Name: A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a dissecar a retina de primatas não humanos para estudos de neurociência e oftalmologia. Este método permite analisar a organização anatômica retiniana e suas implicações para doenças humanas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu apoio técnico. Somos gratos a Frank Ervin, Palmour Roberta e ao pessoal da Fundação Ciências Comportamentais Laboratories localizado em São Cristóvão, West Indies, por seu apoio contínuo do nosso trabalho de primatas.

Parte 1: Pré-processamento de tecido <ol><li> Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. Recomenda-se que logo após o sacrifício dos olhos ser injetado com o fixador apenas sob a lente e armazenados em fixador. </li><li> No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). </li></ol> Parte 2: A remoção do globo ocular da cavidade orbital <ol><li> Para facilitar o acesso ao globo ocular recomenda-se remover primeiro o cérebro. Uma vez que o cérebro foi removido o osso da órbita de paredes finas é facilmente perceptível. Usar o fórceps osso para roer lentamente a parede da órbita. Cortaram os músculos oculares com um bisturi e remover o tecido conectivo do globo ocular. Corte cuidadosamente o nervo óptico, este pode ser utilizado em estudos de microscopia eletrônica. O globo ocular deve agora ser lançado a partir da cavidade orbital. </li></ol> Parte 3: Dissecar a retina ocular do <ol><li> Colocar o olho em uma placa de Petri com PBS para manter a retina de secagem. Um microscópio de dissecação ou mesa montada ampliação suportar a luz é útil para a dissecação, mas não uma necessidade. Remova a córnea, cortando a esclera de perto para o perímetro da córnea ao nível da ora serrata com um par de tesouras primavera e remover a lente com a pinça. </li><li> Use um pincel, pinça, tesoura e mola para remover a retina da esclera. Isto é feito através da separação da retina da esclera e depois corte a esclera acabar com a tesoura. Deve-se realizar este processo em pequenos incrementos de modo a não danificar ou rasgar o tecido da retina. A esclera não é facilmente separado do nervo óptico remanescente tão cuidadosamente cortar a esclera em torno do nervo óptico. </li><li> Neste ponto, a retina manteve sua forma curva e precisa ser aplainado para a amostragem. Antes de achatamento da retina, o humor vítreo, que tem a consistência de geléia, podem ser removidos em um caroço. Para achatar a retina em um slide, fazer vários cortes radiais com uma lâmina de bisturi. O humor vítreo residual pode agora ser removido com papel de filtro comum e um pincel. A camada de células ganglionares da retina é exposta neste momento por isso é imperativo para ser gentil ao remover o humor vítreo. Se o nervo óptico ainda está ligado ao disco óptico, remova o nervo óptico sem rasgar a retina usando uma lâmina de bisturi e uma tesoura de mola. Esta é agora uma retina montagem plana (Figura 1) e fóvea deve ser aparente como uma mancha escura na direção temporal / ventral do disco óptico. </li></ol> Parte 4: Amostragem <ol><li> Há uma série de opções para a amostragem da retina. Aqui vamos descrever a preparação e amostragem flatmount isodentric. Para ambos os procedimentos flatmount da retina com a camada de fibra óptica de distância do slide. Se a intenção é examinar a camada de células ganglionares da retina na preparação flatmount, é necessário remover ou lixívia do epitélio pigmentado. Para remover o epitélio pigmentado use um pincel levemente para remover alguma desta camada, esta tende a danificar a camada de fotorreceptores. Clareamento envolve embeber a retina em solução de permanganato de potássio (0,25%) por 1 hora, lavar em água destilada, e limpando em ácido oxálico (5%) por 5 minutos. 2 </li><li> Se a intenção é examinar a distribuição de células e morfologia de cada camada em todo o retina, então sugerimos amostragem isométrica da retina. A retina deve ser flatmounted em um slide e mantido úmido com PBS. Para a amostragem isométrica cortar pequenos pedaços de tecido eqüidistantes do disco óptico no nasal, direções temporal, superior e inferior (Figura 1). Não é necessário para branquear a epitélio pigmentado nesta preparação. Essas peças podem agora ser seccionado no plano coronal com um criostato, vibratome, ou ultramicrótomo dependendo da questão de pesquisa. Para corte em criostato, as peças devem ser cryoprotected em sacarose 30% durante a noite e congelados no contexto de um meio de montagem em gelo seco. Alternativamente, as amostras podem ser incorporados em agar e cortados em um vibratome. O criostato e preparações vibratome confiantemente rendimento seções finas como 4 m. Se são necessários cortes mais finos (por exemplo, para a preparação de microscópio eletrônico), é necessário preparar as amostras para o ultramicrótomo. Para fazer isso, as seções devem ser pós-fixados em tetróxido de ósmio por 1 hora sob a fumehood. Isto é seguido por desidratação em uma série de etanol classificados (50, 70, 95, 95, 100, 100%) e óxido de propileno 100%. O tecidoé então incorporado em Epon (incorporar-812 kit incorporação). </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Em nosso laboratório, nós rotineiramente imunohistoquímica na retina cryosectioned (Figura 2). Neste caso, estamos interessados ​​na isodensity dos receptores de canabinóides (CB1) na retina de primatas. Também examinamos os efeitos da exposição pré-natal de etanol no sistema de primatas visual. Para este fim, estamos interessados ​​na densidade de células ea espessura da camada na fóvea e na retina periférica. Para conseguir isso, nós incorporar pedaços de retina em Epon, fatia a 700nm em um ultramicrótomo, e manchar com 1% de azul de toluidina (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura Retina Flatmount 1. Cortes Radial são usados ​​para achatar a retina. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura imunocoloração 2. Cryosection da retina periférica histoquímica para CB1 onde as células ganglionares da retina são fortemente marcadas com alguma rotulagem nas camadas interiores e exteriores nuclear. A espessura desta seção é de 14 m e coradas no slide. RG - camada ganglionares da retina; IP - camada plexiforme interna; IN - camada nuclear interna; OP - camada plexiforme externa; ON - camada nuclear externa. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 Fovea Seção. Através da fóvea que foi incorporado em Epon e cortados em um ultramicrotrome em 700nm. A camada de fotorreceptores (PR) foi usado para alinhar as seções. Observe que a extensão total dos fotorreceptores pode ser identificado, indicando um ângulo apropriado no plano coronal. Medidas de densidade foram realizadas em 300 m, 500 m e 800 m do centro do poço foveal usando o sistema de imagem BIOQUANT. RG - camada ganglionares da retina; IP - camada plexiforme interna; IN - camada nuclear interna; OP - camada plexiforme externa; ON - camada nuclear externa; barra de escala = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

A preparação da retina como um wholemount permite a análise da topografia e distribuição espacial de uma camada de células do gânglio ou as células endoteliais dos vasos sanguíneos da retina 3. Quantificação da densidade de células na periferia da retina de primatas é facilmente realizado. No entanto, em regiões perifoveal e foveal, o empilhamento de múltiplas camadas na camada de células ganglionares obstrui quantificação. Para contornar esse viés potencial, a fóvea e região perifoveal pode ser dissecada des...

<table><tbody><tr><td>Escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de escalpelo</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Qualquer tesoura cirúrgica é suficiente</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Papel filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de pelos de camelo ou marta</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a entrada para o cérebro: dissecando o olho primaz

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

O sistema visual em humanos é considerada a porta de entrada para o mundo e desempenha um papel principal na infinidade de sentidos, processos perceptivos e cognitivos. Portanto, não é surpreendente que a qualidade de visão está ligada à qualidade de vida. Apesar da pesquisa clínica e básica generalizada sobre as causas de distúrbios visuais, muitas formas de deficiência visual, tais como retinite pigmentosa e degeneração macular, a falta de tratamentos eficazes. Primatas não-humanos têm o mais próximo características gerais do desenvolvimento do olho ao dos humanos. Não só eles têm uma anatomia semelhante vascular, mas entre outros mamíferos, os primatas têm a característica única de ter uma região na retina temporal especializados para a acuidade visual de alta, a fóvea<sup&gt; 1</sup&gt;. Aqui nós descrevemos uma técnica geral para dissecção da retina de primatas para fornecer tecido para histologia da retina, imuno-histoquímica, microdissecção de captura de laser, assim como a luz e microscopia eletrônica. Com o uso prolongado do primata não-humano como um modelo de translação, a nossa esperança é que uma melhor compreensão da retina irá fornecer insights sobre abordagens eficazes para atenuar ou reverter o impacto negativo dos distúrbios visuais na qualidade de vida dos indivíduos afetados.

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do desenvolvimento e envelhecimento. A organização anatômica da retina de primatas pode fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.

A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz

O sistema visual nos seres humanos é considerado a porta de entrada para o mundo e desempenha um papel fundamental na pletora de processos sensoriais, perceptivos e cognitivos...

Este procedimento começa com uma cabeça de macaco bem perfundida. Após a remoção do cérebro, os globos oculares são então extraídos e conectados. Com o tecido removido em seguida, a córnea, o cristalino, a esclera e o humor vítreo são cuidadosamente retirados, liberando a retina.A retina é colocada plana sobre uma lâmina de vidro e o humor vítreo remanescente é removido. Em seguida, são coletadas amostras de Iso Dentrix e crioprotegidas. Olá, sou o Dr. Mark Burke do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.Olá, eu sou a Dra. Shaheen Zur, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, eu sou o Dr. Tito, diretor do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para dissecar uma retina de primate não humano.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar vários aspectos da organização retiniana no desenvolvimento normal e em resposta a interferências durante o desenvolvimento. Então, vamos começar. Inicie este protocolo com a cabeça de primata, que você previamente perfundiu.Bem, com um fixador como o paraformaldeído, a retina a ser dissecada aqui é obtida de um macaco-berço. Para garantir a preservação do olho, um fixador como o paraformaldeído pode ser injetado logo abaixo da lente. A cabeça deve ser armazenada em fixador ou PBS antes de prosseguir para a retirada dos globos oculares, a fim de obter acesso mais fácil ao globo ocular.Primeiro, remova o cérebro. Para visualizar este procedimento, consulte o nosso artigo recente no JoVE sobre a dissecação do cérebro de primata não humano no espaço estereotáxico. Com o cérebro removido, o osso orbital de parede fina fica claramente aparente.Use uma cureta óssea para remover lentamente a parede da órbita. Use um bisturi para cortar os músculos oculares e remover o tecido conjuntivo do globo ocular. Por fim, corte cuidadosamente o nervo óptico, liberando o globo ocular da cavidade orbitária.Agora que o globo ocular está solto, a retina pode ser removida. Para remover a retina, primeiro coloque o olho em uma placa de Petri contendo PBS para evitar que a retina seque. Comece removendo a córnea. Use uma tesoura de mola e corte a esclera próxima à borda da córnea, ao nível da ora serrata.Usando pinças, remova a lente. Finalmente, para remover a retina da esclera, utilize um pincel, pinças e tesoura de mola.Se pare a retina da esclera e, em seguida, corte a esclera com a tesoura. Esse processo deve ser realizado em pequenos incrementos para evitar danificar ou rasgar o tecido retiniano. A esclera não se separa facilmente do nervo óptico remanescente.Corte cuidadosamente a esclera ao redor do nervo óptico. A retina mantém sua forma curva. Remova o humor vítreo, de consistência gelatinosa, em um único pedaço.A retina está agora pronta para montagem e coleta de amostra. Para aplainar a retina sobre uma lâmina, faça vários cortes radiais com uma lâmina de bisturi. Utilize papel-filtro comum e um pincel para remover o humor vítreo residual.É imperativo ser gentil ao realizar este passo, pois ele expõe a camada de células ganglionares da retina. Verifique se o nervo óptico ainda está preso ao disco óptico. Utilize uma lâmina de bisturi e uma tesoura de mola para remover o nervo óptico sem rasgar a retina.Agora, monte achatado a retina sobre uma lâmina de microscópio de vidro de dois por três polegadas, com a camada de células ganglionares da retina voltada para longe da lâmina. A fóvea agora é aparente como uma mancha escura na direção ventral temporal a partir do disco óptico. Para examinar a camada de células ganglionares da retina, o epitélio pigmentado pode precisar ser removido ou branqueado.Use um pincel para remover levemente parte do epitélio pigmentado. Observe que este método tende a danificar a camada de fotorreceptores. A análise da distribuição celular e da morfologia de cada camada em toda a retina requer uma amostragem isométrica da retina.Inicie montando achatado a retina sobre uma lâmina e adicione PBS para manter a retina úmida. Em seguida, corte pequenos fragmentos de tecido equidistantes do disco óptico nas direções nasal, temporal, superior e inferior. Esses fragmentos podem agora ser seccionados no plano coronal com um criostato, vibrosserrote ou ultramicrótomo.Dependendo da questão de pesquisa. Para corte em criostato, os fragmentos devem ser crioprotegidos em sacarose a 30% em tampão fosfato durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação durante a noite, congele os fragmentos retinianos em um meio de montagem sobre gelo seco.Utilize o criostato para obter cortes com espessura de até quatro mícrons. Em nosso laboratório, realizamos rotineiramente imuno-histoquímica em retina seccionada por criostato. Neste caso, estamos interessados na iso-densidade dos receptores canabinoides na retina de primata.Também examinamos os efeitos da exposição pré-natal ao etanol no sistema visual de primatas. Para tanto, estamos interessados na densidade celular e na espessura das camadas na fóvea e na retina periférica. Para alcançar esse objetivo, incluímos fragmentos de retina em epón, cortamos em um ultramicrótomo com espessura de 700 nanômetros e coramos com azul de toluidina a 1%.Acabamos de mostrar como dissecar uma retina de primata. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não danificar as camadas de células ganglionares da retina ou as camadas de fotorreceptores. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

the-gateway-to-the-brain-dissecting-the-primate-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do processamento normal do cérebro. A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.

Dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico

Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

Este vídeo de apresentação mostra um método de colheita das duas mais importantes estruturas altamente vasculares que suportam a função do cérebro anterior. Eles são a superfície cerebral (superficial), juntamente com vasculatura meninges associados (MAV) e plexo coróide que são necessárias para o fluxo sanguíneo cerebral e do líquido cefalorraquidiano (LCR) homeostase.

A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o cérebro adulto de Drosophila – um procedimento necessário para visualizar o órgão, que é obscurecido pela cutícula, olho e tecido traqueal. O protocolo de exemplo mostra uma demonstração detalhada produzindo preparações de alta qualidade que podem ser usadas para imunocoloração e métodos de imagem em neurobiologia de Drosophila.

drosófila Dissecção do cérebro adulto: um método em neurobiologia de moscas

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o complexo olho-cérebro das pupas de Drosophila. O protocolo apresentado demonstra o procedimento produzindo tecido de alta qualidade, compatível com, por exemplo, imunocoloração, bem como outros experimentos de expressão gênica.

Dissecção do complexo olho-cérebro de pupas de moscas: um método para isolar o tecido retiniano

A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.

Um método altamente reprodutível e fácil de executar In Vivo Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos

O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco e glândula pituitária pós-morte num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.

Exposição do SNC porco para análise histológica: A manual por decapitação, crânio de abertura, e Cérebro Remoção

Expressões faciais são um modo de comunicação visual, produzido pelos músculos miméticas. Aqui, apresentamos os protocolos para as novas técnicas de dissecação reversa e DiceCT totalmente Visualizar e avaliar os músculos miméticas. Essas técnicas combinadas podem examinar aspectos morfológicos e fisiológicos da musculatura mimética para determinar aspectos funcionais.

Reverter a dissecção e dados DiceCT revelar outra forma escondida na evolução do primata rosto

O método descrito abaixo visa fornecer um protocolo abrangente para a preparação de neurocirurgia de primatas não humanos (NHP) utilizando uma nova combinação de métodos de impressão tridimensionais (3D) e extração de dados de ressonância magnética.

Uma caixa de ferramentas baseada em ressonância magnética para planejamento neurocirúrgico em primatas não humanos

O macroscopamento completo e o corte padronizado de globos não neoplásicos são importantes para a obtenção de cortes histopatológicos reprodutíveis de alta qualidade. Diretrizes para um macroscopo padronizado de globos não neoplásicos adultos e fetais são fornecidas aqui. Diferentes opções para o corte do globo são demonstradas e discutidas, incluindo critérios para a tomada de decisão baseada em casos.

Macroscopa de globos não neoplásicos, incluindo olhos fetais

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a dissecar a retina de primatas não humanos para estudos de neurociência e oftalmologia. Este método permite analisar a organização anatômica retiniana e suas implicações para doenças humanas.

A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz

Explorar mais vídeos