Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Esse procedimento começa com a injeção de um embrião de peixe-zebra unicelular posicionado em um molde de injeção de modo que a célula fique orientada para longe do aparelho de injeção. Os embriões são então injetados com MRNA, com a agulha passando pela gema e entrando na célula. No dia seguinte.

Um ferrolho de montagem de plástico é preenchido com aros. Um embrião anestesiado é então colocado invertido em um orifício no aros em imagens por microscopia confocal. Olá, eu sou Grabham do laboratório da Dra. Hazel Sieve no Whitehead Institute for Biomedical Research e do departamento de biologia do MIT.

Hoje vamos mostrar um procedimento para injetar embriões de peixe-zebra no estágio unicelular e a subsequente imagem ao vivo do cérebro por microscopia confocal. Em nosso laboratório, usamos esse procedimento para estudar a morfogênese cerebral de vertebrados com resolução de célula única. Então vamos começar.

O mRNA utilizado neste procedimento é transcrito a partir de um plasmídeo que codifica C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A ligado à membrana GFP Primeiro, linearize o plasmídeo por digestão sem um só plasmídeo, depois transcreve o mRNA de membrana GFP do plasmídeo linearizado usando a mensagem M e o kit de máquina após a transcrição do mRNA, quantificando o mRNA e a água resultantes para um micrograma por microlitro, Eloqua, e armazene a menos 80 graus Celsius até ser necessário. No dia anterior à injeção, montem gaiolas de acasalamento, separando os machos das fêmeas no dia da injeção. Use um instrumento setter micropipeta polar para puxar agulhas capilares para injeção.

Prepare um molde de injeção de 1% de AGA com linhas da largura dos embriões na fase unicelular no dia da injeção, descongele uma aliquota de membrana GFP mRNA com uma concentração de um micrograma por microlitro sobre gelo. Dilua o mRNA de um a cinco em água até uma concentração final de 200 nanogramas por microlitro e mantenha no gelo. Carregue a agulha capilar com um microlitro de membrana preparada, GFP mRNA, a 200 nanogramas por microlitro.

Aqui adicionamos 0,05% de fenol vermelho ao mRNA para torná-lo visível nas injeções. Coloque a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um microinjetor movido a gás. Ajuste o volume de injeção para um nanolitro.

Em seguida, puxe as divisórias dos peixes selvagens montados nas gaiolas de acasalamento do dia anterior. Recolha os embriões assim que forem postos. Encha o molde de injeção de rosas AGA com meio embrionário e oriente os embriões no molde, com uma única célula do lado, afastado do micromanipulador.

Injete através do corion e das gemas de modo que o mRNA seja depositado diretamente na célula individual. Injetar aproximadamente 50 embriões por experimento. No entanto, se a célula tiver se dividido, não injete após a injeção dos embriões, incube-os a 28 graus Celsius durante a noite no meio embrionário.

Após a incubação durante a noite, os embriões injetados estão prontos para montagem e imagem. Para iniciar esse procedimento, remova o corion dos embriões com pinças sob um microscópio estereoscópico uma hora antes do momento de interesse e prepare uma lâmina para montar até quatro embriões. Depois, encha o slide com 0,7% de aros até o topo do slide e espere cerca de 20 minutos ou até o aros solidificar.

Depois que o aros solidificar, faça um pequeno furo nos aeros usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para formar furos cilíndricos onde montar cada embrião. Remova os plugs aros com pinças antes de montar. Coloque os embriões sobre a lâmina preenchida com aeros sob um microscópio dissecante.

Adicione 50 microlitros de trica para anestesiar. Os embriões. Use pinças para orientar os embriões invertidos nos furos cilíndricos do aros, com o cérebro ou região de interesse contra a cobertura subjacente do deslizamento.

Os embriões na AGA subiram com outro deslizante de cobertura e se fixaram com graxa de vácuo de silicone. Os embriões já estão prontos para exame de imagem. Fotografe o embrião usando um microscópio confocal fluorescente invertido de varredura a laser, como mostrado aqui, ou uma imagem de microscópio confocal de disco giratório a 63 x ou mais para coletar imagens de alta resolução de células individuais dentro do neuroepitélio.

As imagens são exportadas como arquivos TIF do software LSM e analisadas usando Photoshop. Esta é uma imagem confocal representativa de um embrião de peixe-zebra de 24 horas, epitélio neuro entre o mesencéfalo e os ventrículos do cérebro posterior. M indica mesencéfalo, ventrículo, e H indica o ventrículo posterior.

Cada célula é marcada com GFPE ligada a membranas. Acabamos de demonstrar uma técnica que permite analisar o cérebro em desenvolvimento do peixe-zebra como resolução de célula única. Essa técnica nos permitiu estudar um novo tipo de mudança de forma celular chamada constrição basal BA.

Também poderia ser usado para analisar outros tipos de fenômenos e expandir significativamente nosso entendimento sobre a organogênese das vértebras, bem como sua biologia celular subjacente. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.