Name: Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Aprenda a induzir diferenciação lactogênica em células epiteliais mamárias HC11 de rato, monitorando a formação de mamoesferas como marcador fenotípico. Este protocolo fornece um modelo confiável in vitro para estudar a regulação da diferenciação celular mamária.

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Dirigido pelo Congresso de fundos Medical Research Fund subvenção (DAMD17-01-0264) para ML Cutler e Militar dos Estados Unidos Cancer Institute para ML Cutler apoiou o trabalho.

<ol><li> O HC11 células foram cultivadas a confluência de seis dias em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, insulina 5μg/ml, 10 mM HEPES, fator de crescimento 10ng/ml epidérmico (EGF) para estabelecer competência. </li><li> As células foram lavadas com PBS e mantidos em meio de crescimento sem EGF por 24 horas. </li><li> Para induzir a diferenciação lactogênica as células foram incubadas em meios de diferenciação, isto é, RPMI com dexametasona (10 -6 M), a insulina (5 mg / ml) e prolactina (5 mg / ml) conhecido como DIP. </li><li> No horário mencionado além de pós-DIP, mammospheres foram fotografados e enumerados por microscopia de contraste de fase utilizando um microscópio Olympus IX71 com câmera digital. </li></ol> Resultados representativos: Ampliação de baixa potência do normal mamárias monocamadas de células epiteliais e mammospheres múltiplos, bem como de ampliação de alta potência de uma única mammosphere são mostrados na Figura 1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1265/1265fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Mammospheres. (A) Normal monocamadas de células epiteliais mamárias deve ser exibido como uma camada plana de células confluentes. (B) Após 3-5 dias de DIP estimulação mammospheres múltiplas aparecer. Fotografia tirada 5 dias pós-DIP disso. (C) Maior aumento de um único campo contendo mammospheres a 5 dias após o DIP disso.

<ol><li>Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectorial+secretion+by+constitutive+and+regulated+secretory+pathways+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epithelial+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells.</a> Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+induced+expression+of+connective+tissue+growth+factor+contributes+to+lactogenic+differentiation+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells.</a> J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).</li>
</ol>

Para que esta técnica seja bem sucedida e da melhor qualidade, as células epiteliais deve ser mantida a confluência antes de ser induzidos com hormônios lactogênese. Pode haver situações em que há mammospheres numerosas, o que torna a quantificação difícil. Assim, para fins quantitativos, é melhor para fotografar a mammospheres em um ponto de tempo quando o número de mammospheres é capaz de ser contado. Embora existam diversos marcadores moleculares utilizados para determinar o grau de difer...

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>21870076</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118089060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>QImaging</td><td>Retiga 2000RV Fast 1394</td><td></td></tr></tbody></table>

rato células epiteliais mamárias forma mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

Uma medida fenotípicas comumente usado para determinar o grau de diferenciação do mouse em lactogênica mamárias culturas de células epiteliais é a formação de estruturas celulares em forma de cúpula referido como mammospheres<sup&gt; 1</sup&gt;. A linhagem de células HC11 tem sido empregado como um sistema modelo para o estudo da regulação da diferenciação lactogênica mamárias tanto<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 2</sup&gt;. O HC11 células se diferenciam e sintetizar proteínas do leite em resposta ao tratamento com hormônios lactogênese. Acompanhando o crescimento do HC11 rato células epiteliais mamárias de confluência, a diferenciação lactogênica foi induzida pela adição de uma combinação de hormônios lactogênica incluindo a dexametasona, insulina e prolactina, conhecido como DIP. O HC11 células induzidas para diferenciar foram fotografados em momentos até 120 horas após a indução de diferenciação e do número de mammospheres que apareciam em cada cultura foi enumerada. O tamanho da mammospheres indivíduo se correlaciona com o grau de diferenciação e este é representado nas imagens das células de diferenciação.

HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

Uma medida fenotípica comumente utilizada para determinar o grau de diferenciação lactogênica em culturas de células epiteliais mamárias de camundongo é a formação de...

Olá, sou Bethany Morrison do laboratório da Dra. Mary Lou Cutler, do Departamento de Patologia da Universidade das Forças Armadas das Ciências da Saúde. Hoje vamos mostrar um procedimento para o desenvolvimento de mamoesferas a partir de células epiteliais mamárias de camundongo HC11. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a diferenciação lactacional.Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, as células HC 11 são cultivadas até a confluência por seis dias em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 5 microgramas por mililitro de insulina, 10 micromolar de Heiss e 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico (EGF), para estabelecer competência.Essas células têm sido extensivamente utilizadas pelos laboratórios de Nancy Hines e Bernard Groner para estudar a regulação da diferenciação gênica na cabine de cultura de tecidos. As células são então lavadas com PBS e mantidas em meio de crescimento sem EGF por 24 horas. Após essa incubação, as células são incubadas em meio de diferenciação composto por RPMI suplementado com dexametasona, insulina e prolactina para induzir a diferenciação lática após a incubação.No meio de diferenciação, utiliza-se um microscópio Olympus IX 71 equipado com câmera digital para fotografar e enumerar as mamo esferas. Por microscopia de contraste de fase, as mamo esferas são fotografadas e enumeradas várias vezes ao longo de 120 horas após a indução. Esta imagem mostra uma ampliação de baixo aumento de uma memória normal.As células de monocamada de células epiteliais devem ser mantidas em confluência por aproximadamente três dias antes da estimulação com hormônios genitais. Aqui é possível observar novas mamosferas formadas três dias após a indução, em aumento de baixa potência. Elas começam a aparecer como pequenas estruturas semelhantes a domos, distribuídas aleatoriamente entre as células epiteliais.Novamente em baixa potência. Aqui se observa múltiplas mamosferas que se desenvolveram cinco dias após a indução. As mamosferas continuaram a crescer em tamanho e número; em alta magnificação, a característica bolha ou em forma de cúpula da mamosfera pode ser claramente vista.Acabamos de mostrar como induzir células epiteliais da memória, para que formem esferoides mamários, que são utilizados como marcadores de diferenciação genética. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as células em confluência antes da indução, porque, durante esse período, as células produzem proteínas da matriz com as quais precisam interagir para responder plenamente aos hormônios genéticos. Também é importante lembrar-se de remover o EGF do meio antes do tratamento, porque o EGF inibirá o processo de diferenciação.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este método descreve como dissecar e avaliar o desenvolvimento da glândula mamária e na função de camundongos. Excisadas glândulas mamárias são avaliados quanto ao grau de desenvolvimento usando montar todo, enquanto a ejeção do leite é avaliada através de um ensaio de oxitocina baseado contração mioepiteliais celular.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Este vídeo descreve o isolamento de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de câncer de mama. Cultivamos essas células-tronco cancerígenas para gerar mamosferas primárias para avaliar a auto-renovação e calcular a eficiência de formação de esferas, permitindo a comparação entre diferentes densidades de semeadura.

Geração de Mamosferas Primárias: Uma Técnica para Determinar a Potência Celular

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Os ensaios de mamosfera flutuante podem investigar o subconjunto de células-tronco de câncer de mama que sobrevivem em condições de suspensão e mostram tumorigênese aumentada quando implantadas em camundongos.  Este protocolo fornece uma medida in vitro conveniente da capacidade de formação de esferas, um proxy para a tumorigênese in vivo, ao mesmo tempo em que facilita a análise da paisagem transcricional associada ao tronco.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Este protocolo descreve métodos para purificar, quantificar e caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exossomos de células epiteliais mamárias não aderentes / mesenquimatosas e para utilizá-las para transferir a capacidade de formação de glândula mamária para células epiteliais mamárias luminal. EVs / exosomas derivados de células epiteliais mamárias semelhantes a tronco podem transferir esta propriedade celular para células que ingerem EVs / exossos.

Transferência de capacidade de formação de glândulas mamárias entre células epiteliais basais mamárias e células luminal mamárias através de vesículas / exossos extracelulares

Descrevemos técnicas de indução de diferenciação de duas linhas epiteliais mamárias, HC11 e EpH4. Embora ambos exijam soro fetal, insulina e prolactina para produzir proteínas lácteas, as células EpH4 podem se diferenciar totalmente das mamografias na cultura tridimensional. Esses modelos complementares são úteis para estudos de transdução de sinal de diferenciação e neoplasia.

Diferenciação das células Epiteliais do Peito do Camundongo HC11 e EpH4

Aqui, descrevemos a implementação e interpretação dos resultados de um ensaio quantitativo de auto-renovação in vitro mammosphere.

Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.

Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial

Este protocolo descreve o método para configurar o ensaio de formação da mamosfera para estudar a estano do câncer induzida pelo Inibidor da Apoptose 5 (Api5) em células epiteliais mamárias não tumorigênicas. Lisados coletados de mamosferas de geração primária são analisados para diferentes marcadores de caule para avaliar a indução de propriedades semelhantes às células-tronco.

Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas

Aprenda a induzir diferenciação lactogênica em células epiteliais mamárias HC11 de rato, monitorando a formação de mamoesferas como marcador fenotípico. Este protocolo fornece um modelo confiável in vitro para estudar a regulação da diferenciação celular mamária.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

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