Name: Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Aprenda a realizar imagem de longo prazo em células de mamíferos usando microscopia de campo amplo invertida a 37°C. Este método permite estudar divisão celular e progressão mitótica em tempo real.

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Os autores não têm nada a declarar.

longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do largo-campo microscopia

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Na verdade, o que vou fazer é montá-lo aqui primeiro e depois substituir você. Então, agora vou aspirar, tentando ser o mais delicado possível. Ok. Alguns segundos apenas segurando. Ok. Tudo bem.Portanto, as características importantes da nossa grade de imagem em tempo real são: trata-se de um microscópio invertido, o que significa que a objetiva, as amostras aqui na objetiva estão abaixo. Assim, a objetiva está voltada para cima e todo o microscópio, ou praticamente todo, incluindo as objetivas e a amostra, está a 37 graus. Portanto, tudo dentro desta caixa de plástico está a 37 graus.E logo acima do estágio temos uma mistura de ar e CO2. Isso é 5% de CO2. A ideia é que a amostra esteja efetivamente em uma célula, como num incubador de células.E então temos, este é o nosso misturador para o ar e o CO₂, e ele é umidificado e aquecido, e depois conduzido até a amostra na platina. Ok. E hoje vamos fazer apenas fluorescência em um canal, fluorescência GFP. Esta é a mangueira por onde entra o CO₂, com 5% de CO₂, e ela se encaixa simplesmente no suporte da platina.Isso é importante. E então podemos fechar esses, retirá-los, e depois passamos para a nossa primeira posição. E o que vou fazer é ir para o primeiro campo, que é a minha amostra controle, e escolherei posições com base no que vejo na tela.Então, eu apenas verifico se realmente olho pelo microscópio em cada poço novo, porque o plano focal para cada um dos poços é diferente; o recipiente não é perfeitamente plano na base. Portanto, será necessário fazer ajustes finos ao passar de um poço para outro. Neste momento, estou no primeiro poço; o que farei é focar, então acabei de ligar, acabei de acionar, acabei de ligar a luz, a luz transmitida do microscópio.E eu verifico se toda a luz está indo para as oculares. Então, eu simplesmente olho e verifico se obtenho um campo nítido e limpo. Em seguida, desligo essa luz, ligo a luz de fluorescência e verifico se as células que estou observando parecem saudáveis e não estão em apoptose.E, e eu desligo isso. E o que faço em seguida é enviar, então agora vou começar a escolher posições, o que significa que preciso enviar o trajeto da luz para a câmera. Esta é a câmera bem aqui.Então, digo ao microscópio para enviar todas as imagens para a câmera, já que nada é visto pelas oculares. O que farei é, no software que controla o microscópio, selecionar o conjunto de filtros adequado, que, para os nossos propósitos, é o psy. Em seguida, definirei um tempo de exposição.E eu conheço bem essas células e sei que elas exigem um tempo de exposição de 0,2 segundo. Então, digo isso ao software para fazer. E o que farei é clicar em foco.Este é, e ele está basicamente apenas vivo. Uma luz se acenderá e você pode, oh, não sei se consegue ver as células, mas a razão pela qual este é um bom campo é porque todas as células são, mesmo em termos de sua fluorescência, não há células apoptóticas. Células apoptóticas tendem a ser muito brilhantes e não há sujeira ou resíduos no campo.E você pode ver que, na verdade, esta é uma célula em metáfase e aquela é uma célula em metáfase, aquela é uma célula que provavelmente acabou de sair da mitose. E eu consigo perceber isso porque parece que esses dois conjuntos de cromatina estão muito bem alinhados um em relação ao outro. Como se tivessem acabado de sair da anáfase.Então, esse é um bom campo. Agora que sei que o tempo de exposição e o conjunto de filtros estão corretos — o que varia conforme o software —, vou selecionar posições, e o software memorizará a posição X, Y, Z desse campo. Depois, quando escolher outro campo, e eu, então, quando estiver selecionando, ao escolher novos campos, mas no mesmo, bem, usarei o, moverei o, fecharei o obturador, abrirei o obturador e observarei o que vejo na tela, escolhendo os campos com base nisso, em vez de olhar diretamente pelo microscópio.Então, não vejo nenhum dos meus tônicos aí. Mas novamente, mesmo bem centralizadas, essas células passarão pelo meu PS, continuo, aqui está um bom exemplo. Aqui está um bom exemplo do que eu evitaria, veja como está brilhante? Isso é muito brilhante. Provavelmente são restos de uma célula apoptótica. E a razão pela qual eu evitaria isso é porque, por ser tão brilhante, quando o software focar automaticamente, ele irá focar apenas nisso e não estará no mesmo plano que todas as outras células.E então eu não obterei nenhuma informação desse campo. Isso parece bom. Há um, este é um prometáfase bem aqui, isso é uma metáfase.Então, e eu vou adquirir três posições por poço. Isso foram três posições e agora vou passar para o próximo poço. Assim, o que provavelmente farei é capturar imagens a cada 10 minutos. É um compromisso.A imagem em tempo real é sempre um compromisso, não é? É necessário realizar a aquisição de imagens e, ao mesmo tempo, manter as células saudáveis, especialmente se estiver interessado na mitose. Portanto, é preciso minimizar a exposição delas à luz fluorescente.E, mas você quer obter informações. Então, você precisa capturar imagens, precisa, ou seja, precisa fazer um compromisso, precisa tomar uma decisão sobre o que deseja registrar, que tipo de informação quer capturar. Para nossos propósitos, a mitose costuma levar cerca de uma hora.Então, se estivermos usando intervalos de 10 minutos, isso é bastante bom. Vemos a prófase, vemos a metáfase, vemos a anáfase e podemos observar quando há tratamentos, drogas ou siRNAs que afetam essas fases específicas do ciclo celular. Assim, para os nossos propósitos, isso é suficiente, mas sempre queremos mais.Sempre queremos mais posições ou um intervalo de tempo mais fino ou algo assim. Portanto, é um compromisso. Então, vou clicar em iniciar.E então, nosso software realiza uma passagem de foco automático na primeira etapa. Assim que eu clicar em iniciar, ele deverá começar a focar automaticamente e você verá o obturador abrir, abrir e fechar durante o foco automático. Então, vou clicar em iniciar.Então, isso é o obturador abrindo e fechando. O motor Z está sendo acionado e está tentando encontrar o plano com maior contraste, que será o mais nítido. É possível ver na tela o foco entrando e saindo do melhor plano de foco, o que pode parecer preocupante.O que ele faz é mover o motor Z para encontrar o plano de foco ideal, ou seja, aquele com a imagem mais nítida. Em seguida, ele captura uma imagem nesse ponto e memoriza essa posição Z. Depois, utilizaremos essa posição Z nas próximas 12 aquisições.Em seguida, faremos novamente a passagem de focagem automática. Que tipo de experimentos eles realizam? Está bem, então nosso laboratório tem grande interesse em compreender o que regula a progressão mitótica, ou pelo menos eu tenho grande interesse em entender isso.Com a imagem de células vivas e, especialmente, com nosso microscópio de imageamento multilocalização e de longa duração, é possível filmar células por dois ou três dias enquanto entram e completam a mitose, e você pode registrar múltiplas rodadas de mitose para compreender o processo. Em seguida, você pode adicionar drogas, RNAs ou qualquer tipo de perturbação às células que deseja estudar. Assim, é possível entender como essas drogas ou genes são importantes na regulação da progressão mitótica.Como não se trata de trabalho com células fixadas, mas com células vivas, é possível compreender o que, quando é necessário introduzir uma perturbação para afetar a mitose ou em qual estágio da mitose ocorre o efeito. Portanto, é realmente poderoso nesse aspecto. Quais são os principais elementos técnicos desses experimentos?Quais são os possíveis problemas? Bem, o maior problema, além de montar o equipamento, é que montar o equipamento não é algo trivial. Muitas pessoas possuem o equipamento, mas é preciso garantir apenas que ele funcione bem para a sua aplicação.O aspecto financeiro não é, você sabe, não é pequeno. Então, há a montagem do aparelho e, depois, uma vez que você coleta os dados, surge um problema real de análise de dados. Leva esses filmes, se, então, se você está coletando 40 filmes, cada um com 30 células, ou seja, você tem 40 em 40 campos que acabou de filmar e cada um desses campos tem 30 células, então você precisa sentar-se diante de cada um desses filmes e analisar cada uma dessas células nesse filme.Então, leva realmente muito tempo para fazer a análise de dados. E isso significa que leva uma semana para analisar dados que você levou dois dias para coletar. Há, portanto, um obstáculo muito grande em termos de reunir grandes quantidades de dados.Portanto, embora envolva coleta de dados de alto rendimento, não se trata de uma análise de alto rendimento. O que seria necessário para tornar este experimento verdadeiramente de alto rendimento? Nosso laboratório está desenvolvendo um programa que realiza a análise dos dados automaticamente.E é um programa bastante decente. Não é perfeito. O olho humano é sempre melhor, mas está quase lá.Então, quais são as aplicações interessantes deste experimento? Talvez outros campos que você possa mencionar? Além da divisão celular?Você quer dizer para, ah, para a imagem de células vivas? Sim. Bem, você pode realizar ensaios de motilidade celular. Você pode, dependendo da microscopia envolvida, observar como as células se movimentam, ou mesmo acompanhar o desenvolvimento de tumores, se realmente desejar.Mas, nesse caso, você, você está, desde que tenha a configuração de imagem adequada, pode, você está praticamente sem limitações em termos de qualquer coisa. O nosso microscópio, por acaso, é apenas de campo amplo e utilizamos uma objetiva de 20 x 20x. Então, é uma configuração de resolução bastante baixa, mas isso é suficiente para o que precisamos observar.Portanto, existem, mas certamente não existem limitações. Qualquer experimento que envolva algum tipo de dinâmica, como na biologia, se beneficiaria muito da imagem de vida. Assim, a imagem de cálcio, embora não possa ser realizada no nosso aparelho, é algo relacionado a células vivas.Você definitivamente precisa de imagem de células vivas para isso. Como eu disse, ensaios com pacientes, ensaios de motilidade, esse tipo de coisa se beneficiaria muito da imagem de células vivas. Gostaria de contar um pouco sobre sua experiência anterior?Quanto tempo você dedica a essas técnicas? Em quê você trabalhou anteriormente? Uau. Durante meu doutorado, eu não trabalhei.Eu fiz muita microscopia confocal, mas nenhuma imagem de vida livre. Durante meu pós-doutorado, ajudei o Dr. King a montar esse aparato que usamos para preparar esses fragmentos e colocá-lo em funcionamento. Assim, durante meu pós-doutorado, adquiri muita experiência tanto com microscopia de campo amplo com imagens de lapso de tempo em nosso microscópio, que é o de campo amplo, quanto com imagens de lapso de tempo utilizando microscopia confocal.E eu diria que é realmente poderoso. Você obtém muitas informações, mas não é fácil fazê-lo funcionar perfeitamente. Por isso, exige muita atenção e um grande cuidado com os detalhes em cada pequena etapa do processo.E, então, você ainda terá problemas. Portanto, é uma aplicação difícil, mas você realmente pode obter, se, se for isso que você precisa para estudar o seu problema, o seu problema científico, então, é inestimável a esse respeito, mas é desafiador. Então, encontre alguém que saiba o que está fazendo e recorra a essa pessoa.Esse é o meu conselho. Tão bom.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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O método aqui apresentado utiliza micropadronização em conjunto com a imagem quantitativa para revelar a organização espacial dentro das culturas de mamíferos. A técnica é fácil de estabelecer em um laboratório de biologia celular padrão e oferece um sistema tratável para estudar padronização in vitro.

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Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

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Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Aprenda a realizar imagem de longo prazo em células de mamíferos usando microscopia de campo amplo invertida a 37°C. Este método permite estudar divisão celular e progressão mitótica em tempo real.

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