Transplante de lente em Zebrafish e sua Aplicação na Análise de Mutantes Eye

Para iniciar o transplante de lentes em peixes-zebra, doadores transgênicos que expressam GFP e hospedeiros receptores selvagens são primeiramente incubados por 30 minutos em placas de Petri separadas contendo solução de Ringer para peixe-zebra sem cálcio. As larvas de peixe são então embutidas em duas linhas paralelas em agarose de ponto de fusão baixa. Uma linha A é para os doadores e a outra B para os hospedeiros. O olho inteiro do doador é removido, enquanto apenas a lente é removida do hospedeiro.

Os tecidos ao redor da lente doadora são removidos antes de colocar a lente no olho do hospedeiro. Após o transplante, os peixes são armazenados em placas de 24 poços rotuladas. A lente transplantada deve exibir fluorescência GFP no hospedeiro.

Naturalmente, o olho contralateral do hospedeiro não foi operado e não expressa GFP. Olá, sou Yj. E eu sou Kaya McCullough, e somos do laboratório da Dra. Yma Maki do Departamento de Oftalmologia da Escola de Medicina de Harvard. Hoje vamos mostrar um procedimento de transplante de cristalino em peixes-zebra selvagens do tipo Daniel Rio.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para transplantar lentes de animais selvagens para mutantes e vice-versa. Isso nos permite determinar se os genes mutantes funcionam de maneira autônoma ou não autônoma na lente. Então, vamos começar.

As linhagens de peixe-zebra são mantidas em condições padrão de instalação para peixes, a 28,5 graus C, em um ciclo de 14 horas de luz e 10 horas de escuro. Na noite anterior ao experimento planejado, coloque machos e fêmeas em um tanque com um divisor para separá-los uns dos outros. O genótipo desses peixes deve gerar descendentes com expressão de GFP e qualquer mutação de interesse. Em paralelo, utilize o mesmo procedimento para montar cruzamentos entre animais selvagens não transgênicos dentro de uma hora.

Após a luz acender pela manhã, remova os divisores para permitir que os peixes acasalem. Após 15 a 30 minutos, despeje a água do aquário em uma peneira para coletar os embriões e, em seguida, lave-os com um jato de água para ovos proveniente de uma pipeta lavadora para dentro de uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros. Em seguida, limpe os ovos pipetando o detrito presente nos embriões fertilizados e em qualquer debris.

Substitua a água velha de ovos por água nova de ovos. Os embriões podem ser armazenados em uma incubadora a 28,5 °C antes do transplante da lente. Quando estiver pronto para prosseguir com o transplante, prepare os embriões removendo manualmente o corion.

Com uma sonda metálica e um par de pinças, os embriões descamados devem agora ser incubados em EDTA 0,2% em ZFR livre de cálcio por 30 minutos. Durante a incubação, podem ser preparadas as agulhas necessárias para a dissecação. O procedimento de transplante requer uma agulha afiada para cortar os tecidos ao redor da lente e embriões Woolies de agros.

Também é necessário uma agulha romba para mover a lente doadora e inseri-la no hospedeiro, fazendo com que a agulha primeiro corte a ponta de uma pipeta de Pasteur usando uma lâmina de diamante. Em seguida, insira uma capilar de vidro na ponta da pipeta de Pasteur de modo que cerca da metade de seu comprimento fique dentro dela. Insira cuidadosamente um fino fio de tungstênio na extremidade aberta da capilar usando uma chama.

Derreta o vidro sobre o fio com pinças, segurando firmemente a extremidade do vidro com um fio metálico enquanto gira a outra extremidade da agulha. O vidro amolecido deve enrolar-se em espiral ao redor do metal, fixando-o no lugar. Isso cria uma agulha romba para produzir uma agulha afiada.

Mantenha o fio de tungstênio sobre uma chama por um a 1,5 minutos, queimando o metal, de modo que uma ponta muito fina seja criada. Verifique a qualidade da ponta por microscopia.

Uma boa ponta não deve dobrar nem curvar e deve afinar-se suavemente até um ponto fino, com diâmetro não superior a 50 micrômetros. Esterilize ambas as agulhas na chama por alguns segundos e deixe-as esfriar antes de iniciar o procedimento. Em um tubo plástico de centrífuga, prepare 1,2% de agarose de ponto de fusão baixa e ZFR livre de cálcio pré-aquecidos a 40 graus Celsius em banho-maria, no estágio desejado. Aspire os embriões doadores com uma pipeta de Pasteur e expulse-os lentamente no tubo de centrífuga contendo a agarose. Incube os ovos na agarose por cerca de cinco segundos.

Remova os embriões com a pipeta e organize-os em uma fileira sobre uma placa de Petri de cem milímetros de poliestireno pipetando lentamente e com cuidado; a maioria dos embriões ficará de lado, com o olho voltado para cima. Repita agora este processo com os ovos receptores e organize-os em uma fileira paralela aos ovos doadores antes de a agrosa solidificar. Utilize a agulha romba para girar quaisquer embriões com orientação inadequada, de modo que o olho fique voltado para cima quando a agrosa tiver solidificado.

Cubra com uma solução de aro de ponto de fusão baixo a 0,2%. Usando uma agulha afiada, remova os aros ao redor dos olhos e corte com muito cuidado todo o olho doador, que flutuará. Em seguida, libere a lente do olho.

Isso é feito arrastando a agulha através do tecido ocular de baixo para cima. Apenas para o hospedeiro. A lente é cortada usando movimentos pequenos com uma agulha afiada, cortando o mais próximo possível da lente sem rasgá-la.

Evite remover muito tecido do restante do olho do hospedeiro. Uma vez livres, as lentes flutuarão no meio. Usando a agulha romba, empurre cuidadosamente a lente doadora logo acima da posição da lente do hospedeiro e, em seguida, empurre-a para baixo até a posição final com a agulha romba.

A lente do hospedeiro pode ser descartada. Deixe os embriões doadores e hospedeiros em Aros 1,2% por 30 a 60 minutos. O meio de embrião ajudará na cicatrização da ferida.

Em seguida, libere-os do agros utilizando uma agulha metálica afiada. Transfira os embriões para uma placa de 24 poços com meio para embriões. Cada embrião deve ocupar um poço separado.

Certifique-se de rotular corretamente os poços para que fique claro qual hospedeiro corresponde a qual doador após a transferência da lente. Deixe os embriões desenvolverem-se a 28,5 °C até o tempo desejado. Para observação fenotípica, geralmente examinamos a diferenciação da lente dentro de um a dois dias.

A lente derivada do doador deve manter a expressão de GFP após o transplante no olho do hospedeiro. Se um fenótipo mutante não for resgatado em um ambiente selvagem, isso indica que o fenótipo é autônomo. No entanto, se for resgatado, então o fenótipo é considerado não autônomo.

E isso tem implicações importantes na função do gene subjacente. Acabamos de mostrar como realizar o transplante da lente no embrião de peixe-zebra. Ao realizar este procedimento, é importante ter muito cuidado ao moldar as agulhas e ao dissecar a própria lente.

Além disso, os embriões devem ser organizados rapidamente antes que o enrolamento do ovo ocorra após a transplantação estar concluída. Não se esqueça de adicionar o embrião, meio até oito na cura em madeira. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.