuro até que esteja pronto para uso. Não preparar tintura antes de 1 hora antes de usar. Verifique se não há água fica na mistura de corante / DMSO em qualquer ponto. </li><li> Adicionar 11μl do corante DMSO / Cy preparados para cada amostra. Misture bem em vórtice suavemente. </li><li> Incubar durante 30-45 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz. </li><li> Após a incubação, adicionar 4.5μl hydroxlyamine a cada amostra para saciar a reação. Misture bem em vórtice suavemente. </li><li> Incubar por mais 15 minutos em temperatura ambiente. Cobrir as amostras com papel alumínio ou mantê-los em uma gaveta para minimizar a exposição à luz. </li></ol> Parte 2: rotuladas ARNA clean-up <ol><li> Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso. </li><li> Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente. (Tabela 1) </li><li> Misture bem em vórtice. </li><li> Aliquote o tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos. </li><li> Adicionar 70μl da mistura ARNA vinculativo para cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. O sobrenadante deve ser um brilhante rosa ou um azul brilhante neste momento devido à moléculas de corante não incorporado. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Repita a lavagem de cada vez 2 º com 100μl de solução de lavagem ARNA. </li><li> Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras! </li><li> Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 20μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra. </li><li> Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer. </li><li> Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo, amostras ARNA rotulados, e deve ser uma pálida cor de rosa ou um azul pálido. </li><li> Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR). </li><li> (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA e da quantidade de corante nas amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop usando o módulo Microarray. </li><li> Imediatamente hibridizar o ARNA rotulados em uma plataforma de microarray de sua escolha ou, alternativamente, você pode armazenar o ARNA rotulados a -80 ° C até que esteja pronto para a hibridização. </li></ol> Tabela 1 Mix ARNA Binding <table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Montante para uma reação </td></tr><tr><td> Beads RNA Binding * </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Bead * Solução ressuspensão </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> Isopropanol 100% ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Concentrado de tampão de ligação </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * Mix as contas de ligação com a RNAtalão solução ressuspensão primeiro ** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Passos crítica Ao realizar o acoplamento amino alil, é fundamental para voltar a suspender o corante em DMSO em breve (menos de 1 hora) antes de acoplamento e garantir que não haja água fica na mistura de corante / DMSO, como ele vai reagir com o grupo ativo no corante. Não overdry o RNA (podem ser secas até 1-2uL ao invés de completamente seca), e ressuspender bem no buffer de acoplamento. Durante a reação de acoplamento, manter a reação no escuro, com flicking ocasionais e spin down, se dese...

<table><tbody><tr><td>Pacote de Corante Reativo pós-marcação CyDye</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Contém os corantes Cy3 e Cy5</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>Outro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Ou espectrofotômetro equivalente</td></tr></tbody></table>

infecção pelo vírus vaccinia e análise temporal da expressão gênica de vírus: parte 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 3 descreve o processo de rotulagem fluorescente do RNA amplificado a partir do host e as amostras virais por acoplamento alílico amino de corantes. Parte 3 de 3.

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 3

A família Poxviridae consiste em vírus grandes contendo DNA de fita dupla que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros de ...

Olá, sou Judy Y do laboratório de Kate Rubins no Whitehead Institute for Biomedical Research. Aqui demonstramos como rotular as amostras de RNA antissenso coletadas de células HeLa infectadas com o vírus vaccinia e do próprio vírus, por meio do acoplamento de corantes com amino all LEO. Em seguida, mostramos como purificar o RNA antissenso rotulado e prepará-lo para hibridização em análise de expressão gênica por microarranjo.Os vídeos anteriores da JoVE destacam como realizar o isolamento de RNA total, amplificação de RNA e etapas de amplificação em infecções virais. Então, vamos começar. Para iniciar a marcação de RNA, adicione primeiro um micrograma das amostras de RNA A em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro.Seque os amostras a vácuo com calor baixo ou nenhum calor até que estejam completamente secas. Tampe cada tubo assim que estiver seco. É importante não secar em excesso as amostras após estarem secas.Adicione nove microlitros de tampão de acoplamento a cada tubo e ressuspenda o RNA A por meio de vortexagem suave durante um minuto; centrifugue brevemente para recolher a amostra no fundo do tubo e, em seguida, deixe a amostra em gelo. Em seguida, adicione 22 microlitros de DMSO de alta qualidade a cada tubo de corante SCI três ou S cinco; um tubo de corante é suficiente para duas amostras. O corante S SI três é para marcação das amostras de referência e o corante SCI cinco é para marcação das amostras-teste.Vortexe os corantes para misturar completamente. Lembre-se de manter os corantes no escuro até o momento de uso. Não prepare os corantes com mais de uma hora de antecedência e certifique-se de que nenhuma água entre na mistura de corante em DMSO em nenhum momento.Agora, adicione 11 microlitros da mistura de corante D-M-S-O-S preparada a cada amostra e misture bem por vortex. Incube suavemente por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente. Cubra as amostras com papel-alumínio ou mantenha-as em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.Após a incubação, adicione 4,5 microlitros de hidroxilamina a cada amostra para interromper a reação, misturando bem por vortex. Incube suavemente por mais 15 minutos à temperatura ambiente. Cubra as amostras com papel-alumínio ou mantenha-as em uma gaveta para minimizar a exposição à luz.Para limpar o rótulo, vórtexem o RNA, as microesferas de ligação ao RNA. Prepare brevemente o mix de ligação ao RNA A em temperatura ambiente para obter uma mistura homogênea antes do uso. Misture bem o mix de ligação por vórtex, alíquotas do tampão de eluição de RNA A em um tubo de 1,5 mililitro e incube a 50-60 graus Celsius por pelo menos 10 minutos.Adicione 70 microlitros da mistura de ligação de RNA A a cada amostra e homogeneíze bem pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes; após a mistura, transfira as amostras da placa de PCR para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 50 microlitros de isopropanol a cem por cento a cada amostra e homogeneíze bem pipetando para cima e para baixo três a quatro vezes. Agite suavemente a placa em um agitador orbital por pelo menos dois minutos.Para misturar completamente as amostras. Transfira a placa para um suporte magnético. Para capturar as microesferas magnéticas.Deixe a placa sobre o suporte até que a mistura fique transparente e as perlas de ligação tenham sedimentado. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar as perlas magnéticas. Alternativamente, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte o sobrenadante.O sobrenatante deve estar com uma cor rosa brilhante ou azul brilhante neste ponto, devido às moléculas de corante não incorporadas. Após descartar o sobrenatante, retire a placa do suporte magnético. Em seguida, adicione cem microlitros de uma solução de lavagem de RNA a cada poço e agite a placa por um minuto no agitador orbital em velocidade moderada.As esferas podem não se dispersar completamente nesta etapa; retorne a placa para um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar as esferas magnéticas.Alternativamente, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e descarte o sobrenadante. Retire a placa do suporte magnético. Repita a lavagem uma segunda vez com 100 microlitros de solução de lavagem de RNA A.Após a segunda lavagem, seque as microesferas agitando a placa por um minuto no agitador orbital na velocidade máxima. Não seque em excesso as amostras; elua o RNA A das microesferas adicionando 20 microlitros de tampão de eluição de RNA A pré-aquecido.Agite vigorosamente cada amostra na placa no agitador orbital durante três minutos. Em seguida, verifique se os microesferas magnéticas estão completamente dispersas. Caso contrário, continue agitando.Uma vez que as microesferas magnéticas estejam completamente dispersas, transfira a placa para um suporte magnético para capturar as microesferas magnéticas. O sobrenadante contém as amostras de RNA A marcadas e purificadas e deve apresentar-se em tom rosa claro ou azul claro. Em seguida, transfira cuidadosamente o RNA A referido para uma nova placa de PCR ou tubos de PCR.Neste momento, você pode verificar a concentração de RNA e a quantidade de corante nas amostras medindo 1,5 microlitros em um espectrofotômetro NanoDrop. Usando o módulo de microarranjo, hibridize imediatamente o RNA marcado A em uma plataforma de microarranjo de sua escolha. Ou, alternativamente, você pode armazenar o RNA marcado A a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para a hibridização.Esta é uma leitura representativa de espectrofotômetro e um gráfico de DO gerado usando o espectrofotômetro NanoDrop para medir a concentração da amostra e a incorporação do corante. É possível observar os picos de DO em 260 nanômetros para o cálculo da concentração das amostras, bem como os dois picos em torno de 532 e 635 nanômetros, que representam os corantes S3 e SCI cinco, respectivamente. Acabamos de mostrar como rotular fluorescentemente amostras de RNA com alelo imunológico amplificado incorporado para hibridização em micromatriz.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de ressuspender o corante em DMSO menos de uma hora antes da conjugação e garantir que nenhuma água entre na mistura de corante com DMSO, pois ela reagirá com o grupo ativo do corante. Também é importante lembrar de não secar em excesso o RNA, se necessário. As amostras podem ser secas até um a dois microlitros, em vez de completamente secas, e então bem ressuspensas no tampão de conjugação durante a reação de conjugação.Mantenha as reações no escuro com agitações ocasionais e centrifugue, se desejar. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.Certifique-se de assistir aos outros vídeos desta série, nos quais mostramos como realizar uma infecção em curso temporal com o vírus vaccinia, a extração de RNA das amostras e o procedimento para amplificação linear de amostras de RNA.

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