Name: Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a realizar imagem ao vivo do cérebro em embriões de zebrafish com resolução de célula única usando microscopia confocal. Este método permite estudar a morfogênese cerebral vertebrada em Danio rerio.

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Muito obrigado a Dr. Jennifer Gutzman quem primeiro desenvolveu essa técnica no laboratório Sive. Graças também ao JB Verde no Dana-Farber Cancer Institute em Boston, MA que gentilmente forneceu o plasmídeo CAAX-GFP mRNA. A imagem confocal foi realizada na Fundação WM Keck Facilidade de imagem Biológicas da Whitehead. HS é suportada por NIHMH70926. EG é apoiado por uma bolsa NSF pré-doutoramento.

1. Preparando o mRNA para Injeção <ol><li> O mRNA utilizado neste procedimento é transcrito a partir de um plasmídeo CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. Primeira linearizar o plasmídeo de acordo com Gutzman et al, 2008. </li><li> Em seguida, transcrever mRNA memGFP usando o mMessage mMachine kit. </li><li> Diluir o mRNA resultante para 1μg/μl, alíquota, e armazenar a -80 ° C. </li><li> Prepare um molde de injeção de agarose 1% com faixas da largura de embriões no estágio uma célula. </li><li> No dia antes da injeção, criada gaiolas de acasalamento separar o macho das fêmeas. </li><li> No dia da injeção, agulhas de puxar capilar utilizando um extrator micropipeta para se preparar para injeção. </li></ol> 2. Injetando o mRNA <ol><li> No dia da injeção, descongelar uma alíquota de 1μg/μl mRNA memGFP no gelo. </li><li> Diluir o mRNA 1:5 em água a uma concentração final de 200ng/μl, e manter em gelo. </li><li> Carga a agulha capilar com 1μl de mRNA memGFP preparado em 200ng/μl. </li><li> Lugar carregado de agulha em um micromanipulador anexado a um microinjetor movidos a gás. </li><li> Ajustar o volume de injeção para 1nl. </li><li> Puxe os divisores de peixes do tipo selvagem criado em gaiolas de acasalamento do dia anterior. </li><li> Coletar os embriões logo que são colocados. Orientá-los no molde de injeção agarose coberta por meio de embrião (Westerfield, 1995) com a única célula do lado longe do micromanipulador. </li><li> Injetar através do córion e gema de tal forma que o mRNA é depositado diretamente em uma única célula. Injetar cerca de 50 embriões por experiência. Não injetar se a célula tem dividido. </li><li> Embriões incubar a 28 ° C durante a noite em meio embrião </li></ol> 3. Montagem e embriões de imagem <ol><li> Para a montagem ea imagem dos embriões, remova o córion com uma pinça dos embriões sob um estereomicroscópio uma hora antes do ponto de tempo de interesse. </li><li> Prepare um slide para montagem de até quatro embriões. <ul><li> Use graxa de vácuo silicone para selar uma lamela na parte inferior de uma lâmina de plástico especialmente concebidos dois milímetros de espessura, com um buraco de aproximadamente 1 centímetro de diâmetro. </li><li> Preencher o buraco no slide com agarose 0,7%, e deixe repousar cerca de 20 minutos ou até que endureceu </li><li> Uma vez que a agarose solidificou, remover uma pequena ficha usando 200μl ponteiras para formar buracos cilíndrico em que a montagem de cada embrião. </li></ul></li><li> Coloque os embriões no slide cheio de agarose sob um microscópio de dissecação. Adicionar 50μl de tricaina (Westerfield, 1995) para anestesiar os embriões. </li><li> Use uma pinça para posicionar os embriões nos buracos cilíndricos no agarose com o cérebro ou região de interesse contra a lamela subjacente. </li><li> Cobrir os embriões no agarose com outra lamínula fixada com graxa de silicone a vácuo. </li><li> Imagem do embrião usando uma invertida, fluorescente, laser-scanning ou spinning microscópio confocal de disco. Imagem em 63x ou superior para coletar imagens de alta resolução de células individuais dentro do neuroepitélio. </li><li> As imagens são exportadas como arquivos TIFF a partir do software LSM e analisados ​​utilizando Photoshop. </li></ol> 4. Resultados representante / Resultado Mostrado na Figura 1 é uma imagem representativa de um confocal neuroepitélio zebrafish 24 hpf entre o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos. Cada célula é marcada com GFP ligada à membrana. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> Figura 1. Vivem de imagem confocal de um memGFP injetado embrião zebrafish 24 hpf. (A) neuroepitélio de um embrião de 24 hpf com cada célula delineada pelo GFP. Região fotografada separa o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos (M, H, respectivamente), formando a fronteira mesencéfalo rombencéfalo.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

Neste vídeo, demonstramos um método para injeção de mRNA em embriões de peixe-zebra única célula. Aqui, usamos mRNA que codifica uma membrana GFP-alvo para rotular cada célula. Nós, então, demonstrar como montar e imagem do cérebro em desenvolvimento na resolução única célula. Esta técnica permitiu-nos a estudar um novo tipo de célula mudar de forma, a constrição basal, necessária para a formação da fronteira mesencéfalo rombencéfalo (Gutzman et al, 2008). Análise semelhante de outros fenômenos tem o potencial para expa...

<table><tbody><tr><td>Agarose SeaKem GTG</td><td> Reagente</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>Éster etílico do ácido 3-aminobenzoico (Tricaine)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Ferramenta</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/fibra 100 mm</td></tr><tr><td>Graxa de silicone para vácuo</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont nº 5 Bio Inox</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 1-200 &amp;mu;l</td><td>Ferramenta</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>Este é o tamanho correto para embriões com 24 hpf. </td></tr><tr><td>Kit de transcrição mMessage mMachine</td><td>Reagente</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Polimerase SP6 de RNA</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura Zeiss LSM 510</td><td>Microscópio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Ferramenta</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Ferramenta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Ferramenta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivem de imagem do cérebro zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Neste vídeo, demonstramos o método de nosso laboratório tem desenvolvido para analisar as mudanças de células forma e rearranjos necessários para dobrar e dobrar o cérebro zebrafish em desenvolvimento (Gutzman et al, 2008). Essa análise permite uma nova compreensão da biologia das células subjacentes necessários para o desenvolvimento da estrutura 3D do cérebro de vertebrados, e aumenta significativamente a nossa capacidade de estudar a morfogênese do tubo neural. O cérebro zebrafish embrionárias é moldada a partir das 18 horas pós-fertilização (hpf) como os ventrículos dentro do neuroepitélio inflar. Por 24 hpf, os passos iniciais da morfogênese do tubo neural estão completos. Usando o método descrito aqui, embriões em fase de uma célula são injetados com a codificação do mRNA membrana-alvo a proteína verde fluorescente (memGFP). Após a injeção e de incubação, o embrião, agora entre 18 e 24 hpf, é montado, invertido, em agarose e visualizados por microscopia confocal. Nomeadamente, o embrião do zebrafish é transparente tornando-se um sistema ideal para imagens fluorescentes. Enquanto nossas análises se concentraram na fronteira mesencéfalo e rombencéfalo o rombencéfalo, este método pode ser estendido para a análise de qualquer região do peixe-zebra a uma profundidade de 8-10 mM.

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Neste vídeo, demonstramos o método que nosso laboratório desenvolveu para analisar as mudanças na forma celular e os rearranjos necessários para curvar e dobrar o...

Este procedimento começa com a injeção de um embrião de peixe-zebra de célula única posicionado em um molde de injeção de forma que a célula esteja orientada voltada para longe do aparelho de injeção. Os embriões são então injetados com RNAm com a agulha atravessando a gema e penetrando na célula. No dia seguinte.Um lâmina plástica de montagem é preenchida com aros. Um embrião anestesiado é então posicionado de cabeça para baixo em um orifício nos aros e visualizado por microscopia confocal. Olá, sou Grabham do laboratório da Dra. Hazel Sieve no Whitehead Institute for Biomedical Research e no departamento de biologia do MIT.Hoje vamos mostrar um procedimento para injetar embriões de peixe-zebra na fase de célula única e o subsequente imageamento vivo do cérebro por microscopia confocal. Em nosso laboratório, utilizamos este procedimento para estudar a morfogênese do cérebro de vertebrados com resolução em nível de célula única. Então, vamos começar.O mRNA utilizado neste procedimento é transcrito a partir de um plasmídeo que codifica a proteína GFP ligada à membrana C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A. Primeiro, linearize o plasmídeo mediante digestão com not I, em seguida, transcreva o mRNA da

live-imaging-of-the-zebrafish-embryonic-brain-by-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Apresentamos aqui um protocolo para imagens in vivo de todo o cérebro de larvas de peixes-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional. O procedimento experimental inclui preparo da amostra, aquisição e visualização das imagens.

In vivo Imagem do cérebro inteiro de larvas de peixe-zebra usando microscopia de fluorescência tridimensional

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

Aprenda a realizar imagem ao vivo do cérebro em embriões de zebrafish com resolução de célula única usando microscopia confocal. Este método permite estudar a morfogênese cerebral vertebrada em Danio rerio.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

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