Name: Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Aprenda a técnica de imagem de cálcio em músculo liso utilizando microscopia confocal de alta resolução. Este método permite analisar eventos de sinalização de cálcio em órgãos isolados como a bexiga urinária.

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Wellcome Trust forneceu apoio financeiro (Prêmio VIP para JSY e 074128 Bolsa de Investigação para KLB). Conselho de Pesquisa Médica Studentship para RJA Leica_SP2_Stacker, um algoritmo usado para importar TIFFs para &#39;reconstrução&#39; em uma série, é baseado em Leica_tiff_sequence, um plugin para ler Leica SP2 TIFFs no ImageJ, desenvolvido por Tony Collins e usado com sua permissão. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg e TurboReg, algoritmos utilizados para corrigir o movimento do tecido, são baseados em Th venaz e colegas (1998) 9. Excel_writer.jar foi escrito por Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, o algoritmo de detecção de partículas, é baseado em um algoritmo escrito por Cérebro KL e detalhado anteriormente 5.

Parte 1: Preparação do Ca 2 + indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00) <ol><li> Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 vem em frascos de 500 mL de uma pequena quantidade (50 mg) de pó. Adicionar 40 mL PLURONIC F-127 solução para o pó, agitando suavemente durante 30 s, em seguida, adicione 460 mL PSS, e agitar suavemente por 30 s. A solução final, 10 mM Oregon Verde 488 BAPTA-01:00, fornece 4 x 125 mL alíquotas. Evitar a exposição à luz e armazenar a -20 C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carga <ol><li> Remover o Ca 2 + indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00) a partir do freezer (-20 C) e deixar descongelar em temperatura ambiente. </li><li> Tomar 1 ml de PSS em um tubo de ensaio e coloque em banho-maria. Bolha com 95% O 2 / 5% CO 2 a uma taxa de cerca de 1 bolha aparecendo por segundo. O borbulhador precisa ser protegido em tubo de ensaio, por exemplo, com uma rolha ou com Parafilm. </li><li> Dissecar os tecidos do animal e, em uma placa de Petri Sylgard-alinhado, remova cuidadosamente tecido conjuntivo. Independentemente do tipo de músculo liso do órgão, PSS deve ser substituído a cada 10 minutos e tecidos devem ser bem lavados (por exemplo, substituindo o PSS três vezes) dissecção seguinte. Para o canal deferente: considerar cortar o órgão de comprimento maneiras de produzir uma folha de tecido. Para a bexiga urinária: aberto longitudinalmente a partir do colo da bexiga (posterior) para o topo da cúpula (anterior). Prepare quatro tiras, 6-8 mm de comprimento e 1-2 mm de largura, ao longo da superfície dorsal do detrusor, o corte na direção dos feixes musculares dominante. </li><li> Lugar dissecados tecido na &quot;pré-aquecida e com bolhas &#39;PSS. </li><li> Adicionar 125 mL de 10 mM Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 de tubo de ensaio e dar um pouco agitação, à mão, para misturar. </li><li> Retomar a borbulhar e deixe, coberto com papel alumínio. O tempo necessário para o tecido suficiente para assumir o Ca 2 + indicador varia de acordo com o tamanho do tecido ea espessura da camada de músculo liso. Por exemplo: 70 mins (mouse detrusor, anococcygeus rato) a 120 minutos (detrusor de rato vas, deferente do rato). </li></ol> Parte 3: Preparando o &#39;Ca 2 + carregado&#39; de tecidos para microscopia Cuidado pinagem do tecido é necessário para minimizar o movimento espontâneo do tecido (a propriedade de imagem de células musculares lisas do tecido relativamente intacta) e para facilitar a localização de um local adequado para geração de imagens (como um pedaço de tecido pode ser pesquisados ​​em duas dimensões, em vez de três). <ol><li> Lave o tecido em PSS borbulhava por pelo menos 5 minutos. </li><li> Montagem em Sylgard alinhadas prato preparação, alongamento do tecido (um pouco) para formar uma folha plana. Evite a utilização de &#39;pins&#39; que podem riscar o objetivo, uso comprimentos curtos, em vez de 25-50 fio de prata mM diâmetro como &#39;pinos&#39; e inserir em um ângulo. </li><li> Posicione o prato preparação no estágio do microscópio, tomando cuidado para assegurar que o PSS não escapa da área Sylgard-alinhados do prato (como isso pode levar a uma grande área a ser coberta no PSS, quando o superfusão começa). </li><li> Ligue a bomba, a fim de superfuse a preparação com PSS. A taxa de 100 ml por hora é freqüentemente empregada. </li><li> Ligar o aparelho aquecedor. </li><li> Coloque os tubos de entrada e saída e sonda de temperatura no prato preparação (aposição cada um para a tira de metal pelo ímã em sua base). A altura da ponta do tubo de saída irá determinar a profundidade do PSS. Tenha cuidado para garantir que a saída é realmente remover PSS (como às vezes não inicialmente). </li><li> Regule a temperatura do aquecedor na unidade para atingir a temperatura desejada, por exemplo, 33-35 C. </li><li> Permitir que o tecido a estabilizar durante pelo menos 10 minutos. </li></ol> Parte 4: Selecção do local para a imagem Exposição à iluminação de excitação vai photobleach o indicador, portanto evite usar por mais de alguns segundos de cada vez. <ol><li> Com um objectivo de baixa potência (10x ou 20x) uso de epifluorescência, emocionante, com uma luz azul, para ver o músculo liso e identificar uma região adequada para monitor. Tente escolher um site baseado em: movimento (que deve ser mínima) eo número de células musculares lisas no campo. &quot;Estruturas&quot; brilhante pode causar um elevado número de &quot;falsos positivos&quot; no algoritmo de detecção de imagem, de modo a evitar sites com grande número de (ex) intercaladas células epiteliais ou fibroblastos. </li><li> Mudar para um objetivo maior potência (40x). </li><li> Gire o palco ou o eixo óptico para que a célula muscular lisa (s) está horizontal (paralela ao eixo ie varredura rápida). </li></ol> Parte 5: A microscopia confocal Os detalhes de como o microscópio confocal é &#39;set up&#39; são específicos para cada tipo de microscópio, masas principais considerações são: velocidade (mínimo de 5 Hz é necessária para a maioria dos transientes de Ca 2 +), a resolução e tamanho de campo (os quais são negociados-off com a velocidade). Alguns dos seguinte protocolo é específico para um SP2 Leica microscópio confocal ereta. Um protocolo típico é: 100 séries de quadros, adquiridos a 5 Hz (256 x 256 pixels; aproximadamente 100 x 100 mm.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; aprox 100 x 25 mm.). A cabeça de leitura definido para mover bi-direcional (para maximizar a velocidade de aquisição) e adquirir a 1000 Hz por linha. <ol><li> Fechar o pinhole para um &quot;disco arejado. </li><li> Definir a potência do laser (488 nm) entre 25 e 35% sobre o AOTF; este valor é um trade-off entre o brilho eo fotobranqueamento. (O último a ser um problema em particular durante as gravações de comprimento.) </li><li> Adquirir seis séries por site, e 4-6 sítios por &#39;tratamento&#39;. É comum a finalidade de monitorar os mesmos seis sítios pré-droga (&quot;controle&quot;, por exemplo) e pós-droga, embora fotobranqueamento significativas pode causar o experimentador a desviar-se disso. </li><li> É essencial com Ca 2 + imagem que &quot;controla o tempo&quot; são executadas. </li></ol> Parte 6: Preparação para a análise <ol><li> Baixe e instale J Imagem de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Baixe a versão específica da plataforma, e então atualizar para a versão mais recente baixando o arquivo mais recente imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, substituindo o arquivo antigo. Utilizadores da Apple Mac: se ele é executado lentamente, certifique-se que você está usando a versão mais recente do Java Virtual Machine (JVM) disponível a partir de Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Download Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar na Plugins [diretório] diretório jar&gt;. </li><li> Copie os seguintes arquivos no diretório Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada um desses scripts usando o Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Instale ... função do ImageJ. </li><li> Nós usamos uma Leica SP2 microscópio confocal, o software (Leica LCS) para que gera cada série como um único &quot;filme&quot; visível dentro do software, mas economiza como quadros individuais. Para reconstruir quadros em série: (i) Certifique-se que todos os &#39;frames&#39; de ser reconstruído estão em uma única pasta (por exemplo &#39;DataFolder&gt; Tiffs&#39;). (Ii) Selecione Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Selecione o diretório raiz (por exemplo &#39;DataFolder&#39;). Selecione a pasta desejada na lista drop-down (&quot;Tiffs / &#39;, por exemplo). Selecione um diretório de saída ou gerar uma nova (&quot;DataFolder&gt; Stacks &#39;, por exemplo). O script será então reconstruir série de quadros individuais. </li></ol> Parte 7: Correção para o movimento Embora o movimento do site com imagens podem ser minimizados com a fixação boa e tecido uniformemente esticada, alguns órgãos do músculo liso apresentam contrações espontâneas que não pode ser abolido pelo cuidado pinagem sozinho. Aqui nós descrevemos o uso de um algoritmo livremente disponível que alinha ou fósforos frames dentro de uma série. <ol><li> Download &#39;StackReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e&#39; TurboReg&quot; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Instale cada um para o diretório Plugins utilizando o Plugins&gt; Macros&gt; Instale ... </li><li> Coloque uma pilha para ser processado (File&gt; Open ...) e depois passar para um quadro que mostra claramente o campo de interesse. Outros quadros serão alinhados a este quadro de referência. </li><li> Plugins&gt; Pilhas&gt; StackReg. Tente cada um dos diferentes &quot;Transformações&quot; (tradução, corpo rígido, rotação Scaled, Affine) para determinar o que é mais eficaz. (Mais detalhes: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo de detecção de partículas Para cada &#39;site&#39; com imagens, os fatores variarão que afetam a detecção de transientes de Ca 2 +. Ao medir certas propriedades de cada site (&quot;parâmetros de partículas&quot; - abaixo detalhada), o processo de detecção é facilitada. Assim, para cada local, calcula-se &quot;limite para subtraído&quot;, &quot;limite para a relação&quot; e &quot;limiar limite da célula. <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Instalar ... e selecione &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macros pilha de carga&gt; (atalho: l). Selecionar uma série de partículas e calcular parâmetros: <ol style="list-style:none;"><li> a. Limiar para subtraído (fundo =) </li></ol></li><li> Selecione um ROI retangular sobre o que você acredita ser &#39;background&#39;. </li><li> Medida (atalho: m). Anote MEAN. <ol style="list-style:none;"><li> b. Limite de cálculo para o rácio </li></ol></li><li> Selecione um retangularROI em torno de uma área plana opticamente da célula (s). </li><li> Medida (atalho: m). Nota DESVIO baixo médio e padrão. </li><li> Repita mais duas vezes, ou você pode desenhar três caixas de uma vez pressionando &#39;Shift&#39;. </li><li> Calcular e anotar limite para a relação = (1 + SD / média) x 32, com média de valores das três repetições / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Limiar limite da célula </li></ol></li><li> Image&gt; Pilhas&gt; Z projeto ... Escolha o tipo de projeção: &#39;intensidade média&#39; </li><li> Image&gt; Adjust&gt; Limiar. </li><li> Selecione em preto e branco. </li><li> Definir &quot;em&quot; (barra superior) limite e anotar o valor correspondente (à direita da barra). Apenas os eventos que ocorrem nas regiões negras serão contadas. </li><li> Clique em &#39;reset&#39;. </li><li> Analisar stacks (atalho: 2) </li><li> Selecionar apenas uma série nesta fase, ou seja, o arquivo &#39;primeiro&#39; e &#39;último arquivo &quot;deve ser o mesmo. </li><li> Digite os valores de &#39;limiar para subtraído &quot;,&quot; limite para a relação &quot;e&quot; limiar limite da célula. Deixe as outras configurações em seus valores padrão. </li><li> O algoritmo produz uma vidraça dupla em que a série processada é mostrado à esquerda eo original do lado direito. Cuidado passar por isso para avaliar o número de falsos positivos e as ocasiões em que os eventos, visível a olho nu, não foram detectados. Para obter uma maior precisão na detecção de transientes de Ca 2 +, pode ser necessário ajustar ligeiramente alguns dos &quot;parâmetros de partículas&quot;. Embora o processo pode parecer um pouco &#39;bater e perder &quot;na primeira tentativa, rapidamente fica uma sensação como a que parâmetros são fundamentais. </li><li> Para cada série, o algoritmo produz um arquivo de Excel que detalha características do evento detectado (como área de amplitude, e posição). &quot;Falsos positivos&quot; - identificado por revisar os arquivos de imagem que as saídas de algoritmo (por exemplo, passo 8.17) - pode ser afastado, à mão, a partir deste ficheiro Excel. </li></ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados eo seu sofrimento, todos os experimentos foram realizados de acordo com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e Comunidades Europeias Directiva do Conselho 86/09/EEC.

Escolha de fluorescentes Ca 2 + indicador Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 foi escolhido como o Ca 2 + indicador porque (i) é brilhante em comparação com outros indicadores (por exemplo, Fluo-4 e Verde de cálcio) 1, (ii) é sensível a mudanças fisiológicas na concentração de Ca 2 + com um d K de magnitude similar 1 para o Ca 2 + intracelular concentração [Ca 2 +] i (por exemplo, de canais deferentes 2), (iii) carrega muitas células do músculo liso, permitindo que células do músculo liso de acoplamento a ser monitorado. No entanto, Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 é um não-ratioable Ca 2 + indicador, e como tal não pode ser facilmente utilizado para determinar o absoluto [Ca 2 +] i. Além disso, pode também buffer de Ca 2 + se presente em altas concentrações e torna-se saturado com mudanças na amplitude de alta [Ca 2 +] i. Inibição da contratilidade espontânea A contratilidade espontânea de órgãos do músculo liso podem ser reduzidos farmacologicamente, como através do bloqueio da movimentação de Ca 2 + através de L-type Ca 2 + canais (por exemplo: nifedipina 3; diltiazem 4). Note-se que estas drogas irá reduzir muito a amplitude de toda célula Ca 2 + flashes / transientes. Contração dos vasos deferentes resulta de uma combinação de neurotransmissão principalmente purinérgicos e noradrenérgicos. Focal Ca 2 + transientes neste tecido são, no entanto, insensível ao bloqueio dos receptores noradrenérgicos (por exemplo, α adrenoceptor 1, por prazosin 5) para o movimento pode ser reduzida sem afetar focal Ca 2 + transientes. Alternativamente, a contração pode ser impedido &quot;a jusante&quot; através da inibição da miosina quinase de cadeia leve por exemplo, por wortmannin 6. Conclusões Monitoramento Ca 2 + fluorescência em submicron resolução é uma técnica poderosa para estudar os efeitos pós-juncional da liberação de neurotransmissores 5,7 e liberação de Ca 2 + das lojas internas (por exemplo, &quot;faíscas&quot; 8). A análise dos transientes de Ca 2 + utilizando a metodologia descrita aqui é custo-efetiva em comparação com comercialmente disponíveis pacotes de análise de imagem e permite tailor-made análise através de plugins personalizados escritos em Java para ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Solução de Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>solução a 20% em DMSO</td></tr><tr><td>Microscópio confocal ereto Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesa de ar (&amp;#8216;estação de trabalho isolada de vibrações&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>elastómero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

focal ca 2 + detecção de transitórios no músculo liso

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca 2 + imagens do músculo liso fornece insights sobre os mecanismos celulares que podem não resultar em mudanças de potencial de membrana, como a liberação de Ca 2 + das lojas internas, e permite que várias células para ser monitorados simultaneamente para avaliar, por exemplo, o acoplamento em tecido sincicial. Subcelulares Ca 2 + transientes são comuns no músculo liso, mas são difíceis de medir com precisão, devido aos problemas causados ​​pela sua ocorrência estocástica, sobre um campo de visão amplo, muitas vezes, em um órgão que propensos a contrair. Para ultrapassar este problema, temos desenvolvido uma série de protocolos de imagem e rotinas de análise de adquirir e, em seguida, analisar, de forma automatizada, a localização, freqüência e amplitude de tais eventos. Embora essa abordagem pode ser aplicada em outros contextos, o nosso próprio trabalho envolve a detecção de locais purinérgicos Ca 2 + transitórios para a localização de liberação do transmissor com resolução submicron. ATP é liberado como um cotransmitter de nervos autônomos, onde se liga a receptores P2X1 sobre o músculo liso do detrusor e canal deferente. Ca 2 + entra no músculo liso, resultando em purinérgicos Neuroefetora Ca 2 + transientes (NSTI). A focal Ca 2 + transientes permitam o monitoramento óptico da liberação de neurotransmissores de uma forma que tem muitas vantagens sobre eletrofisiologia. Além da resolução espacial muito melhorada, a gravação óptica tem a vantagem adicional de permitir a gravação da liberação do transmissor de muitos locais distintos simultaneamente. Além disso, o plano óptico de foco é mais fácil de manter ou corrigir durante a gravação longa série que é o reposicionamento de um microeletrodo intracelular afiada. Em resumo, um método para geração de imagens de Ca 2 + fluorescência é descrito que detalha a preparação do tecido, e na aquisição e análise de dados. Destacamos o uso de vários scripts para a análise de Ca 2 +, tais transientes.

Detalhes métodos de alta resolução Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Imagem do músculo liso dentro órgãos isolados, incluindo: preparação do tecido de aquisição de imagem e análise de dados.

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

O imageamento de Ca2+ em músculo liso fornece informações sobre mecanismos celulares que podem não resultar em alterações do potencial de membrana, como a liberação de Ca2+ ...

Primeiro, uma solução de carregamento de cálcio é preparada, aquecida e borbulhada. A bexiga urinária é dissecada, aberta, fixada em posição plana e uma tira de detrusor é retirada. A tira de detrusor é adicionada à solução de carregamento, incubada e lavada, depois fixada em posição plana.O nível de cálcio quatro no interior do tecido é excitado por luz laser e a luz emitida resultante é capturada. Filmes compostos por quadros individuais são analisados mediante comparação de quadros sucessivos. O fundo é subtraído.O limiar da borda celular determina onde os eventos podem ser encontrados e é feita uma razão entre cérebros sucessivos. Se os eventos restantes corresponderem a critérios predefinidos, eles são destacados e rotulados. Olá, meu nome é John Young dos laboratórios de Keith Brain e Tom Kinane no Departamento de Farmacologia, Universidade de Oxford.Sou Rob Amos, também dos laboratórios Brain e Canne, e meu nome é Keith Brain. Hoje, John e Rob mostrarão uma técnica de imagem de cálcio em músculo liso. Utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar a liberação de neurotransmissores a partir de nervos autônomos e seu efeito sobre o músculo liso.Então vamos começar. O indicador de cálcio organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM é fornecido em frascos de 500 microlitros contendo 50 microgramas de pó. Para preparar o indicador de cálcio, adicione 40 microlitros de solução Onic F1 27 ao pó e agite suavemente por 30 segundos; em seguida, adicione 460 microlitros de solução salina fisiológica (PSS) e agite suavemente por mais 30 segundos.A solução final, 10 micromolares de organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fornece quatro alíquotas de 125 microlitros cada. Evite a exposição à luz e armazene a solução a menos 20 graus Celsius antes de dissecar o tecido de interesse.Retire o indicador de cálcio do congelador e deixe descongelar em temperatura ambiente enquanto o indicador de cálcio estiver fino. Coloque um mililitro de PSS em um tubo de ensaio e em um banho-maria a 33 graus Celsius. Prenda um borbulhador no tubo de ensaio com uma rolha, ou você também pode usar perfil e, em seguida, borbulhe com uma mistura de 95%oxigênio e 5%dióxido de carbono a uma taxa de aproximadamente uma bolha por segundo.Disseque o órgão de músculo liso do animal. Neste caso, é a bexiga urinária de um camundongo. Coloque o órgão em cerca de 50 milímetros de PSS para lavá-lo; após a lavagem cuidadosa do tecido, remova o tecido adiposo ciero e o tecido conjuntivo.Disseque abrindo de acordo com o tipo laureano de músculo liso para a bexiga urinária. Abra longitudinalmente desde o colo da bexiga, da extremidade caudal até o topo da cúpula. Na extremidade cranial, prepare quatro tiras, com seis a oito milímetros de comprimento e um a dois milímetros de largura, ao longo da superfície dorsal do resser, cortando na direção dos feixes musculares predominantes.Coloque o tecido dissecado e a PSS pré-aquecida e borbulhada para carregar o indicador de cálcio com 125 microlitros de organ green 10 micromolar, 4 88 B às 1:00 da manhã no tecido no tubo de ensaio e agite levemente à mão para misturar. Devolva o tubo ao banho-maria. Retome a borbulhação e cubra o banho-maria com uma folha de papel alumínio.O tempo necessário para que o tecido absorva uma quantidade suficiente do indicador de cálcio varia conforme o tamanho do tecido e a espessura da camada muscular lisa. Por exemplo, para o detrusor de camundongo e oxs de rato, são 70 minutos. Já para o detrusor de rato e VAs deens de camundongo, incubamos por 120 minutos.Uma vez que o tecido tenha sido carregado com o indicador de cálcio, ele pode ser preparado para microscopia. Primeiro, lave o tecido em PSS borbulhado por 10 minutos. Em seguida, monte o tecido em um recipiente de preparação forrado com grade S.Estique levemente para formar uma lâmina plana. Prenda o tecido usando pequenos comprimentos, por exemplo, dois milímetros de fio de prata com diâmetro de 25 a 50 micrômetros, e insira os pinos em um ângulo.Evite usar pinos com mais de alguns milímetros de comprimento, pois eles podem arranhar a objetiva. O posicionamento cuidadoso dos pinos no tecido é importante para minimizar movimentos espontâneos do tecido e facilitar a localização de um local apropriado para a aquisição de imagens. Após o tecido ter sido fixado com pinos, posicione o recipiente de preparação na platina do microscópio.Atenção para que o PSS não escape da área forrada com sil guard da placa. Isso pode fazer com que uma grande área seja coberta por PSS. Quando a superfusão começar para fins de demonstração, os seguintes passos serão realizados sob luz visível.Observe que esses experimentos normalmente são realizados no escuro. Ligue a bomba para superperfundir o preparo. Com PSS, uma taxa de 100 mililitros por hora é frequentemente utilizada.Ligue a unidade de aquecimento, coloque os tubos de entrada e saída e a sonda de temperatura sobre o prato de preparação, fixando cada um à tira metálica por meio do ímã em sua base. A altura da extremidade do tubo de saída determinará a profundidade da PSS. Tenha cuidado para garantir que o fluxo de saída esteja realmente removendo a PSS, pois às vezes isso não ocorre.Defina inicialmente a temperatura na unidade de aquecimento para atingir a temperatura desejada entre 33 e 35 graus Celsius. Deixe o tecido equilibrar por pelo menos 10 minutos com uma objetiva de baixa potência. 10 ou 20 vezes.Utilize fluorescência epi ou excite com luz azul para visualizar o músculo liso e identificar uma região adequada para monitoramento. Como a exposição à iluminação de excitação provocará fotobranqueamento do indicador, evite usá-la por mais de alguns segundos por vez.Evite áreas com estruturas brilhantes, pois elas podem causar um alto número de falsos positivos no algoritmo de detecção de imagem. Tente escolher um local com movimento mínimo e um grande número de células musculares lisas no campo. Após selecionar o local para imagem, mude para uma objetiva de maior aumento, como a de 40 x.Gire o estágio ou o eixo óptico para que a célula ou as células musculares lisas fiquem na posição horizontal, ou seja, paralelas ao eixo de varredura rápida. As células musculares lisas estão agora prontas para serem imagiadas por microscopia confocal.Neste protocolo, utilizamos um microscópio confocal ereto Leica SP dois. Feche o diafragma até um disco airy. Ajuste a potência do laser entre 25 e 35% no filtro óptico personalizável.Esse valor representa um compromisso entre brilho e fotodesvanecimento. Para preparar a análise de dados, baixe e instale o ImageJ. Baixe a versão específica para sua plataforma e, em seguida, atualize para a versão mais recente baixando o arquivo jar mais recente do ImageJ para substituir o arquivo antigo. Em seguida, baixe o arquivo jar do Excel Writer e instale-o no diretório de plugins jar.Copie esses arquivos no diretório de plugins. Instale cada um desses scripts usando as macros de plugins. Instale a função do ImageJ. O software para o microscópio confocal Leica SP2 que utilizamos chamado Leica.O LCS salva quadros individuais de cada série como arquivos separados. Para reconstruir a série, certifique-se de que todos os quadros a serem reconstruídos estejam em uma única pasta.Por exemplo, pasta de dados tiffs. Em seguida, selecione o macro Leica SP two stacker no menu plugins macros. Selecione o diretório raiz, neste caso a pasta de dados.Selecione a pasta desejada na lista suspensa. Neste caso, tiffs selecione um diretório de saída ou gere um novo. Por exemplo, pastas de dados em pilha.O script então reconstruirá a série a partir de quadros individuais para corrigir o movimento. Utilizamos um algoritmo de acesso livre que alinha ou combina quadros dentro de uma pilha de séries baixadas, rig e turbo reg. Copie os arquivos de cada um para a pasta stacks.Carregue uma pilha a ser processada e, em seguida, vá para um quadro que mostre claramente o campo de interesse. Os demais quadros serão alinhados a esse quadro de referência. Depois disso, vá para plugins pilhas.Aplicar Reg. de Empilhamento. Testar cada uma das diferentes transformações para determinar qual é a mais eficaz para cada local. Os fatores de imagem que afetam a detecção de transientes de cálcio variarão conforme a medição de certas propriedades, parâmetros de partículas de cada local.A sensibilidade e a especificidade da detecção são aumentadas. Assim, para cada local, calcularemos o limiar subtraído do limiar da razão e o limiar da borda celular. Para começar, vá até plugins, macros, instale e selecione jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Em seguida, vá até plugins macros carregar pilha.Selecione uma série e calcule os seguintes parâmetros das partículas. Para calcular o limiar para subtração, selecione uma região retangular de interesse sobre o que você considera ser a medida de fundo. Anote a média. Para calcular o limiar para a razão, selecione uma região retangular de interesse ao redor de uma área opticamente plana da célula ou das células musculares lisas.Meça a nota e anote a média e o desvio padrão. Repita o processo mais duas vezes, ou você pode desenhar três caixas de uma vez pressionando shift. Calcule e anote o limiar para a razão.Calcule como o desvio padrão dividido pela média, some um e então multiplique o resultado por 32. Fazendo a média dos valores das três réplicas, o fator 32 é necessário para levar em conta o algoritmo de razão, no qual nenhuma alteração em relação ao quadro anterior é mapeada para um valor inteiro de 32. Isso fornece uma boa faixa dinâmica para detectar aumentos e diminuições na razão.Para uma imagem de oito bits, selecione ajuste de imagem e limite. Selecione preto e branco. Defina abaixo do limite deslizante superior e anote o valor correspondente.Isso está à direita do controle deslizante. Apenas eventos que ocorrem nas regiões pretas serão contabilizados. Clique em redefinir.Agora que o limiar subtraído para a razão e o limiar da borda da célula foram calculados, podemos analisar as pilhas de imagens. Determine a localização das pilhas a serem analisadas. Selecione apenas uma série nesta etapa.Esse é o primeiro arquivo, e o último arquivo deve ser o mesmo. Em seguida, selecione um local para a saída dos arquivos de dados e pilhas. Por exemplo, pasta de saída de dados.Insira os valores de limite para subtrair o limite da razão e o limite da borda da célula. Mantenha as outras configurações em seus valores padrão. O algoritmo gerará uma janela com dois painéis, na qual a série processada é exibida à esquerda e a original à direita.Abra este arquivo a partir da pasta de saída e examine-o cuidadosamente para avaliar o número de falsos positivos e as ocasiões em que eventos visíveis a olho nu não foram detectados. Para cada série, o algoritmo produz um arquivo Excel que detalha características dos eventos detectados, como amplitude, área e posição. Falsos positivos identificados ao revisar os arquivos de imagem gerados pelo algoritmo podem ser removidos manualmente deste arquivo Excel, embora você deva ter critérios rigorosos para fazê-lo.Este é um vídeo da transitoriedade do cálcio no músculo liso. Neste exemplo, o vídeo é composto por 100 quadros individuais adquiridos a cinco hertz. Adquiriríamos muitos desses vídeos por experimento ao investigar, por exemplo, o efeito de uma droga específica na frequência do transiente de cálcio.Aqui observamos inúmeros transientes espontâneos de cálcio nas células musculares lisas. O resultado do algoritmo de detecção de partículas é mostrado aqui. Para cada série, o algoritmo produz um arquivo Excel que detalha as características do evento detectado, como amplitude, área e posição.Portanto, demonstramos um método para a aquisição de imagens de transientes de cálcio em órgãos musculares lisos, como a bexiga urinária, e mostramos uma maneira de analisar esses transientes de cálcio utilizando um algoritmo desenvolvido em nosso laboratório. Os pontos importantes a serem lembrados são preparar bem o tecido para a aquisição de imagens de cálcio. No caso do tecido que demonstramos hoje, isso significa remover o tecido conjuntivo e toda gordura que possa obstruir o campo.Também é importante fixar o tecido em uma lâmina plana. Bom sucesso em seus experimentos e obrigado por assistir.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

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A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares.  Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

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Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

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