Criação de Murina Experimental aneurismas de aorta abdominal com Elastase
23 de julho de 2009
Este vídeo mostra como induzir aneurismas da aorta abdominal (AAA) em camundongos através de infusão intraluminal transitória da elastase pancreática suína no segmento de infra-renal da aorta abdominal. O modelo tem a capacidade de adicionar uma visão ampla para o pathobiology da AAA, devido ao surgimento de inúmeros transgênicos e camundongos knockout do gene.
Este procedimento cirúrgico utilizado para criar um aneurisma da aorta abdominal começa com uma incisão abdominal mediana. O conteúdo abdominal é afastado e todos os ramos da aorta são ligados. As porções proximal e distal da aorta são amarradas.
O coração é perfurado com uma agulha e uma perfusão de elastase é administrada através de um tubo de polietileno com ponta aquecida. Quando a perfusão é concluída, a autotomia da AOR é fechada. As ligaduras são removidas, a aorta se enche de sangue e a cavidade abdominal é fechada.
A seguir, permite-se que o camundongo se recupere e o aneurisma estará completamente dilatado em 14 dias. Olá, sou Julian Asma do laboratório de Células Fetais do Departamento de Medicina Cardiovascular da Universidade de Stanford. Hoje vou mostrar o procedimento para injetar um novo aneurisma experimental da aorta abdominal com elastase.
Utilizamos este procedimento em seu laboratório para estudar os EPs da arte abdominal S.So. Vamos começar. Para iniciar seus experimentos, selecione um camundongo de interesse, por exemplo, um camundongo C57 black six, e anestesie-o com isoflurano inalado até que o camundongo perca a consciência. Observe que diferentes linhagens de camundongos variarão na taxa de crescimento de aneurismas.
Retire o camundongo anestesiado da câmara em uma estação de preparo adequadamente iluminada. Apare os pelos do abdômen desde a extremidade do osso púbico até a raiz das pernas. Utilize creme depilatório para remover os pelos excedentes.
Esfregue a pele nua com álcool a 70% até que todos os pelos sejam removidos da região raspada. Em seguida, esfregue a pele no mínimo três vezes com Betadine, intercalando com álcool entre cada esfregaço. Agora, posicione o camundongo em decúbito dorsal sobre o campo operatório para mantê-lo inconsciente.
Durante a cirurgia, coloque um tubo no nariz que fornece isoflurano na mesma taxa de fluxo utilizada para induzir a inconsciência. A elastase é mantida em gelo e transferida para uma seringa. A seringa é então fixada com um grampo e colocada ao lado do campo operatório, e o cateter é conectado.
É importante que a ponta do cateter permaneça estéril, o que é feito colocando a ponta em um frasco estéril. Antes de abrir o camundongo, certifique-se de que será utilizada técnica estéril. Comece colocando luvas estéreis.
Os instrumentos cirúrgicos, tesouras, pinças para agulhas e pinças devem ser sanitizados antes da cirurgia. Reserve um momento para estar atento aos seus preparativos e tente corrigir quaisquer outras fontes potenciais de contaminação durante o procedimento cirúrgico. Se a técnica estéril for comprometida durante o procedimento, reesterilize seu instrumento em um esterilizador por calor em pérolas.
Uma vez que tudo esteja preparado, inicie a cirurgia com uma incisão abdominal mediana longa dentro da cavidade abdominal. Desloque o conteúdo abdominal para o espaço abdominal livre ou retraiam-no para fora do abdômen com gaze estéril para expor a aorta abdominal. Agora, use pinças para isolar cuidadosamente a aorta abdominal desde o nível da veia renal esquerda até a bifurcação.
No caso apresentado, há um único ramo localizado acima do local onde ligamos a aorta, portanto não é necessário amarrá-lo. Se houver ramos aórticos entre os locais das ligaduras aórticas distal e proximal, então ligue os ramos a até um centímetro da bifurcação com 10 suturas aut, nos segmentos proximal e distal da aorta. Coloque ligaduras temporárias de seda 6.0 para interromper o fluxo sanguíneo.
Agora realize uma autotomia na bifurcação. Comece perfurando a bifurcação com uma agulha de calibre 30. Um tubo de polietileno cônico aquecido pode ser introduzido através da autotomia AOR e fixado com um nó.
Use a pinça para inserir cuidadosa e gentilmente o tubo na aorta. Tenha cuidado para não remover a camada endotelial usando uma pressão de 100 mililitros. Mercúrio perfundiu a aorta com elastase a partir de uma bolsa de soro fisiológico suspensa à altura de 136 centímetros.
Certifique-se de que não haja ar no tubo; caso contrário, a pressão não será exata. O soro fisiológico contém 4,5 unidades por mililitro. Elastase pancreática suína tipo I, e deve preencher a aorta em cinco a 15 minutos.
Durante a perfusão, a aorta geralmente se dilata até cerca de 140% do seu diâmetro original. Ao finalizar, remova a perfusão e feche a autotomia aórtica com sutura 10-0 para evitar constrição. Após o fechamento da autotomia, a ligadura distal também deve ser removida.
Se houver pouca ou nenhuma hemorragia na autotomia reparada, a ligadura proximal é removida. Se houver sangramento, coloque ligaduras temporárias adicionais de fio 6.0 nas porções proximal e distal da aorta e adicione mais um ponto para fechar completamente a autotomia da AOR. A aorta expandida encherá com sangue imediatamente após a remoção da ligadura proximal.
Uma vez que o procedimento na aorta tenha sido concluído, retorne os intestinos ao abdômen. Se foram retratados, os intestinos escorregarão de volta como uma unidade grande, e não será necessário se preocupar com sua geometria. Com todos os órgãos em posição, a ferida externa pode agora ser fechada em duas camadas com seis suturas de náilon aut e polipropileno.
Agora, administre ao camundongo um anestésico local, como uma gota de 0,25% boop de ICAN por centímetro de incisão. Também administre uma dose do anti-inflamatório Carin a cinco miligramas por quilograma por injeção subcutânea. A cirurgia está agora concluída e o camundongo deve ser colocado em uma área aquecida, onde poderá retomar a consciência.
A recuperação geralmente ocorre dentro de 15 minutos. Quando o camundongo recupera a consciência, ele é devolvido a uma gaiola individual e monitorado periodicamente durante sua recuperação. Após o procedimento, a aorta geralmente se dilata para cerca de 140 a 160% do seu diâmetro original.
Essa dilatação inicial é observada com estabilização até o sétimo dia. Uma dilatação secundária rápida ocorre entre o sétimo e o 14º dia. No 14º dia, o aneurisma pode ser observado na aorta infrarrenal.
Acabei de mostrar como induzir aneurisma aórtico abdominal com elastase em camundongos. Ao realizar este procedimento, é importante evitar a formação de coágulos sanguíneos dentro da aorta. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra o procedimento cirúrgico para induzir aneurismas da aorta abdominal (AAA) em camundongos utilizando elastase pancreática de porco. Este modelo fornece insights sobre a patobiologia do AAA por meio do uso de diversos camundongos transgênicos e com genes "knockout".
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vascular
- Modelos Animais
Contexto
- As aneurismas da aorta abdominal são condições vasculares significativas.
- O entendimento da AAA pode levar a estratégias terapêuticas melhores.
- Modelos animais são cruciais para o estudo da patobiologia das doenças.
- Camundongos transgênicos e com genes "knockout" fornecem insights únicos sobre os mecanismos das doenças.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método para induzir AAA em camundongos.
- Explorar a patobiologia da AAA utilizando um modelo animal confiável.
- Facilitar pesquisas utilizando diversos camundongos geneticamente modificados.
Métodos Utilizados
- Incisão abdominal mediana para acessar a aorta.
- Ligadura dos ramos aórticos para isolar a aorta.
- Administração de elastase pancreática de porco através de um tubo de polietileno.
- Fechamento da cavidade abdominal após o procedimento.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de AAA no modelo murino.
- Demonstração da eficácia da técnica cirúrgica.
- Potencial para estudos adicionais utilizando este modelo.
- Conhecimentos sobre a patobiologia da AAA obtidos com camundongos transgênicos.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para a indução de AAA em camundongos.
- Este modelo pode aprimorar a compreensão dos mecanismos da AAA.
- Pesquisas futuras podem aproveitar este modelo para obter insights terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo murino de aneurisma da aorta abdominal (AAA) induzido por elastase permite a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos para a pesquisa de doenças vasculares. Esta plataforma oferece confiança preditiva na avaliação pré-clínica de candidatos terapêuticos e facilita a continuidade translacional por meio do uso de linhagens de camundongos geneticamente modificados. Sua reprodutibilidade e escalabilidade tornam-no um pilar fundamental para a triagem de portfólios na descoberta de fármacos cardiovasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da patobiologia da AAA utilizando camundongos transgênicos e knockout.
- Apóia a validação funcional de alvos ao modelar a ruptura da elastina observada na AAA humana.
- Facilita a desmistificação mecanicista de alvos candidatos no remodelamento vascular.
- Oferece um sistema robusto para a elucidação de vias baseada em hipóteses.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece uma plataforma in vivo validada para avaliar intervenções terapêuticas na AAA.
- Fornece medições reprodutíveis e quantitativas da dilatação aórtica em pontos temporais definidos.
- Apoia a padronização de ensaios e a comparabilidade entre estudos para triagem de compostos.
- Permite escalabilidade e reutilização em coortes de camundongos geneticamente diversos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se aos mecanismos relevantes para a doença observados na patologia humana de AAA.
- Facilita a descoberta e validação translacional de biomarcadores em um ambiente controlado.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de candidatos terapêuticos para as etapas pré-clínicas.
- Garante a continuidade desde a descoberta genética até a validação funcional pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo integra desde a descoberta inicial até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica em pipelines de pesquisa cardiovascular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação mecanicista dos fatores causadores de AAA.
- Triagem: Fornece um ensaio in vivo reprodutível para avaliação quantitativa da dilatação aórtica.
- Análises: Permite a medição da cinética da dilatação e a comparação estatística entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas genéticas a resultados funcionais em um sistema relevante para a doença.
- Reutilização Empresarial: Atua como uma plataforma reutilizável para diversos estudos genéticos e farmacológicos em AAA.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de AAA.
- Valor Operacional: Oferece procedimentos in vivo padronizados, reprodutíveis e escalonáveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir e melhora a eficiência do capital em portfólios cardiovasculares em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas terapêuticos vasculares.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas e anestesia em camundongos.
- Exige acesso à estereomicroscopia e sistemas de perfusão controlados por pressão.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes dos protocolos cirúrgicos e analíticos.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de camundongos devido às taxas variáveis de crescimento de aneurismas.
- Atenção cuidadosa à técnica asséptica e ao monitoramento pós-operatório é essencial para a reprodutibilidade.
