Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Este procedimento começa com a cultura da cepa de isca em meios contendo aminoácidos normais na cepa de controle SLAC e lisina isotópica pesada e arginina. Quantidades iguais de ambas as cepas são misturadas e lisadas por moagem e lisados brutos de nitrogênio líquido, primeiro peletizados por centrífuga e depois limpos por ligação a esferas de esferas. O lisado celular é então ligado a grânulos de IgG.

As proteínas ligadas aos grânulos de IgG são aludidas por protease, clivagem e precipitadas. A amostra está agora pronta para análise por espectrometria de massa. Olá, sou Jesse Chao, do Lone Lab do Departamento de Biologia Ambiental Celular do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica.

Hoje mostro um procedimento para análise proteômica quantitativa chamado silak. Combinado com purificação de afinidade. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar complexos de proteínas.

Então vamos começar Neste procedimento, a cepa de isca contém aminoácidos normais, enquanto a cepa de controle SLAC contém isotópicos pesados, lisina e arginina. Para começar, primeiro, cultive um litro, cada uma das cepas de isca e a cepa de controle separadamente para o valor mostrado na tela. Em seguida, despeje a cultura em tubos de centrífuga Nalgene de 500 mililitros.

Equilibre a carga nas células de pellets a 2.580 RCF, decantar o meio e ressuspender o pellet. Com 50 mililitros de D H2O frio enquanto transfere as células para 50 mililitros, tubos de centrífuga, centrifugue os tubos para pellet as células a 3000 RCF. Neste ponto, você pode congelar o pellet a 80 graus Celsius negativos.

É importante lembrar de combinar a cultura da cepa de controle com a cultura da cepa de isca em um a um por peso de pellet seco. Ressuspenda cada pellet celular em 10 mililitros de tampão NP 40 com um coquetel inibidor de protease de um a 2000. Misture as duas culturas de células decantando diretamente um tubo para o outro.

Para começar a moer as células primeiro, despeje nitrogênio líquido na argamassa pré-resfriada e deixe-a evaporar completamente. Em seguida, adicione dois mililitros de células à argamassa. Despeje um pouco de nitrogênio líquido para congelar as células.

Triture as células até que fiquem finas. Pó. Repita o processo até que todas as células estejam moídas. Certifique-se de não permitir que as células descongelem.

Adicione nitrogênio líquido quando necessário. Em seguida, transfira o pó para um copo gelado e descongele a temperatura ambiente. Quando as bordas começarem a descongelar, adicione 20 mililitros de tampão NP 40 com um a 200 PIC após o descongelamento.

Transferir o lisado bruto para tubos Nalgene de 40 mililitros e centrifugar a 16 000 RPM num rotor Sovos SA 600 durante 30 minutos. Enquanto espera, pegue 300 microlitros dos dois grânulos B SROs e lave os grânulos em 300 microlitros de tampão NP 40 três vezes. Em seguida, ressuspenda as esferas em tampões de 300 microlitros para que fiquem em uma pasta um-para-um.

O próximo passo é pré-limpar o lisado celular. Para fazer isso primeiro, transfira o super natin para um novo tubo e adicione as duas contas B do Spheros. Incube em uma plataforma giratória em uma câmara fria por 30 minutos.

Durante a incubação, pegue 300 microlitros de seis contas de IgG SROs e lave as contas em 300 microlitros de tampão NP 40 três vezes. Em seguida, ressuspenda os grânulos em tampões de 300 microlitros para que fiquem em uma pasta um-para-um. Após a incubação, peletizar os SROs.

Duas contas em. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Lembre-se de guardar uma alíquota do lisado celular para western blotting mais tarde.

Em seguida, adicione as contas IgG. Separe o conteúdo em dois tubos para uma ligação mais eficiente, incube em uma plataforma giratória em uma câmara fria por duas horas. Após a incubação, recolher as esferas numa coluna de cromatografia a quatro graus Celsius.

Certifique-se de salvar uma alíquota da facção não vinculada. Lave as contas com 10 mililitros. NP 40 tampão.

Em seguida, lave as contas com três mililitros. Buffer TEVC. Novamente, lembre-se de guardar uma alíquota das contas.

Isso refletirá a eficiência da ligação para eluir as contas. Primeiro, adicione cinco microlitros de A-C-T-E-V a um mililitro de tampão TEVC. Adicione o tampão TEVC às contas e misture.

Transfira o conteúdo para dois tubos EINOR de 1,5 mililitro de uma mistura mais eficiente e incube em uma plataforma rotativa em uma câmara fria durante a noite. Em seguida, gire as contas e transfira o eluído para um novo tubo de 1,5 mililitro. Lave as contas com 0.5 mililitros adicionais de tampão TEVC após a lavagem.

Combine os oito em um tubo. Você deve ter 1,5 mililitros de ELU oito no total. Guarde uma alíquota do TEV Elu oito para precipitar.

Ajuste as alíquotas para 25% TCA com cem por cento de TCA. Para fazer isso, separe o LU oito de 1,5 mililitro em dois tubos de 750 microlitros cada. Adicione 250 microlitros de 100% de TCA ao tubo.

Sua solução deve ficar leitosa. Em seguida, coloque-o no gelo por 30 minutos. Periodicamente vórtice da mistura após a incubação.

Gire na velocidade máxima na centrífuga de mesa em uma câmara fria por 30 minutos. Lave uma vez com 500 microlitros de acetona gelada contendo 0,05 de ácido clorídrico normal. Em seguida, gire por cinco minutos na velocidade máxima a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave uma vez com 500 microlitros de gelo frio, acetona e centrifugue por cinco minutos a uma velocidade máxima de quatro graus Celsius. Depois de girar, remova cuidadosamente a acetona e o pellet seco para manchar a prata. Ressuspenda o pellet em 50 microlitros de uma vez o tampão de amostra SDS.

Se você planeja usar a proteína precipitada para análise baseada em espectrometria de massa, é recomendável precipitar usando etanol. Para fazer isso primeiro, adicione 20 microgramas de glicogênio, depois dilua as amostras cinco vezes com cem por cento de etanol e ajuste para 50 milimolares de bicarbonato de sódio com um estoque de 2,5 molares em pH 5,0. Misturar a solução invertendo o tubo.

Deixe repousar por duas horas em temperatura ambiente. Por fim, divida o conteúdo em dois tubos einor. Granular a proteína precipitada por centrifugação durante 10 minutos a 12 000 GS à temperatura ambiente.

A alíquota salva durante o procedimento de purificação deve incluir o lisado celular pré-limpo, a fração ligada, a fração não ligada e a fração evasiva. Recomendamos analisar o conteúdo proteico das alíquotas acima por Western blotting usando anticorpo Antit TAP ou coloração de prata para refletir a eficiência de ligação e eluição do experimento. Neste gel de coloração de prata purificado SCS dois toques em sua interação, os parceiros foram visualizados e comparados a um controle não marcado neste Western blot.

Várias facções tomadas durante a purificação do SCS two tap foram analisadas por Western blotting usando o anticorpo Antit tap. Observe que o SCS dois tap migrou a um peso molecular mais baixo após o elucian pela clivagem da protease TEV, e não houve S SCS dois tap restantes nas esferas de IgG após a eluição. Isso confirmou que a purificação era altamente eficiente.

Acabamos de mostrar como purificar complexos de proteínas por purificação por afinidade com grânulos de IgG. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de combinar a tensão de base e a tensão de controle pelo peso da película seca antes de iniciar o procedimento de purificação. Como o LAC nos fornece medições imparciais e em fila de parceiros de ligação a proteínas, realizamos apenas o primeiro estágio da purificação da torneira para minimizar a perda de amostra.

Se você experimentar quantidades significativas de ligações inespecíficas, você pode querer realizar todo o protocolo, que pode ser encontrado no manual do porto de molas frias. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

Ei, vamos lá, Mark. Ah, vá.