Name: Sabendo o que conta: Estereologia Imparcial no cérebro de primatas não humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda estereologia imparcial para estimar números de neurônios em regiões específicas do cérebro de primatas não humanos. Este método fornece contagens celulares precisas para pesquisa em neuroanatomia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico. NSERC conceder ao MP.

Parte 1: Pré-processamento de tecido deve ser feito de acordo com Burke et al. (2009) 5. <ol><li> Resumidamente, o tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeyhde, gluteraldehyde, ou formol. O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesados, determinado volume, cryoprotected, e congelados 5. </li></ol> Parte 2: amostragem sistemática de tecido, de acordo com Burke et al. (2009) 6. <ol><li> Neste exemplo, focada no lobo frontal do cérebro vervet. O espaço de referência foi definido para incluir tecido cortical do sulco central do pólo frontal do hemisfério esquerdo. Para os nossos propósitos da série foram fixados em 1 / 10 seções em todo o córtex, seccionados a 50 ìm. Uma série completa foi manchada com violeta cresil (série # 1). Série 2 foi dividido de modo que metade dos cortes foram corados com o cloreto de ouro para mielina revelação e manchado outra metade para esterase acetilcolina (para a delimitação de certas áreas subcortical). Todas as outras séries foram bancados em preservar o antígeno como parte de nossos planos de investigação a longo prazo. </li></ol> Parte 3: Estereologia (para mais detalhes, veja Mouton 2002) 4 <ol><li> A estimativa total de número de células (N) é calculado com base na seguinte equação: N = ssf -1 x -1 x asf tsf -1 x Σ Q - Ssf onde é a fração de amostragem seção, asf é a fração de amostragem área, tsf se a fração de amostragem espessura (onde a espessura medida do tecido é dividido pela altura dissector), e Σ Q - é o número total de objetos de interesse contados dentro do dissector. As próximas seções deste protocolo mostrar como determinar a ssf, asf, tsf e Σ Q. </li><li> Fração seção de amostragem (computador não-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> O espaço de referência inteiro deve ser bem definida no sentido antero-posterior e dorsal para ventral. Neste exemplo, estavam interessados ​​no lobo frontal ea definiu como a região da ponta do pólo frontal (anterior) ao sulco central (posterior) eo sulco lateral (ventral) e excluiu a ínsula. </li><li> Para o lobo frontal deste assunto em particular um total de 760 seções foram sistematicamente coletados com 76 manchada por violeta cresil. Uma vez que o alvo era de 10 seções em todo o espaço de referência 06/01 seções violeta cresil manchadas foram amostradas, levando a uma fração amostral Seção de cerca de 1 / 60. Aleatoriamente começou com um dos primeiros seis cortes corados cresil violeta e sistematicamente amostrados 1 / 6 depois. Um total de 13 seções foram amostradas para o tema selecionado (Figura 2). </li></ol></li><li> Fração de área da amostra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Um estudo piloto vai indicar o tamanho da grade ideal, a fração de amostragem de Área, a amostra do espaço de referência com cerca de 100-300 disectors. No lobo frontal, um tamanho de grade de 2500 mM dois renderam uma média de 254 disectors para este assunto (Figura 2). O tamanho da disector deve render entre cerca de 0-5 objetos contados, neste caso, os neurônios. </li></ol></li><li> Fração da espessura da amostra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Em cada local disector, a altura do tecido é medida, e uma fração desta altura é amostrado, o que é conhecido como a fração de amostragem de espessura. Para determinar a espessura medida, o foco através do z-plano até que a primeira célula entra em foco, em seguida, volta-se ligeiramente para o topo da seção, ou seja, até o último objeto aparece logo fora de foco. Para determinar o fundo do tecido, o foco através do z-plano até que as células são pouco fora de foco. </li><li> Focando através do z-plano, as células devem ser coradas em cada profundidade, se não, isso pode indicar uma penetração incompleta da desidratação mancha ou não-uniforme do tecido, caso em que as seções devem ser re-marcados. Esta precaução é especialmente importante para o tecido imunocoradas que requer penetração de immunoprobes através de seções de tecido relativamente grossa. Por esta razão, o tecido deve ser leve imunocoradas contracorados com uma mancha basofílico (violeta, por exemplo, cresil, hemahematoxilina), a fim de determinar com precisão superior e inferior da seção e para confirmar a penetração do anticorpo. Neste estudo, os cortes foram cortados em um micrótomo configuração de 50 ìm. Após todo o processamento de tecidos estava completa, a espessura do tecido medido em média 17.9μm (Figura 2), com uma retração média de cerca de 65%. Note-se que estes resultados representam o encolhimento do tecido típico para processadas para preparação histológica de rotina 7. </li><li> A altura disector padrão para o estudo típico é 10μm. A diferença entre a altura ea espessura disector seção medida é a altura de guarda, o volume de tecido onde não características biológicas são contados. O uso de uma altura de guarda evita dano tecidual nas superfícies de corte (por exemplo, perdeu caps). </li></ol></li><li> O número total de objetos contados, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Para evitar viés de erros de reconhecimento, é imperativo que uma definição padrão é seguido para o recurso especial de interesse biológico. Neste caso, estávamos interessados ​​em contar os neurônios. Portanto, um neurônio foi definido como tendo um nucléolo visível uma localização central e um citoplasma bem definido, enquanto que as células da glia, geralmente faltava nucléolos visíveis e citoplasma. Para este assunto 457 neurônios foram contados. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Um Sistema de Estereologia computadorizada (Estereologia Resource Center, Chester, MD) <ol><li> O Sistema Stereologer pede ao utilizador para preencher as informações necessárias de forma passo-a-passo. No &quot;Estudo seção&quot; Informações sobre os parâmetros do estudo são estabelecidas. Desde um espaço de referência deve ser definido para o estudo, o parâmetro de volume deve ser selecionado (para o espaço de referência do estimador Cavalieri deve ser selecionado). Volume de objeto também pode ser selecionado aqui para estimar o número ponderado de volume para a população de objetos de interesse. Para o nosso exemplo, apenas o volume do espaço de referência foi selecionado. Para cada objeto, selecione o número e definir a característica de interesse, neste caso neurônios. </li><li> Inicialização caso: Nesta seção as informações de amostragem é estabelecido. Digite o intervalo de amostragem de placas (lajes se separar de tecido foram cortados de forma exaustiva e cada seção é colocado na ordem seqüencial em seguida, digite um aqui). Digite o número total de seções tomadas através do espaço de referência (neste caso 760). Em seguida, insira o intervalo de amostragem seção (neste caso 59). O sistema calcula o número de seções devem ser amostrados (neste caso 13). </li><li> Parâmetros da sonda: Esta seção define a grade e tamanho disector. Para o volume, use uma baixa ampliação 2.5x-10x para definir o espaçamento da grade, no menu de edição. Ampliação de objeto deve ser realizada em 100x (NA 1.3 ou 1.4). Área do quadro é o tamanho do disector, neste caso usamos 50% da tela. A altura do quadro é a espessura do disector; fixado em 10μm aqui. O espaçamento é o tamanho da grade. Em nosso estudo piloto verificou-se que 2500μm rendimentos entre 150-200 frames espaçados de forma sistemática uniforme através de um espaço de referência relativamente grande. Para áreas menores, um tamanho menor da grade deve ser usada. Um estudo piloto irá identificar os parâmetros de sensor óptico para cada estudo particular. </li><li> Uma vez que os parâmetros do estudo foram estabelecidos, a amostragem através do tecido pode prosseguir. O programa irá solicitar que você experimentar a primeira seção. Passo 1: O programa irá solicitar ao usuário, em pequeno aumento, para traçar o espaço de referência na seção. O sistema em seguida, coloque uma grade sobre a seção com base nos parâmetros da sonda eo usuário irá então verificar que aponta queda no espaço de referência. Se um ponto não está dentro do espaço de referência basta clicar sobre o ponto e não será calculado para o volume. Passo 2: O sistema irá colocar uma nova grade sobre o espaço de referência, com base nos parâmetros espaçamento. Verifique se as interseções se inserem no espaço de referência. Passo 3: O sistema irá solicitar que o usuário alterne para o objetivo maior ampliação e mover o palco para o primeiro dissector. Etapa 4: Neste ponto, o sistema avisa o usuário para definir o superior e inferior da seção, em seguida, o sistema define o espaço de amostragem no eixo z Passo 5:. O usuário clique em cada objeto que cai dentro do disector através do z-plano. Objetos que tocam as linhas vermelhas ou a parte inferior da disector não podem ser contabilizadas. Uma vez que cada objeto é contado, clique em Avançar. O estágio irá se mover para a próxima disector e os passos 4 e 5 serão repetidos. Depois de todos os disectors para a seção foram contabilizados, o sistema irá solicitar que o usuário insira a próxima seção seqüencial a ser sondado. Passos 1-5 será repetido até que todas as seções seqüenciais têmforam amostrados. O sistema irá fornecer os cálculos para asf, ssf, tsf, e Q Σ. Com base nesses parâmetros, o sistema irá gerar um N estimada, volume de referência e CE para tanto o número estimado e volume. Ele também lhe dará recomendações para se tornar mais eficientes ou para reduzir a CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Estereologia imparcial fornece estimativas eficiente e confiável de populações de células dentro de um espaço de referência. Há um número de sistemas baseados em computadores estereológica disponíveis, todos que dependem de amostragem sistemática e um espaço de referência definido. Nós temos usado o sistema de BIOQUANT Vida Ciências para estimar o total da população neuronal do córtex cerebral de 2 anos de idade vervet em mais de 828 milhões (Figura 3) com uma média de 0,042 CE. Temos posteriormente utilizado o sistema Stereologer estimar que as contas do lobo frontal por cerca de metade do número de neurônios corticais 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Computador sistemas baseados em Estereologia. O set-up básico dos sistemas de estereologia é o mesmo, um microscópio com um palco motorizado (xyz), um controlador de palco, câmara de vídeo, computador e software. O sistema que é em última análise, devem ser escolhidos com base na eficiência, necessidades e análise de custos. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> INFORMAÇÃO ESTUDO </td></tr><tr><td> Nome estudo </td><td> Frontal Cortex </td></tr><tr><td> Investigador Principal </td><td> MB </td></tr><tr><td> Espécies </td><td> AG </td></tr><tr><td> Espaço de referência Frontal </td><td> Córtex </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> Informações sobre o caso </td></tr><tr><td> Coletor de Dados </td><td> MB </td></tr><tr><td> Data </td><td> Quarta-feira, 30 de abril, 2008 </td></tr><tr><td> Grupo </td><td> Controle </td></tr><tr><td> Assunto </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> CARACTERÍSTICAS DE AMOSTRAGEM </td></tr><tr><td> Intervalo de amostragem laje </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Número total de seções </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Intervalo de amostragem seção </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Seção de partida </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAÇÕES </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RESUMO RESULTADOS </td></tr><tr><td> Parâmetro </td><td> Sondar </td><td> Nome </td><td> Resultado </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Espessura </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Número </td><td> Disector </td><td> neurônio </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri ponto da grade </td><td> volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RECOMENDAÇÕES </td></tr><tr><td> Sondar </td><td> Número objeto (neurônio) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Recomendações </td><td> CE é aceitável. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Número de Disectors Vista é muito alto, aumentar o espaçamento disector. </td></tr><tr><td> Sondar </td><td> Volume região (volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Recomendações </td><td> CE é aceitável. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> RESULTADOS SEÇÃO </td></tr><tr><td> Seção </td><td> neurônio NumObjects neurônio NumCorners </td><td> RegPoints volume de </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 Os resultados do Lobe fontal obtidas com o sistema Stereologer. Para o lobo frontal, a maior parte do processo de estereológica foi na amostragem sistemática e de corte. Estimar o volume, topografia e neuronal foram concluídas em cerca de um dia para cada assunto. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 Cortex Estimativa da População Neuronal Obtidos com BIOQUANT. BIOQUANT O sistema requer uma topografia exata antes da contagem das células. Aqui uma média de 13 cortes foram amostrados. Topografia cortical e estimativa de volume subseqüente levou entre 15-20 horas para cada disciplina. Topografia foi realizada sob um objetivo 2.5x e contando foi feito usando uma objetiva de imersão 100x óleo (NA 1.3). Cada seção 100 foi escolhido por todo o hemisfério esquerdo, com uma média de 180 disectors amostrados. Uma vez que a topografia foi concluída a contagem neuronal demorou cerca de um dia. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Aat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+cut+it%3A+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li>
<li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Principles+and+Practices+of+Unbiased+Stereology%22">Principles and Practices of Unbiased Stereology</a>. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+banking%3A+Making+the+most+of+your+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
<li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP%2FPS1%3A+Neuroimaging%2C+Stereology%2C+And+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22AGE%22%5BJournal%5D)">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li>
<li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li>
<li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li>
</ol>

Estereologia imparcial em um cérebro de primatas é semelhante ao de outras amostras biológicas. No entanto, dado o tamanho do cérebro dos primatas, um plano de tratamento cuidadoso é recomendado desde um único hemisfério do macaco vervet produz mais de 1.200 seções quando cortado em 50 micra. Em primeiro lugar recomendamos stereotaxically bloqueando o cérebro em blocos de um centímetro, que fornece um plano padrão de seção entre os blocos e assuntos, minimiza seções parcial entre blocos, e fornece blocos gerenciáveis ​​...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Centro de Recursos de Estereologia (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Stereology Tool-Kit Stereologer</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sabendo o que conta: estereologia imparcial no cérebro de primatas não humanos

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a compreensão dos processos normais de funcionamento e as doenças do cérebro humano. Estereologia imparciais, o método aceito como o estado-da-arte para a quantificação de objetos biológicos em cortes de tecido<sup&gt; 2</sup&gt;, Gera dados confiáveis ​​estruturais para os recursos biológicos no cérebro de mamíferos<sup&gt; 3</sup&gt;. Os componentes-chave da abordagem são imparciais (aleatória sistemática) de amostragem de estruturas anatomicamente definidos (espaços de referência), combinado com a quantificação de números de celular e comprimentos de fibra tamanho e capilar, superfícies, volumes regionais e distribuição espacial de objetos biológicos dentro do espaço de referência<sup&gt; 4</sup&gt;. Entre as vantagens dessas abordagens sobre os métodos estereológicos anterior é a prevenção de todas as fontes conhecidas de erro sistemático (não aleatória) decorrentes de pressupostos errôneos e não verificáveis ​​modelos. Este estudo documenta uma aplicação biológica de estereologia computadorizado para estimar o total da população neuronal no córtex frontal do cérebro do macaco vervet (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Com a ajuda de dois programas estereologia comercialmente disponíveis, Ciências da Vida e BIOQUANT Stereologer (Figura 1). Além de contraste e comparação dos resultados de ambos os BIOQUANT e<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemas, este estudo fornece um protocolo detalhado para o<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos. Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em um espaço de referência dado<sup&gt; 1</sup&gt;.

Sabendo o que conta: Estereologia Imparcial no cérebro de primatas não humanos

O primata não humano é uma espécie translacional importante para a compreensão da função normal e dos processos patológicos do cérebro humano. Não enviesados...

Este procedimento começa com a definição do espaço de referência. Um atlas estereotáxico pode ser útil para determinar os limites da área de interesse. Em seguida, organize os lâminas e determine a frequência de amostragem das seções.Insira a primeira seção a ser amostrada no microscópio e preencha os parâmetros de amostragem. No sistema estereológico, uma grade será posicionada sobre o espaço de referência e, em cada interseção, um dissector óptico será amostrado. Após todos os dissetores ópticos em cada seção serem amostrados, o sistema estereológico fornecerá os resultados do estudo.Olá, sou o Dr. Mark Burke do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou a Dra. Shaheen Zur, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Morris Petto, diretor do Laboratório de Neurociência Visual da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar radiologia imparcial em primatas não humanos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estimar populações totais de neurônios em diversas áreas cerebrais. Então, vamos começar.Inicie este protocolo com um cérebro previamente perfundido. Bem, com um fixador como paraformaldeído, o cérebro deve ser posicionado no espaço estereotáxico, crioprotegido e congelado. Para visualizar esses protocolos em detalhes, consulte nosso artigo recente no JoVE, dissecando o cérebro de primata não humano.No espaço estereotáxico, o cérebro deve ser sistematicamente seccionado para conter todo o espaço de referência. Para visualizar este protocolo em detalhes, consulte o nosso artigo recente no JoVE, Banco de Cérebros: Aproveitando ao Máximo Seus Espécimes de Pesquisa. Neste experimento, utilizamos o lobo frontal do cérebro do vervet.A série é definida em uma de 10 seções ao longo do córtex e seccionada em 50 micrômetros. Para calcular o número estimado de células N, utilizamos a seguinte equação, onde SSF é a fração de amostragem de seções e A SF é a fração de amostragem de área.TSF é a fração de amostragem de espessura, na qual a espessura medida do tecido é dividida pela altura do dissector, e um cubo é o número total de objetos de interesse contados dentro do dissector. Para determinar a fração de amostragem da seção, todo o espaço de referência deve ser bem definido de anterior a posterior e de dorsal a ventral. Aqui estamos interessados no lobo frontal, que definimos como a região desde a ponta do polo frontal até o sulco central e o sulco lateral.Excluindo o lobo insular do lobo frontal deste sujeito, um total de 760 seções foi sistematicamente coletado, sendo 76 coradas com violeta de genciana. Como o objetivo era obter 10 seções ao longo do espaço de referência, uma em cada seis seções coradas com violeta de genciana foi amostrada. Isso resulta em uma fração de amostragem de seções, ou SSF, de aproximadamente uma em cada 60.Começamos aleatoriamente com uma das primeiras seções coroadas tingidas com violeta e amostramos sistematicamente o restante de uma em cada seis. Posteriormente, um total de 13 seções são amostradas para o sujeito selecionado. Para evitar vieses decorrentes de erros de reconhecimento, é imperativo seguir uma definição padrão para a característica biológica específica de interesse.Aqui, estávamos interessados em contar neurônios e definimos um neurônio como aquele que possui um núcleo visível, localizado centralmente, e um citoplasma claramente definido. Para este estudo, utilizamos o stereo, que é um sistema de teologia computadorizada. O sistema orienta o usuário a preencher as informações necessárias de maneira sequencial, passo a passo.No campo informações do estudo, são definidos os parâmetros do estudo. O parâmetro de volume deve ser selecionado para definir um espaço de referência para o estudo. O volume do objeto também pode ser selecionado aqui para estimar o volume ponderado por número para a população de objetos de interesse.Neste caso, apenas o volume do espaço de referência foi selecionado. Para cada objeto, selecione o número e defina a característica de interesse, neste caso, os neurônios. Para estabelecer as informações de amostragem, insira o intervalo de amostragem da fatia.Se forem cortadas fatias separadas de tecido exaustivamente, e cada seção for colocada em ordem sequencial, insira aqui uma delas. Em seguida, insira o número total de seções obtidas ao longo da referência e depois insira o intervalo de amostragem das seções. O sistema calculará então o número de seções a serem amostradas.Para definir a grade e dissecar um tamanho, utilize uma ampliação baixa de 2,5 a 10 x. Para definir o espaçamento da grade no menu editar para volume, a ampliação do objeto deve ser realizada a 100 x. A área do quadro é o tamanho do dissector.Neste caso, utilizamos 50% da tela. A altura do quadro é a espessura do dissector. Aqui, está definida em 10 micrômetros e determinará a fração de amostragem do tecido.O espaçamento entre quadros corresponde ao tamanho da grade. Para áreas menores, deve-se utilizar um tamanho de grade menor para este assunto, e dentro do lobo frontal, um tamanho de grade de 2.500 micrômetros fornece uma média de 254 dissecações. O tamanho da dissecação deve resultar em zero a cinco objetos contados.Neste caso, neurônios, tanto o tamanho do dissector quanto o tamanho da grade são usados para calcular a fração de amostragem da área. Uma vez que os parâmetros do estudo tenham sido estabelecidos, a amostragem através do tecido pode começar sob baixa ampliação. O programa solicitará ao usuário que trace o espaço de referência na seção.O sistema então colocará uma grade sobre a seção com base nos parâmetros pro. Essa grade é usada para calcular o volume. Em seguida, o usuário verificará se os pontos estão dentro do espaço de referência.Se um ponto não estiver dentro do espaço de referência, basta clicar no ponto para que ele não seja calculado no volume. Em seguida, o sistema colocará uma nova grade sobre o espaço de referência com base nos parâmetros de espaçamento entre quadros. As interseções nesta grade determinam onde cada dissector será posicionado.Agora, verifique se as interseções estão dentro do espaço de referência. O sistema solicitará ao usuário que mude para o objetivo de maior magnificação e mova a platina para o primeiro dissector. Neste momento, o sistema solicitará ao usuário que defina o topo e a base da seção.Isso é feito para determinar a FST, a fração de amostragem de espessura, e será repetido em cada local do dissector. Para determinar a espessura medida, foque através do plano Z até que a primeira célula entre em foco. Em seguida, retroceda ligeiramente até o topo da seção até que o último objeto apareça, quase fora de foco.Em seguida, para encontrar a base do tecido, foque através do plano Z até que as células estejam quase fora de foco ao ajustar o plano Z. Observe que as células devem estar coradas em todas as profundidades. Caso contrário, isso pode indicar uma penetração incompleta do corante ou desidratação não uniforme do tecido, situação em que as seções devem ser refeito.A altura padrão do dissector para este estudo é de 10 micrômetros. A diferença entre a altura do dissector e a espessura medida da seção é a altura de proteção, que corresponde ao volume de tecido onde nenhuma característica biológica é contada. Em seguida, o sistema define o espaço de amostragem no eixo Z.O usuário deverá então clicar em cada objeto que estiver dentro do dissector no plano Z. Os objetos que tocam as linhas vermelhas ou a parte inferior do dissector não são contados. Após a contagem de cada objeto, clique em próximo.Isso é usado para calcular o número total de objetos. A platina mover-se-á para o próximo dissector e repetirá os passos anteriores. Após todos os dissectors da seção terem sido contados, o sistema solicitará ao usuário que insira a próxima seção sequencial a ser analisada.Os passos serão repetidos até que todas as seções sequenciais tenham sido amostradas. Após a conclusão, o sistema fornecerá os cálculos para a amostragem de área, amostragem da fração de seção, fração de amostragem do tecido e o número total de objetos. Com base nesses parâmetros, o sistema gerará um volume de referência n estimado e os coeficientes de erro tanto para o número estimado quanto para o volume.Ele também fornecerá recomendações para se tornar mais eficiente ou para reduzir o coeficiente de erros. Acabamos de mostrar como realizar uma análise imparcial em um espécime biológico. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar amostragem sistemática em todo o espaço de referência, medir cuidadosamente a espessura do tecido em cada dissector óptico e ter um objeto de interesse bem definido.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

knowing-what-counts-unbiased-stereology-in-the-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do processamento normal do cérebro. A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.

Dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico

Bancário cérebro e amostragem sistemática de material biológico fornece a base para estereologia imparcial e maximiza o potencial de dados obtidos de cada espécime.

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

Fonte: Olesen, M. V., et al. A técnica do fracionador óptico para estimar o número de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva. J. Vis. Exp. (2017).  O vídeo demonstra a técnica para quantificar neurônios recém-gerados no tecido cerebral. Fatias de tecido hipocampal contendo neurônios marcados com bromodeoxiuridina (BrdU) foram coradas usando imuno-histoquímica e posteriormente quantificadas em toda a espessura do tecido usando a técnica do fracionador óptico.

Quantificando neurônios recém-gerados no tecido cerebral de ratos usando a técnica do fracionador óptico

procedimentos de corte do cérebro organizados são necessários para correlacionar fenômenos neuropsiquiátricos específicos com diagnósticos neuropatológicos definitivas. estacas cerebrais são realizados de forma diferente com base em diversas contingências clínico-acadêmico. Este protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para investigar diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e maximizar as técnicas biomolecular / neuroimagem atuais e futuras.

Symmetric Bihemispheric Postmortem Cérebro de corte para o Estudo de Saúde e Condições Patológicas cerebral em humanos

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Aqui, apresentamos um método estereológico, o fraccionador óptico, usado para quantificar a formação de novos neurônios e sua sobrevivência, no hipocampo do rato após a estimulação eletroconvulsiva. Quando implementado corretamente, a sensibilidade e a eficiência dos métodos estereológicos garantem estimativas precisas com uma precisão fixa e predeterminada.

A técnica de fracionador óptico para estimar números de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva

Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.

Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia

O método descrito abaixo visa fornecer um protocolo abrangente para a preparação de neurocirurgia de primatas não humanos (NHP) utilizando uma nova combinação de métodos de impressão tridimensionais (3D) e extração de dados de ressonância magnética.

Uma caixa de ferramentas baseada em ressonância magnética para planejamento neurocirúrgico em primatas não humanos

Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

A tomografia serial de dois fótons (STPT) é uma técnica para obter imagens de uma massa de tecido em sua forma tridimensional, combinando imagens de dois fótons com controle automático de estágio e corte de micrótomo. Aqui descrevemos um protocolo para implementá-lo para cérebros de saguis para entender melhor suas características estruturais.

Tomografia seriada de dois fótons de todo o cérebro do sagui para análises neuroanatômicas

As neurociências modernas precisam explorar as diferenças entre muitas espécies, incluindo roedores de laboratório e humanos. No entanto, surgem dificuldades técnicas quando mamíferos de cérebro grande estão envolvidos. Essa abordagem aborda a variação interespécies das populações neuronais em mamíferos amplamente diferentes, produzindo resultados comparáveis a serem mapeados para revelar padrões evolutivos.

Uma abordagem comparativa para estudos quantitativos de contagem celular em cérebros de mamíferos amplamente diferentes

Aprenda estereologia imparcial para estimar números de neurônios em regiões específicas do cérebro de primatas não humanos. Este método fornece contagens celulares precisas para pesquisa em neuroanatomia.

Sabendo o que conta: Estereologia Imparcial no cérebro de primatas não humanos

Explorar mais vídeos