Name: Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda métodos de gametogênese, acasalamento e dissecção de tétrades em Chlamydomonas reinhardtii para análise genética. Estes protocolos facilitam estudos de herança nuclear e genética de organelas em alga verde modelo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este protocolo é baseado em técnicas aprendidas no laboratório de Francis-André Wollman na França Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris,. Os autores têm uma dívida de gratidão para com Jacqueline Girard-Bascou, que originalmente introduzido DBS para Chlamydomonas técnicas genéticas. Chlamydomonas pesquisa no laboratório dos autores é suportado pelo National Science Foundation prêmio MCB-0646350.

Parte 1: Preparação de cepas de gametogênese Nota: Todas as manipulações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Temperaturas superiores ou inferiores irá afetar a velocidade de germinação zigoto e pode afetar adversamente a viabilidade. Consideração importante: é essencial que as cepas de ser acoplado estão crescendo robustamente e estão livres de contaminação de fungos ou bactérias. Se as cepas não foram transferidos regularmente, passagem em meio rico deve preceder geração de gametas. <ol><li> Cepas para ser acoplado são transferidos para placas TAP (100 × 15 mm), 1-2 cepas por placa. As células devem ser cultivadas em uma faixa concentrada cerca de 1 cm de largura. </li><li> Incubação em placas TAP deve continuar até que uma espessa camada de forma robusta as células de crescimento está presente, com as transferências intermediárias, se necessário. Cepas que não foram recentemente várias passagens podem exigir uma passagem e um total de uma semana, enquanto que linhagens selvagens em uso regular pode levar apenas alguns dias e sem passagens. Mutantes que são sensíveis à luz pode necessitar de tempo adicional. </li><li> Transferência de todas as células das placas TAP para placas de N10, que são deficientes de nitrogênio e começarão a induzir a gametogênese. Transferência das células como uma laje de espessura, tanto quanto eles estavam presentes na placa TAP. Isso irá facilitar a recolha subsequente das células. Após 3 dias em N10, as células são preparados para passar gametogênese. Divisão celular será lenta no N10, no entanto as células devem permanecer verde escuro. Qualquer cepas contaminados devem ser descartados como zigotos viáveis ​​não será obtida. </li></ol> Parte 2: Acasalamento <ol><li> Cada cepa é transferido para um erlenmeyer de 50 ml e ressuspenso em aproximadamente 2,5 ml de água destilada estéril. Isto pode ser feito usando um laço de arame ou um pedaço de pau estéril; o que é importante é que as células estão bem suspensa, e não em grupos. O volume exato de água deve ser ajustada de modo que a concentração de células, como medido por olho, é aproximadamente o mesmo para cada estirpe. </li><li> Células são agitadas sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s) por 2 horas, tempo durante o qual as células se tornará gametas móveis. Motilidade deve ser verificada com um microscópio de luz. Se os gametas estão nadando mal, o acasalamento é susceptível de ser ineficiente. No entanto, mesmo mal cepas móveis será companheiro de uma freqüência reduzida. </li><li> Em seguida, volumes iguais de mt mt + e-gametas são combinados em um único frasco ml 50. Gametas são deixados sob a luz forte (1,260 E μ / m 2 / s), sem agitação. </li><li> Acasalamento pode ser verificado imediatamente sob o microscópio de luz. Pares de gametas formam rapidamente, e aparecerá como células que se move rapidamente juntou-se ao flagelo. Se o acasalamento parece ser extremamente rápida, as amostras devem ser tomadas no prazo de 30 hr min -1 para a geração de zigotos. Se não, o acasalamento pode ser verificado a cada hora, embora isto seja opcional. Desde os tempos dando a densidade ideal de zigotos irá variar muito entre cruzes, é melhor tomar alíquotas da mistura de acasalamento em diferentes momentos após a combinação de gametas, por exemplo, após 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas. Isto é feito através da transferência de 300 amostras mL a TAP-3% agar Difco 60 × 15 placas mm; pontos 3-4 por prato. Tenha cuidado para não agitar a mistura de acasalamento, pois isso pode atrapalhar os casais. Difco agar é usado porque ele tem menos de contaminantes de menor preço ágares, e será mais fácil ver zigotos sob o microscópio. A mistura de acasalamento não utilizado pode ser deixado no frasco durante a noite, ea qualidade da reação de acasalamento será óbvio no dia seguinte. Quando o acasalamento é eficiente, os zigotos irá aderir à parede ou fundo do frasco eo meio será claro. Mesmo agitação do frasco deixará de desalojar os zigotos. Se varas nada para o vidro quando a mistura é agitada com vigor razoável, de acasalamento, em seguida, foi ineficiente ou não ter lugar. </li><li> As placas TAP Difco contendo mistura de acasalamento são secos em uma capa estéril, com as tampas abertas, até que o líquido de superfície tenha sido absorvida. As placas são geralmente deixados à luz (700 NE / m 2 / s) por 18 horas, em seguida, embrulhado em papel alumínio, uma vez que a maturação zygospore só terá lugar no escuro. As cepas cruzou, o acasalamento hora ea data são escritos em ambas as placas e as folhas. Placas são armazenados 5 a 7 dias e podem ser mantidos por mais tempo, embora a eficiência de germinação do zigoto declina progressivamente. </li></ol> Parte 3: Dissecção Tétrade <ol><li> Células vegetativas deve ser raspada manchas secas de mistura de acasalamento usando uma lâmina cega, como um bisturi. A lâmina pode ser usada para expor uma área de zigotos, que vai ficar bem para o ágar 3%. Este passo é feito geralmente no período da tarde, para que os zigotos têm germinado na manhã seguinte, mas não submetido a uma divisão, segundo vegetativo querendimento de 8 progênie. biólogos Chlamydomonas aprender rapidamente a reconhecer zigotos sob o microscópio, já que eles são maiores do que as células vegetativas, e apresentam uma parede grossa zygospore que dá um contorno preto. Zygospores muitas vezes aparecem amarelo, mas também pode ser um pouco verde. O personagem mais importante é que eles furar a agar, enquanto as células vegetativas são prontamente mudou de lado. No entanto, se as placas são excessivamente seco este não será o caso. Além disso, se a mistura de acasalamento era muito denso, zigotos podem formar uma esteira que vai fazer a transferência de zigotos individuais difícil ou impossível. Densidades adequadas são estabelecidas no passo 2.1, e serão rapidamente aprendeu com a experiência. </li><li> Agulhas de vidro são preparados para a recolha de zigotos e separando progênie tétrade. Estes são preparados por puxar três bastões de vidro mm em uma pequena chama para gerar um fio longo e fino, que pode ser quebrada. As dicas destes extremidades afiladas são suavizadas ou dobrado em ganchos, por aquecimento em um breve fogo baixo (álcool ou um fósforo aceso). Prepare 3 ou mais agulhas de vidro, uma vez que eles quebram facilmente, especialmente para usuários inexperientes. </li><li> Zigotos estão reunidos na 3% placa TAP Difco, usando uma agulha de vidro em uma pilha pequena. Um quadrado de agar (até 0,5 cm 2), contendo os zigotos é formado e retirado com um bisturi maçante. Então, o bloco de agar é colocado de bruços sobre a 15 mm Placa de 1,5% TAP Difco, e deslizou ao longo de uma linha horizontal de cerca de 1,5 cm do topo da placa, para distribuir os zigotos. A linha superior horizontal, e uma grade com cerca de 1,5 cm horizontal e 0,5 cm vertical espaçamento são gravados na parte de trás das placas. A grade será utilizado no dia seguinte como um guia para separar a progênie tétrade (a grade também pode ser gravado no dia da dissecção). Finalmente, zigotos individuais são mover-se para as intersecções das linhas horizontal superior com cada linha vertical, com cerca de 20-30 zigotos por placa. Embora somente 12 ou assim vai ser dissecado, nem todos os zigoto germina, e alguns vão dividir duas vezes antes de estourar, então zigotos extras são necessários. </li><li> Após distribuir os zigotos e células vegetativas que foram acidentalmente transferidos da placa de ágar 3% são mortos por exposição da placa invertida por 30 segundos sobre um prato de vidro contendo uma camada (1-2 mm) de espessura de clorofórmio. A distância entre a placa eo clorofórmio devem ficar cerca de 5 cm. Se clorofórmio é muito usado, ou se a distância for muito pequena ou grande, se arrisca quer o abate zigotos, ou não matar as células vegetativas. O tratamento clorofórmio deve ser feito imediatamente após a zygospores foram distribuídos na chapa de germinação, para garantir a seletividade. </li><li> Germinação leva 16-20 horas para a maioria das cepas, mas vai variar com o genótipo e com a idade dos zigotos. Para a germinação, as placas são colocadas sob pouca luz (239 NE / m 2 / s), ou em luz média esmaecido, cobrindo a placa com um lenço de papel. </li><li> Zigotos germinadas podem ser identificados sob o microscópio as células inchadas ou às vezes estourar com células-filhas dentro deles. Se o zygospore não rompeu, tocando suavemente com uma agulha de vidro vai quebrar a parede, se a germinação ocorreu. Células-filhas são suavemente arrastada para os pontos de grade abaixo do zigoto. É mais fácil fazer isso através da captação da célula de uma pequena quantidade de meio líquido liberado do ágar pela pressão da agulha de vidro, e arrastando essa &quot;poça&quot; por trás da agulha. Uma forma de &quot;seguro&quot; de que se tem dissecou um zigoto e não uma célula vegetativa que tem o dobro dividido, é que além da filha de quatro células, a &quot;pele&quot; da parede zygospore permanecerá. </li><li> A progênie dissecados são cultivadas em condições adequadas até clonies visível podem ser colhidas para análise posterior. As placas devem ser monitorados diariamente para a contaminação. </li></ol> Nota: Geração de diplóides vegetativo não é coberto aqui, mas envolve essencialmente a mistura de revestimento de acasalamento em meio que não irá apoiar o crescimento de qualquer cepa parental, mas vai apoiar o crescimento do diplóide (por exemplo, dois marcadores auxotropic diferentes). Placas são mantidas na luz para evitar a formação de zigotos.

<ol><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2nd Edition, Academic Press. San Diego, CA. Volume 1 119-273 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Análise genética é simples em Chlamydomonas, mas exige técnicas específicas para gerar gametas e progênie tetrad separado. Com cepas saudável, as técnicas são facilmente adquiridos. Com alguns mutantes, torna-se mais de uma arte, e os leitores devem consultar Volume 1 do Livro de Chlamydomonas recentemente publicado por notas históricas e dicas práticas. Além disso, deve-se notar que há muitas variações sobre o tema básico descrito acima, que vão desde o método para induzir gametogênese, para ...

<table><tbody><tr><td>CC-125</td><td>Estirpe do tipo de acasalamento &lt;em&gt;plus&lt;/em&gt;</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CC-124</td><td>Estirpe do tipo de acasalamento &lt;em&gt;minus&lt;/em&gt;</td><td>Chlamydomonas Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP)</td><td>Meio de crescimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N10</td><td>Meio de crescimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td><td>Ferramentas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>BD Surgical Blade Handles</td><td>Ferramentas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-914-5</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Metal Scalpels</td><td>Ferramentas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-920A</td><td></td></tr></tbody></table>

acasalamento e separação da tétrade chlamydomonas reinhardtii para análise genética

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

A alga verde unicelular<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Tornou-se um organismo popular para pesquisas em diversas áreas da biologia celular e genética por causa do seu ciclo de vida simples, facilidade de cultivo e manipulação de análise genética, genômica recursos, e transformabilidade do núcleo e ambas as organelas. Cepas de acasalamento é uma prática comum quando abordagens genéticas são usados ​​em<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Para criar diplóides vegetativo para a análise de dominância, ou após a dissecção tetrad à herança nuclear vs organellar verificar, testar alelismo, para analisar epistasia, ou para gerar populações com a finalidade de mapa-base de clonagem. Além disso, cruzamentos genéticos são usados ​​rotineiramente para combinar com genótipos organellar especial genótipos nuclear. Aqui demonstramos métodos padrão para a gametogênese, o acasalamento de germinação, zigoto e separação tétrade. Este protocolo consiste de uma série fácil de seguir de etapas que farão abordagens genéticas passíveis de cientistas que estão menos familiarizados com<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Parâmetros-chave e pontos de conflito são explicados. Finalmente, os recursos para obter mais informações e métodos alternativos são fornecidos.

Acasalamento e separação tetrad são necessários para análise genética em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Aqui demonstramos métodos padrão para a gametogênese, o acasalamento de germinação, zigoto e dissecção tétrade. Este protocolo consiste de uma série fácil de seguir de etapas que farão abordagens genéticas passíveis de cientistas que estão menos familiarizados com<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

A alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) tornou-se um organismo popular para pesquisas em diversas áreas da biologia celular e ...

Chlamydomonas é uma alga verde unicelular que se divide assexuadamente em condições ideais de crescimento. Quando as condições se deterioram, o organismo entra em um ciclo de reprodução sexuada. A gametogênese pode ser induzida transferindo-se cepas do meio TAP auger para um meio deficiente em nitrogênio, e 10 células auger são ressuspendidas e agitadas sob luz intensa para gerar gametas MT positivo e MT negativo, que são então combinados em um único frasco para acasalamento; as amostras são depositadas em uma placa de meio TAP auger sob luz, e em seguida embrulhadas em papel alumínio para maturação zigótica.Após cinco a sete dias, as células vegetativas são raspadas, expondo os zigotos, que estão firmemente aderidos ao parafuso sem-fim. Estes são transferidos para placas TAP DCO para germinação. Em luz baixa, os tétrades são então separados e cultivados em condições apropriadas.Até que colônias visíveis apareçam, estas podem ser selecionadas para análises subsequentes. Olá, sou David Stern, presidente do Boy Thompson Institute for Plant Research. Hoje vamos mostrar a vocês os procedimentos de cruzamento e dissecção de tétrades para a alga verde modelo clam MOUs REINE hearty eye.Mu

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares.

MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads

Mutantes letais sensíveis à temperatura (ts) são ferramentas valiosas para identificar e analisar funções essenciais. Aqui descrevemos métodos para gerar e classificar seus mutantes letais em alto rendimento.

Alto Throughput Robotically Isolamento Assistida da temperatura sensível Lethal Mutantes em<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Nós desenvolvemos uma estratégia para purificar e um grande número de centríolos em diferentes orientações favoráveis para microscopia de super-resolução e único-partícula média da imagem.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

A análise em todo o sistema de múltiplas biomoléculas é crucial para obter insights funcionais e mecanísticos em processos biológicos. Por este meio, um extenso protocolo é descrito para extração de alto débito de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas sincronizada.

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

A reativação in vitro de células motil é um experimento crucial na compreensão dos mecanismos da motilidade celular. O protocolo descreve a reativação dos modelos de células demembradas de Chlamydomonas reinhardtii, um organismo modelo para estudar cílio/flagela.

Reativação de Modelos celulares desmembrados em Chlamydomonas reinhardtii

A maioria dos organismos fotoautotróficos da natação apresentam alterações comportamentais induzidas por foto (comportamento fotográfico). O presente protocolo observa o referido comportamento fotográfico no organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii.

Observação do Comportamento Fotográfico em Clamídomonas reinhardtii

Aprenda métodos de gametogênese, acasalamento e dissecção de tétrades em Chlamydomonas reinhardtii para análise genética. Estes protocolos facilitam estudos de herança nuclear e genética de organelas em alga verde modelo.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

Explorar mais vídeos