Name: Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a dissecar o epitélio sensorial da orelha interna de zebrafish adultos para estudar regeneração de células ciliadas. Este protocolo permite isolar tecidos para análise celular em vertebrados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health.

Parte 1: Preparação do tecido <ol><li> Euthanize o peixe-zebra adulto com buffered MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoato sal metanossulfonato, 0,03%). </li><li> Decapitar o peixe. Cortar o maxilar inferior, coloque a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima, e imobilizar o tecido com pinos de insetos. Remover o tecido mole ventral no crânio e se abrir a parte ventral da cápsula crânio com um par de pinças finas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Fixar a cabeça de peixe em paraformaldeído (4%) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar a cabeça de peixe fixados em PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) por 3 vezes, 5 minutos de cada vez. </li></ol> Parte 2: Gross dissecção da orelha interna <ol><li> Coloque o peixe cabeça na almofada dissecção com o lado ventral. Imobilizá-lo com alfinetes de insetos. Todas as etapas seguintes são realizadas no microscópio de dissecação. </li><li> Com um par de pinças finas, remova o osso do crânio sobre o ouvido interno e, em seguida, puxe cuidadosamente para fora dos tecidos do ouvido interno: sáculos, lagenae, e utrículos. Sáculo e lagena são fortemente anexar ao outro e, assim, retirar juntos enquanto o utrículo (anterior ao sáculo e lagena), muito provavelmente a ser destacado da outra extremidade órgãos durante a dissecção. </li><li> Coloque os tecidos do ouvido interno em PBS (1X). Se não houver dissecção mais fino é necessário, lave o tecido 2-3 vezes com PBS (1X) e pode ser utilizado para outros experimentos, criosecções por exemplo. </li></ol> Parte 3: dissecção fina do epitélio sensorial do ouvido interno <ol><li> A dissecção fina pode ser realizada em uma gota de PBS (1X) em uma lâmina de vidro limpa. </li><li> Remover o otólitos do utrículo utricular com dois pares de pinças finas, e, se desejar, corte o tecido não-sensoriais epiteliais e da inervação da epitélios com um par de pinças finas e uma lâmina de agulha. </li><li> Remover o otólitos lagenar antes de separar sacular e lagenar epitélio, enquanto tentar manter o sáculo toda tão intacto quanto possível. Coloque o tecido na queda PBS com até lado ventral. Use a lâmina de agulha para corte cuidadosamente entre o sáculo e lagena. Corte o tecido não-sensorial excessiva epiteliais e os innvervation com uma pinça fina e da lâmina da agulha, se desejar. </li></ol> Parte 4: coloração fluorescente das células ciliadas no epitélio sensorial <ol><li> Lavar o epitélio sensorial com PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) por 3 vezes, 5 min de cada vez. </li><li> Incubar os epitélios com fluophore marcado phalloidin (por exemplo, farinha Alexa 488 faloidina, 1:1.000 diluição) por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar o epitélio sensorial com PBT de 3 vezes, 10 min de cada vez. </li><li> Monte o epitélio sobre uma lâmina com meio de montagem e verificar o tecido manchado sob o microscópio fluorescente com filtros do comprimento de onda adequado. </li><li> Após a dissecção de sucesso e coloração, epitélio intacto, com forte coloração feixe capilar célula pode ser visto sob o microscópio (Fig. 1). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Células ciliadas do epitélio sacular sensoriais foram coradas com Farinha Alexa 488 faloidina (Green). A amostra de tecido foi dissecada e coradas como mencionado no jornal. Várias fotos foram tiradas em diferentes posições da amostra e azulejos em conjunto com o Adobe Photoshop 7.0. Barra de escala = 150μm.

Neste protocolo, descrevemos a dissecção grossa e fina do epitélio sensorial do ouvido interno de peixe-zebra adulto, o que nos permite preparar amostra de tecido para estudar as características celulares e subcelulares do epitélio sensorial. , A fim de realizar uma dissecação de sucesso, o primeiro passo, a fixação, é muito importante. Certifique-se que você sempre usa solução paraformaldeído preparados na hora, porque solução antiga resultará em menos de fixação de tecidos que são difíceis...

<table><tbody><tr><td>MS222 (sal de ácido metanosulfônico do etil 3-aminobenzoato)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (salina tamponada com fosfato, 10X)</td><td>Reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 faloidina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium com DAPI</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Alfinetes para dissecação</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Ferramenta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de agulha</td><td>Ferramenta</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Microscópio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de dissecação</td><td>Ferramenta</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Peixe-zebra</td><td>Animal</td><td>Vários</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecação bruta e multa de ouvido interno epitélio sensorial em adultos zebrafish ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurossensorial epitélio do ouvido interno são as estruturas cruciais para as funções de audição e equilíbrio. Portanto, é importante compreender as características celulares e moleculares do epitélio, que são compostas principalmente de dois tipos de células: células ciliadas (HC) e células de apoio (SCS). Aqui nós escolhemos estudar o epitélio sensorial do ouvido interno em zebrafish adulto não só porque as estruturas epiteliais são altamente conservada em todos os vertebrados estudados, mas também porque o peixe-zebra adulto é capaz de regenerar HCs, uma capacidade que os mamíferos perdem logo após o nascimento. Nós usamos a orelha interna do peixe-zebra adulto como um sistema modelo para estudar os mecanismos de regeneração interior HC ouvido nos vertebrados adultos que poderiam ser úteis para a terapia clínica da audição / déficits na balança humana, como resultado da perda de HC. Aqui demonstramos como fazer dissecções bruta e multa de epitélios sensoriais do ouvido interno em peixe-zebra adulto. A dissecção macroscópica remove os tecidos ao redor do ouvido interno e é útil para preparar cortes de tecido, o que nos permite examinar a estrutura detalhada do epitélio sensorial. A dissecção fina limpa os tecidos não-sensoriais-epitelial de cada epitélio individuais e nos permite examinar a heterogeneidade do epitélio todo facilmente em todo o monte amostras epiteliais.

O epitélio sensorial do ouvido interno zebrafish adultos é um sistema bom modelo para a compreensão dos mecanismos de regeneração das células ciliadas nos vertebrados adultos. Este protocolo demonstra a dissecção fina do epitélio, através do qual podemos obter amostras de tecido para estudar os eventos de regeneração em níveis celular e subcelular.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Os epitélios neurosensoriais da orelha interna são as estruturas cruciais para as funções de audição e equilíbrio. Portanto, é importante compreender o...

No ouvido interno do peixe-zebra, existem três pares de sacos, como órgãos terminais, o utrículo, o S e o Lana. O utrículo localiza-se mais anteriormente, enquanto o S e o lega estão firmemente ligados um ao outro e localizam-se posteriormente ao utrículo. Após a dissecação macroscópica, o S e o lega permanecem ligados e a estrutura semelhante a uma pedra, o otólito, pode ser facilmente vista em cada órgão terminal na dissecação fina subsequente. O S e o lega são separados um do outro mediante um corte pela face ventral.Os otólitos são removidos e os tecidos epiteliais não sensoriais são aparados para obter os tecidos epiteliais sensoriais dos três órgãos sensoriais. Olá, sou Jean Leon do Laboratório de Sean Burgess, na seção de genômica do desenvolvimento do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano. Hoje vamos mostrar um procedimento para a dissecção fina e precisa dos epitélios sensoriais do ouvido interno de peixes-zebra adultos.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão gênica no epitélio sensorial interno da orelha. Então, vamos começar. Para iniciar a dissecação, eutanize o peixe-zebra adulto com MS 222 tamponado a 0,03%, decapite o peix

gross-fine-dissection-inner-ear-sensory-epithelia-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um procedimento para identificar e dissecar os órgãos do peixe-zebra adulto.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.

Dissecção do coração em larval, Zebrafish Juvenil e Adulto, Danio rerio</em

O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

A microscopia eletrônica 2D em larga escala (EM), ou nanotomia, é a aplicação em todo o tecido da resolução em nanoescala. Aqui descrevemos um método universal de nanotomia aplicado para investigar o cérebro larval do peixe-zebra na saúde e em lesões cerebrais não invasivas.

Transmissão de digitalização em grande escala Electron Microscopy (Nanotomy) de saudável e Ofendidos Zebrafish Cérebro

Aqui, apresentamos uma série padronizada de protocolos para observar o sulco superior e ocular, uma estrutura recentemente identificada, conservado evolutivamente no olho vertebrado. Usando zebrafish larvas, demonstraremos técnicas necessárias para identificar os fatores que contribuem para a formação e o fechamento do sulco superior ocular.

Visualização do sulco Superior Ocular durante a embriogênese Danio rerio

Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Aprenda a dissecar o epitélio sensorial da orelha interna de zebrafish adultos para estudar regeneração de células ciliadas. Este protocolo permite isolar tecidos para análise celular em vertebrados.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Explorar mais vídeos