A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Este procedimento começa com o recebimento de um cérebro perfundido, externalizado e crioprotegido com 4% de PFA, que foi enviado aos associados da Neuroscience para incorporação usando pontos de alinhamento embutidos na matriz circundante. O cérebro pode ser seccionado no plano coronal para produzir cortes seriados na espessura desejada, que representará toda a extensão ântero-posterior do cérebro usando cestos e recipientes especializados. O imunoprocessamento em lote pode ser realizado para determinar o padrão de expressão espacial de uma proteína em todo o cérebro.

Olá, sou o Dr. Shaheen Zur, do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Mark Burke, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou Dr.Mo Petto, diretor do Laboratório de Neurociência Visual da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.

Hoje mostraremos um procedimento de imunocoloração em lote para detecção de proteínas em larga escala em um cérebro de macaco inteiro. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar os padrões de expressão de proteínas-alvo em todo o cérebro e para comparar e contrastar a expressão dessas proteínas dentro do mesmo cérebro. Então vamos começar.

Antes do processamento histológico, obter um cérebro de primata, que foi preservado por perfusão sistêmica e pós-fixação e crioprotegido usando soluções graduadas de sacarose. Nesta fase, o cérebro é enviado para associados de neurociência para ser incorporado e seccionado livremente usando sua tecnologia proprietária. Ao retornar, observar-se-á que sete pontos de referência de alinhamento são colocados na matriz de incorporação para que as seções possam ser orientadas adequadamente e realinhadas após a conclusão do processamento histológico.

Enquanto o seccionamento é realizado, são tiradas imagens digitais que podem ser usadas posteriormente para reconstrução 3D de mapas anatômicos. Os neurocientistas associados processam nosso tecido para produzir seções coronais flutuantes livres de 50 micrômetros de espessura em todo o cérebro. Depois de concluído, podemos iniciar o processamento histológico das seções.

Quando começamos o processamento histológico, normalmente temos cerca de 140 seções para manusear por anticorpo ou coloração. Aqui demonstraremos a técnica com uma amostra menor de seções tratadas com o anticorpo SMI 32, que é um anticorpo monoclonal contra proteínas de neurofilamento não fosforiladas. Ao longo do procedimento, são utilizados pratos e cestos de coloração especializados, permitindo que um grande número de seções flutuantes sejam processadas simultaneamente e de forma eficiente.

Isso garante que a mancha resultante seja consistente em todas as seções. O primeiro passo é incubar as seções em uma solução à base de PBS contendo TRITTON X 100 e soro de cavalo normal por 60 minutos. Isso reduzirá a ligação inespecífica de moléculas de anticorpos que resulta em coloração de fundo.

Em seguida, as seções são incubadas durante a noite. Em uma solução de anticorpo SMI 32 à base de PBS, suplementada com tritton X 100 e soro de cavalo normal no dia seguinte, as seções são lavadas por três períodos de 10 minutos em solução de lavagem e depois incubadas por duas horas em temperatura ambiente. Em uma solução de anticorpo secundário Muse biotinilado à base de PBS contendo Triton X 100 e soro de cavalo normal.

Após uma série de três lavagens adicionais de 10 minutos, as seções são colocadas em uma solução de complexo de peroxidase de rabanete conjugado com biotina avadon por uma hora em temperatura ambiente. Finalmente, após outra série de lavagens, as seções são colocadas em uma reação de D aminobenzina por 10 minutos, o que produz uma mancha marrom dentro dos neurônios imunorreativos. A reação é então interrompida removendo a cesta de coloração e imergindo as seções em PBS.

Depois de dois a três, enxágues de cinco minutos nas seções PBS estão prontos para serem montados individualmente em lâminas de vidro para iniciar o processo de montagem usando uma grande placa de Petri e pincéis muito macios. As seções são levantadas do recipiente tampão PBS e montadas individualmente em lâminas de vidro revestidas de gelatina. As amostras são então deixadas secar ao ar durante a noite em uma capela no dia seguinte.

As seções são enxaguadas mergulhando-as em água desionizada para lavar quaisquer cristais de sal que possam ter sobrado do processo de montagem. As lâminas são então desidratadas em etapas graduadas de etanol, limpas com xileno e cobertas com meio de montagem por montagem. Nesta fase, as lâminas devem ser armazenadas por cerca de uma semana a 10 dias na posição horizontal para permitir que o meio de montagem endureça.

Depois disso, as lâminas podem ser armazenadas em uma caixa de lâminas ou submetidas a imagens por microscopia. Este método produz um perfil de expressão completo de uma proteína-alvo de interesse em todo o cérebro de um macaco. Aqui mostramos seções coronais representativas que fornecem um instantâneo da expressão FMRP, new n e SMI 32.

No mesmo cérebro de macaco. Acabamos de mostrar como completar a coloração imunológica em lote para uma proteína-alvo de interesse em todo o cérebro. Ao fazer este procedimento, é importante garantir que todas as seções sofram uma leve agitação enquanto são incubadas em várias soluções e que permaneçam sempre completamente imersas.

Além disso, não se apresse enquanto monta as dissecações com vidro e remova o máximo possível de rugas e dobras sem danificar a integridade do tecido. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.