Name: Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a purificação e cultura de ilhotas pancreáticas humanas usando gradiente de Ficoll para transplante clínico. Este método automatizado garante alta qualidade e viabilidade das ilhotas isoladas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Suportado pela fundação da Universidade de Illinois em Chicago, bem como celular Islet Resource Center NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.

1. Purificação de ilhotas <ol><li> Para iniciar o processo de purificação de ilhotas, carregar o saco de COBE, braçadeira todos os tubos exceto o tubo verde, e defina a velocidade para 1.500 e os super fora a 0. </li><li> Na capa configurar os copos bomba e gradiente e conectar o tubo de coleta para o tubo verde. </li><li> Agora o carregamento do Ficoll 1,100 pode começar: push &quot;spin&quot; em seguida, adicione 110 ml de Ficoll 1,100 para o copo da frente, e começar a bomba, a fim de carregar o saco de COBE. Como o Ficoll é carregado, pressione super-out, parar a bomba, unclamp a cabeça da bomba e definir a velocidade com super 100. </li><li> Quando o Ficoll atinge o copo e todo o ar é expulso da tubulação, re-braçadeira na cabeça da bomba. Definir a velocidade de rotação de 3.000, ea velocidade com super 0. </li><li> Agora prepare-se para carregar os gradientes vertendo o gradiente pesado no copo da frente. Ligeiramente liberar o grampo entre os dois copos para remover qualquer ar. Em seguida, despeje o gradiente de luz para o copo de volta. </li><li> Ligar o agitador magnético, pressione &quot;spin&quot; na máquina COBE, remova o grampo do tubo que conecta os dois copos, e verifique visualmente se os gradientes pesados ​​e leves são a mistura. </li><li> Uma vez iniciados os gradientes de mistura, ligar a centrífuga. Espere um minuto, e depois ligar a bomba para carregar os gradientes de mistura. </li><li> Para carregar o tecido deixa o gradiente escassear no copo da frente, mas não baixa o suficiente para permitir que o ar a entrar no tubo de carga, então reclamp o tubo que liga os copos e carregar o tecido. </li><li> Continue adicionando o resto do tecido. Em seguida, lave o tubo que mantinha o tecido com 50 ml de solução de lavagem, e usá-lo para lavar o copo da frente. </li><li> Como o último do tecido entra no saco, simultaneamente parar a bomba, unclamp na cabeça da bomba e pinça tubagens acima do saco. Continuar a centrifugar por 5 minutos. </li><li> Enquanto continua a centrifugação, trazer os 12 tubos de coleta para a capa e afrouxe suas tampas. Conecte o tubo de coleta para o tubo amarelo, e colocar a ponta de coleta estéril em um tubo cônico. Então unclamp o tubo amarelo, e prender o tubo verde. </li><li> Quando termina a rodada, levante lentamente Superout a 100. Coletar em tubo de 150 ml 1. Em seguida, coletamos 30 ml em tubos de 2-12 (200-230 ml). </li><li> Uma vez que coleção é completa, pressione &quot;STOP&quot; no COBE. Agora que terminou de purificação, as ilhotas podem ser avaliados e cultura. </li></ol> 2. Amostragem e cultura <ol><li> Depois de coletar as frações purificadas ilhotas, retirar uma amostra de cada um dos 12 tubos de coleta e mancha com Ditizona. A coloração vai mostrar quais são as camadas contêm ilhotas de alta pureza versus camadas com ilhotas de baixa pureza. </li><li> Recolher as tecido de alta pureza e baixa e piscina de cada conjunto. </li><li> Spin e lavar duas vezes. Depois da segunda lavagem, reduzir o volume de cada um para 250 ml com a mídia Wash Final. </li><li> Para avaliar a frações pooled começar por tomar duas amostras de 1 ml do alto das frações agrupadas e uma amostra de 1 ml da baixa. Transferência de cada amostra de 1 ml para um tubo cônico contendo 9 ml de solução de lavagem. </li><li> Em seguida, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a um prato de contagem. Examinar e contar as células ao microscópio. </li><li> Após a contagem das células calcular o número de frascos necessários à cultura das ilhotas usando a seguinte fórmula: (EIN total / pureza de ilhotas em decimal) / (30.000 EIN por frasco). Por exemplo, 100 mil ilhotas com pureza de 90% são cultivadas em 4 frascos. </li><li> Transferir os ilhéus para T175 frascos e cultura num 37 ˚ C e 5% CO 2 incubadora. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetol+Lat%22%5BJournal%5D)">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li>
</ol>

Apesar de avanços significativos nas técnicas de isolamento de ilhotas humanas, o rendimento de ilhotas permanecem altamente variável e imprevisível. Purificação do tecido pancreático digeriu é crucial para recuperar uma massa isle suficiente após digestão enzimática de sucesso para transplante. O método de purificação UIC é recomendado porque uma recuperação superior de alta pureza ilhotas humanas foi demonstrada usando este método. Além disso, até 50 ml de tecido digerido pode ser carregado em uma única Cobe correr pa...

<table><tbody><tr><td>Centrífuga</td><td>equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Processador Celular Cobe 2991</td><td>equipamento</td><td>Gambro. BCT</td><td>2556</td><td>purificação de ilhotas</td></tr><tr><td>Microscópio Invertido MZ6 TLBD4.1</td><td>equipamento</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultivo com Grade de 2 mm</td><td>equipamento descartável</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>contagem de ilhotas</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>equipamento</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa COBE</td><td>equipamento descartável</td><td>O.R. Solution</td><td>66707003</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura T175</td><td>equipamento descartável</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1812.500</td><td></td></tr><tr><td>Solução da Universidade de Wisconsin (UW)</td><td>reagente</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solução Tamponada de Sais de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 1.100</td><td>reagente</td><td>Bichrom AG</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Meio M199 (solução de lavagem)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Meio Final de Lavagem/Cultura</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-785-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ditizona</td><td>reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento islet humana pancreatic: parte ii: purificação e cultura de ilhotas humanos

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos<sup&gt; 1</sup&gt;, Sem o risco de graves episódios de hipoglicemia que estão associados com a terapia insulínica intensiva. Fornecimento de massa de ilhotas suficiente é importante para o transplante de ilhotas bem sucedido. No entanto, as características do doador, a colheita de órgãos e preservação afetar o resultado de isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Na University of Illinois at Chicago (UIC), desenvolvemos um protocolo de isolamento bem sucedido com um gradiente de purificação melhorou<sup&gt; 3</sup&gt;. O programa foi iniciado em Janeiro de 2004 e mais de 300 isolamentos foram realizados até novembro de 2008. O pancreata foram enviados em soluções frias de conservação (UW, University of Wisconsin ou HTK, histidina-triptofano Ketoglutarate)<sup&gt; 07/04</sup&gt; Para o Laboratório de Isolamento Celular na UIC para isolamento de ilhotas. Ilhotas pancreáticas foram isolados utilizando o método de UIC, que é uma versão modificada do método originalmente descrito por Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Conforme descrito na Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático, do pâncreas humano foi aparado, canulados, perfundidos, e digerido. Após a coleta e pelo menos 30 minutos de incubação em solução UW, o tecido foi colocado no separador de células (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) para a purificação<sup&gt; 3</sup&gt;. Purificação seguintes, o rendimento de ilhotas (expressos como equivalentes de ilhotas, IEQ), volume de tecido, e pureza foi determinada de acordo com métodos padronizados<sup&gt; 9</sup&gt;. Ilhotas isoladas foram cultivadas em CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), suplementado com 1,5% de albumina humana, 0,1% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1 ml de Ciprofloxacina, 5 ml de HEPES 1M, e 14,5 ml de 7,5% em Bicarbonato de Sódio T175 frascos a 37 ° C a cultura durante a noite antes ilhotas foram transplantados ou usado para a pesquisa.

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

O manejo do diabetes tipo 1 é oneroso, tanto para o indivíduo quanto para a sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de...

Neste vídeo, tecido pancreático que foi previamente isolado e digerido é submetido à purificação em gradiente de fial, o que resultará em uma fração purificada de ilhotas pancreáticas que, eventualmente, podem ser cultivadas em frascos de cultura de tecidos até o transplante. Olá, sou American Chief do Laboratório do Programa de Ilhotas Humanas do Departamento de Cirurgia da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, meu nome é Barbara Barbero e também faço parte do Programa de Ilhotas Humanas.Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas. Utilizamos este procedimento em nossa instalação para colher ilhotas humanas de alta qualidade para uso clínico. Vamos começar.Para iniciar o procedimento de purificação por eyelet, prenda todas as tubulações do saco COBE, exceto a verde, e ajuste a velocidade para 1500 e a saída centrífuga para zero na câmara de fluxo laminar. Monte a bomba e os béqueres do gradiente e conecte a tubulação de coleta ao tubo verde. Agora pode-se iniciar o carregamento do FI, acione girar.Em seguida, adicione 110 mililitros de FI. Ligue para o béquer da frente e inicie a bomba para carregar o saco COBE. À medida que o FI é carr

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

Este protocolo fornece um guia passo a passo para a aquisição de um pâncreas suíno para isolamento e purificação de ilhotas.

Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda a purificação e cultura de ilhotas pancreáticas humanas usando gradiente de Ficoll para transplante clínico. Este método automatizado garante alta qualidade e viabilidade das ilhotas isoladas.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Explorar mais vídeos