Name: Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprenda a manter e expandir células-tronco embrionárias humanas usando as linhagens H1 e H9 com técnica de colagenase. Este método preserva a viabilidade celular e evita diferenciação indesejada em cultura.

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<ol><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Pruszak, J., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> , John Wiley and Sons. (2007).</li>
<li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Sonntag, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li>
<li>Ko, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous%2C+stable%2C+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li>
<li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages%2C+including+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li>
<li>Pankratz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Lazzari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts%3A+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li>
<li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li>
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propagação de-tronco embrionárias humanas (es) células

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Sim, sou Lauren Deon. Sou responsável pela instalação conjunta de células-tronco humanas da Amgen no MGH. Sim, sou a Lauren, sou responsável pela instalação conjunta de células-tronco humanas da AM no MGH.Então, venho trabalhando com células-tronco embrionárias humanas há anos, desde que fui pós-doutorando em George De Lab, há quatro anos. Atualmente, temos duas linhagens celulares, H1 e H9, ambas derivadas de células Y. A forma como ampliamos ou mantemos essas células em cultura, pelo menos a maneira como as dividimos, é utilizando colagenase.Então, o que eu costumo fazer é que, nos primeiros subcultivos após semear as células, utilizo uma técnica chamada seleção de colônias. Nesse caso, posso verificar ao microscópio quais colônias apresentam boa diferenciação e formato agradável, coletar apenas essas colônias, cortá-las em alguns pedaços e replantá-las em uma placa nova. Já as colônias que parecem estar diferenciadas de forma inadequada são simplesmente deixadas em repouso.A outra forma de passar as células é utilizando tripsina. Por isso, não utilizo esta técnica aqui. Acho que a colagenase é um pouco mais segura porque as células-tronco humanas não gostam de ser individualizadas ou de ficarem sozinhas.Portanto, se você usar tripsina por um tempo um pouco longo demais, por exemplo, três a quatro minutos, que é a forma como usamos a tripsina para outros tipos de células, as células-tronco humanas serão individualizadas e a maioria delas morrerá, diferenciar-se-á ou não se fixará ao meio. Assim, a ideia é manter as células em aglomerados. Você não quer que elas fiquem isoladas no frasco.Portanto, ao usar colagenase, a vantagem é manter as células viáveis. Ao usar chipsy, você simplesmente seleciona as células que sobreviverão a esse processo extremamente agressivo de opsonização. Assim, essas células geralmente são altamente proliferativas.Assim, você obtém, você pode adaptar suas células a esse processo de tripsina. O problema é que você tem células que se comportam de maneira diferente, elas avançam muito mais rápido. E um risco é que você possa obter alguma anormalidade comercial, a esse, a esse processo de divisão muito elevado.Então, você diz que a seleção pode causar a escolha de células em cultura com maior taxa de proliferação. Correto. Mais ativas e provavelmente também com taxas de sobrevivência mais altas do que outras células. Assim, após a proliferação, basicamente a cultura, após a proliferação com tripsina, após várias passagens, torna-se uma cultura diferente, com essas propriedades distintas.Portanto, é difícil determinar se eles são exatamente idênticos. Se você realizar o teste, o teste usual, digamos que verifique marcadores, marcadores comuns de células totalmente diferenciadas como OC4, NANOG, SSEA4, CD3, todas essas moléculas ainda podem ser expressas. Se você verificar a formação de TER, essas células ainda podem se diferenciar e se formar como células normais.Se você observar o cariótipo, pode haver alguma anormalidade, mas ainda assim você pode ter um cariótipo normal. A vantagem seletiva pode ser devida apenas a uma mutação que não é possível ver ao realizar um cariótipo. Assim, o fato de que eles crescem muito mais rápido é, por si só, acho que um pouco pior.E se quisermos usar essas células para transplante em algum momento, eu certamente não usaria esse tipo de células. Ok. Então, você gostaria de me dizer quais são os principais problemas técnicos com o uso dessa técnica para, para passagens de células? Então, usando S, sim.É apenas um pouco mais longo e, como as células não estão se dividindo tão rapidamente, demora muito mais para obter um grande número de células para realizar algum experimento. Então, é apenas menos conveniente, eu diria. Gostaria de me falar algumas palavras sobre os objetivos do seu experimento?Como você utiliza as células CS? Ok, então meu projeto principal aqui é obter células endoteliais a partir de células-tronco humanas AB. E a ideia é ser capaz de produzir sangue.E estamos trabalhando muito com laboratórios de bioengenharia de tecidos, e um dos seus objetivos é produzir tecidos in vitro. Porém, uma das limitações para isso é a ausência de vasos sanguíneos atravessando esses tecidos. Assim, se pudermos introduzir células endoteliais ou colocar células endoteliais nesses tecidos, teríamos um crescimento muito melhor desses tecidos.Assim, poucas fontes de células são conhecidas para células endoteliais, como sangue coletado a frio ou sangue sob pressão, mas seria interessante dispor de outra fonte de células, como células-tronco embrionárias humanas. E a vantagem é que, como as células-tronco embrionárias humanas podem ser expandidas quase infinitamente, você poderia modificar essas células, criar um sistema indutível e torná-las utilizáveis. Em seguida, em seu produto final, suas células materiais, neste caso.

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Biologia

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

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Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar...

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Aqui demonstramos como nosso laboratório congela MATIZ embrionárias humanas linhas de células estaminais.

Congelamento células ES

Aprenda a manter e expandir células-tronco embrionárias humanas usando as linhagens H1 e H9 com técnica de colagenase. Este método preserva a viabilidade celular e evita diferenciação indesejada em cultura.

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

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