Name: Dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a dissecar o cérebro de primata não-humano no espaço estereotáxico usando macacos vervet. Este método permite estudar a organização anatômica cerebral e avançar na pesquisa de neurociência translacional.

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Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico. NSERC conceder ao MP.

Parte 1: Pré-processamento de tecido <ol><li> Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente exsanguinated.This é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). </li></ol> Parte 2: estereotáxica bloqueio <ol><li> Antes de colocar a cabeça na moldura estereotáxica as coordenadas do zero avião Horsley-Clarke/interaural precisa ser tomada. Este é o ponto médio teórico entre as orelhas. Para medir este plano, as barras de ouvido precisa ser igualmente montado no aparelho, em seguida, coloque uma lâmina de bisturi no braço manipulador estereotáxica e medir o ponto médio entre as barras de ouvido. Isso é importante para determinar onde a bloquear o tecido com base nas necessidades de pesquisa. Quando isso for concluído o crânio deve ser preparado para fixação no aparelho estereotáxico. </li><li> A fim de colocar a cabeça na moldura estereotáxica o maxilar inferior terá que ser removida com fórceps osso e um bisturi. Além disso, a pele, músculo e tecido conjuntivo devem ser removidos, a fim de expor o crânio. Uma vez que o tecido conjuntivo é removido do crânio, expor o cérebro por desbastando a calvária (a parte de tabela do osso occipital, bem como o parietal, ossos ad frontal). Na parte do presente experimento calvária tem tudo pronto foram removidas. Tenha cuidado para não remover completamente os ossos temporais, pois o canal auditivo terá de estar intacto para colocar a cabeça na moldura estereotáxica. A matéria dura restante deve ser removido do cérebro exposto. O crânio está agora pronto para ser colocado na armação estereotáxica. </li><li> Da mesma forma em que se iria realizar uma cirurgia estereotáxica, ajustar o olho, boca, ouvidos e bares de tal forma que a cabeça está bem fixo no aparelho estereotáxico. Coloque o manipulador estereotáxica nas coordenadas predeterminado anterior / posterior (A / P) e mover o manipulador para o aspecto lateral do cérebro. Lentamente abaixe a lâmina para o cérebro, completamente levantar a lâmina do cérebro, então se movem medialmente e inferior a lâmina novamente. Repita essas duas etapas até que a lâmina atingiu o aspecto lateral do hemisfério oposto. Isto completa o primeiro bloco coronal. Para posterior blocos coronal mover o manipulador de um centímetro na A / eixo P e repetir até que todo o cérebro foi bloqueada. </li></ol> Parte 3: Remover o cérebro do crânio <ol><li> Remova a cabeça da armação estereotáxica e mantenha o cérebro exposto na palma da sua mão. Tentar garantir o cérebro levemente colocando coddling o cérebro na palma da sua mão e coloque o dedo mindinho entre os lobos frontais, esse movimento minimiza do cérebro no crânio. A fim de evitar o ressecamento da superfície pial do cérebro, coloque um pedaço de gaze umedecida PBS em todo o cérebro. Segure a cabeça com firmeza pelo crânio e desbastar os ossos restantes occipital e temporal, juntamente com a coluna vertebral. Isso expõe os aspectos básicos e lateral do cérebro. Por fim remover qualquer osso frontal restantes eo osso nasal, o que permitirá o acesso ao bulbos olfatórios. É importante remover o osso frontal último porque como você remover a base do crânio o cérebro se move ligeiramente e os lobos frontais podem ser danificados nas bordas irregulares do osso fontal. Cortar e remover restantes dura-máter. Levante cuidadosamente a parte frontal do cérebro, deslize o bisturi sob o cérebro eo cérebro livre do crânio. </li></ol> Parte 4: Medições <ol><li> Há uma série de medidas úteis que podem ser feitas antes do congelamento. Por exemplo, o A / P eixo do cérebro com um paquímetro. Além disso, a densidade específica pode ser medida pelo peso do cérebro, de medição do volume pelo deslocamento de água em um cilindro graduado, em seguida, dividindo o peso pelo deslocamento de volume (Tabela 1). </li></ol> Parte 5: Concluir o bloqueio do cérebro. <ol><li> Normalmente, quando a lâmina de bisturi é introduzido no cérebro, não é tempo suficiente para atravessar completamente a extensão dorsal-ventral completa do cérebro. Uma vez que o cérebro é removido e medições brutas são obtidas, leve um lenço de papel-slicing blade e terminar o bloqueio do cérebro até o lado ventral do cérebro (Figura 2). </li><li> Antes de congelar os blocos, é necessário cryoprotect o tecido em soluções classificados PBS-buffered sacarose (10, 20 e 30%) mantida a 4 ˚ C até os dissipadores cérebro. Ele normalmente leva uma incubação overnight em 10%, 2-3 dias em 20% e adicional de 3-5 dias em 30% para os blocos para desviar para o fundo do recipiente. A mudança diária de the solução de sacarose 30% é recomendado. </li></ol> Parte 6: Resultados Representante Há uma série de graves medições morfológicas que podem ser feitas uma vez que o cérebro foi removido do crânio. Estes incluem um comprimento / P, o peso ea densidade específica (Tabela 1). Nós geralmente bloqueiam o cérebro em 6-7 blocos medindo 1cm (Figura 1). Cada peça é então fotografada (Figura 2) e pode ser ainda mais dissecados, dependendo das necessidades de pesquisa ou preparados para o congelamento em soluções de sacarose classificados. <table border="1"><tbody><tr><td> Assunto </td><td> A Comprimento / P (Mm) </td><td> Peso (Gramas) </td><td> Deslocamento de água (Ml) </td><td> Densidade específica (G / ml) </td></tr><tr><td> O2303-2-1-1 </td><td> 64,3 </td><td> 28,1 </td><td> 24 </td><td> 1,171 </td></tr><tr><td> O5180-1 </td><td> 71,3 </td><td> 38,7 </td><td> 34 </td><td> 1,138 </td></tr><tr><td> O2708-3-1 </td><td> 62,8 </td><td> 28,7 </td><td> 26 </td><td> 1,104 </td></tr><tr><td> O9184-4-2 </td><td> 65,3 </td><td> 29,5 </td><td> 24 </td><td> 1,229 </td></tr><tr><td> N459-1-14-2 </td><td> 68,2 </td><td> 31,6 </td><td> 26 </td><td> 1,215 </td></tr><tr><td> MÉDIA </td><td> 66,38 </td><td> 31,32 </td><td> 26,8 </td><td> 1,171 </td></tr><tr><td> STD DEV </td><td> 3,38 </td><td> 4,33 </td><td> 4,17 </td><td> 0,052 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Gross Medidas morfológicas do hemisfério direito de 5 Mês vervet Velho <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig1.jpg" alt="figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig2.jpg" alt="figura 1.5" /> Figura 1. Esquemas para os planos coronal usado para bloquear o cérebro. Este é um exemplo de um cérebro adulto vervet externalizados. Exemplo do procedimento de bloqueio. As linhas verticais aqui são espaçados em 1cm, geralmente produzindo 7 blocos coronal de cada hemisfério. <img src="/files/ftp_upload/1259/1259fig3.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Blocos de tecido cerebral no espaço estereotáxico. Cada bloco vai render cerca de 200 seções tomada em 50 ìm. Com este esquema de amostragem mais de 1200 pontos através do córtex serão tomadas e um 400-500 adicional do cerebelo quando cortado no plano coronal.

<ol><li>Gallagher, M., Rapp, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+animal+models+to+study+the+effects+of+aging+on+cognition.+Annu+Rev+Psychol+48%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48.</a> , 339-370 (1997).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Nowakowski, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+site+of+origin+and+route+and+rate+of+migration+of+neurons+to+the+hippocampal+region+of+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).</li>
<li>Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+overproduction+of+synapses+in+diverse+regions+of+the+primate+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex.</a> Science. 232, 232-235 (1986).</li>
<li>Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+of+neurogenesis+and+synaptogenesis+in+the+primate+cingulate+mesocortex%3A+comparison+with+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex.</a> J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).</li>
<li>Zecevic, N., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+layer+I+neurons+in+the+primate+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex.</a> J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).</li>
<li>Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voluntary+consumption+of+beverage+alcohol+by+vervet+monkeys%3A+population+screening%2C+descriptive+behavior+and+biochemical+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures.</a> Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).</li>
<li>Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+monkeys+and+men%3A+vervets+and+the+genetics+of+human-like+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors.</a> Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).</li>
<li>Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+evaluation+of+neurons+and+glia+in+the+monkey+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+following+an+early+cerebral+hemispherectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy.</a> Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).</li>
<li>Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+migrate+along+the+nigrostriatal+pathway+in+a+primate+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease.</a> Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).</li>
<li>Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+abeta+vaccine+reduces+central+nervous+system+abeta+levels+in+a+non-human+primate%2C+the+Caribbean+vervet%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet.</a> Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).</li>
<li>Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+dopamine+transporter+densities+in+alcohol-preferring+vervet+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys.</a> Neuroreport. 7, 457-462 (1996).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

O St. Kitts vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) é um primata do Velho Mundo com padrões semelhantes e taxas de desenvolvimento do cérebro corticais e subcorticais ao dos humanos. Esta espécie tem sido utilizada para modelar humano complexo distúrbios comportamentais como comportamento ansioso, hipertensão 8, 9 hemisferectomia, doença de Parkinson 10, doença Alzhemier de 11, e abuso de álcool 12. Mais recentemente, esta espécie tem sido usado para estudar os efeitos d...

<table><tbody><tr><td>Estilete</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de estilete</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesouras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Qualquer tesoura cirúrgica é suficiente</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina para corte de tecidos</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

O uso de primatas não-humanos fornece um excelente modelo de translação para a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento e envelhecimento em seres humanos<sup&gt; 06/01</sup&gt;. Além disso, o uso de primatas não-humanos recentemente a oportunidade de, naturalmente, modelo complexo transtornos psiquiátricos, como o abuso de álcool<sup&gt; 7</sup&gt;. Aqui nós descrevemos uma técnica para bloquear o cérebro no plano coronal do macaco vervet (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;) No crânio intacto no espaço estereotáxico. O método descrito aqui fornece um plano padrão de seção entre os blocos e assuntos, minimiza seções parciais entre os blocos. Seccionamento de um bloco de tecido no plano coronal também facilita a delimitação de uma área de interesse. Este método fornece gerenciáveis ​​blocos de tamanho desde um único hemisfério do macaco vervet produz mais de 1.200 seções quando cortar em 50 ìm. Além disso, bloqueando o cérebro em blocos de um centímetro, facilita a penetração da sacarose cyroprotection e permite que o bloco a ser cortado em um criostato padrão.

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do processamento normal do cérebro. A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.

Dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico

O uso de primatas não humanos fornece um excelente modelo translacional para a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento e envelhecimento em humanos1-6. Em ...

Este procedimento começa com uma cabeça de macaco bem perfundida. Após a remoção do crânio, a cabeça é então posicionada no estereotáxico e uma série de cortes coronais estereotáxicos é realizada com o braço manipulador; em seguida, o cérebro é removido, medido e protegido por criopreservação. Olá, sou o Dr. Mark Burke do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.Sou o Dr. Shaheen Zur, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Sou o Dr. Mo Petto, diretor do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Hoje vamos mostrar um procedimento para bloquear o cérebro de primata não humano no espaço estereotáxico.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar diversos aspectos da organização cerebral no desenvolvimento normal e em resposta a interferências no desenvolvimento. Então, vamos começar. Este protocolo inicia-se após a eutanásia, fixação e decapitação de um macaco vervet.Antes da remoção do cérebro, o estereotáxico deve ser preparado. Primeiramente, é necessário encontrar as coordenadas do plano interoral zero de Horsley-Clark ou o ponto médio teórico entre as orelhas. Para medir este plano, encaixe igualmente as barras auriculares no aparelho.Em seguida, coloque uma lâmina de bisturi no braço do manipulador estereotáxico e meça o ponto médio entre as barras auriculares. Depois, prepare a cabeça para ser posicionada no quadro estereotáxico. Use um gancho ósseo e um bisturi para remover a mandíbula inferior.Neste ponto, retire cuidadosamente qualquer calvária remanescente ao longo dessas etapas. Tenha cuidado para não remover os ossos temporais, pois você precisará dos canais auditivos intactos para fixar a cabeça no estereotáxico. Usando pinça e tesoura, corte cuidadosamente a dura-máter visível do cérebro exposto.Agora o crânio está pronto para ser colocado no manipulador estereotáxico. Para iniciar o bloqueio estereotáxico do cérebro, posicione a cabeça na estrutura, ajuste a placa ocular e as barras auriculares como faria em uma cirurgia estereotáxica. Coloque o manipulador estereotáxico no eixo anterior, posterior ou AP predeterminado.Para começar o bloqueio do cérebro. Posicione o manipulador no lado extremo esquerdo ou direito do cérebro e abaixe a lâmina para fazer o primeiro corte. A lâmina ficará perpendicular à linha média do cérebro, cortando no plano coronal.Levante a lâmina até que ela esteja completamente acima da superfície do cérebro. Em seguida, mova-se medialmente até sobrepor ligeiramente o primeiro corte e abaixe a lâmina novamente. Repita o processo, fazendo cortes sobrepostos até alcançar a borda oposta do cérebro.Isso conclui o primeiro bloco coronal. Mova o manipulador um centímetro para frente ou para trás ao longo do eixo AP e faça outra série de cortes no plano coronal paralelamente aos anteriores. Prossiga dessa maneira até que tenha seccionado todo o cérebro.Agora que você terminou de cortar, é hora de remover o cérebro do crânio. Primeiro, retire a cabeça da estrutura. Tente segurar o cérebro levemente, acomodando-o na palma da mão, para evitar que ele se mova dentro do crânio e sofra danos.Coloque seu dedo mindinho sobre os lobos frontais para evitar que a superfície do cérebro resseque. Umedeça um pedaço de gaze com PBS e coloque-o sobre o cérebro. Segure a cabeça firmemente pelo crânio e remova os ossos occipital e temporal restantes juntamente com a coluna vertebral.Isso expõe as faces basal e lateral do cérebro. Agora, remova a dura-máter remanescente. Por fim, remova o osso nasal e qualquer osso frontal restante, o que permitirá o acesso aos bulbos olfativos.É importante remover o osso frontal. Por último, porque ao remover a base do crânio, o cérebro se move ligeiramente e as bordas irregulares do osso frontal podem danificar os lobos frontais.Remova cuidadosamente qualquer restante de meninge, levante suavemente a parte frontal do cérebro, deslize o bisturi sob o cérebro e solte-o do crânio. Ele permanecerá coeso como uma cebola cortada pelo cabo, pois a lâmina de corte não alcança completamente o lado ventral. Existem várias medidas úteis que você pode realizar antes de congelar o cérebro.Primeiro, um paquímetro pode ser usado para medir o eixo AP do cérebro. Em seguida, determine sua densidade específica, pesando o cérebro. Depois, meça o volume pelo deslocamento de água em um cilindro graduado.Agora você tem a massa da densidade dividida pelo volume. Agora que você realizou as medições em todo o cérebro, é hora de soltar os blocos individuais de tecido dos pontos onde estão presos no lado ventral do cérebro e prepará-los para o congelamento. Pegue uma lâmina de corte de tecido e prolongue cada corte pelo lado ventral do cérebro, liberando os blocos.Um paquímetro pode ser usado para medir os AE medial, lateral e ântero-posterior. Os blocos cerebrais estão agora prontos para serem crioprotegidos e congelados. Acabamos de mostrar como posicionar o cérebro de um primata não humano no espaço estereotáxico.Ao realizar este procedimento, é importante retrair completamente a lâmina antes de qualquer movimento medial lateral com um manipulador estereotáxico. Além disso, ao remover os ossos do cérebro, tenha cuidado para não danificar o córtex com os ERs. É isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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