Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Neste vídeo, o tecido pancreático que foi isolado e digerido anteriormente é submetido à purificação do gradiente fial, que produzirá uma fração purificada de ilhós pancreáticos que podem ser cultivados em frascos de cultura de tecidos até o transplante. Olá, sou chefe americano do Programa do Laboratório de Ilhós Humanos do Departamento de Cirurgia da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, meu nome é Barbara Barbero e também sou do Programa de Ilhós Humanos.

Hoje mostraremos um procedimento para isolamento de ilhós pancreáticos humanos. Usamos este procedimento em nossas instalações para colher ilhós humanos de alta qualidade para uso clínico. Vamos começar.

Para iniciar o procedimento de purificação dos ilhós, carregue o saco COBE, prenda todos os tubos, exceto o verde, e defina a velocidade para 1500 e a saída super para zero no capô. Configure a bomba e os copos de gradiente e conecte o tubo de coleta ao tubo verde. Agora, o carregamento da chamada FI pode começar a girar por push.

Em seguida, adicione 110 mililitros de fi. Chame o béquer dianteiro e ligue a bomba para carregar o saco COBE. À medida que a chamada FI é carregada, pressione super out.

Pare a bomba, solte a cabeça da bomba e defina a velocidade de saída do super para 100. Quando a chamada FI atingir o béquer e todo o ar for expelido do grampo de gravação da tubulação no cabeçote da bomba, defina a velocidade de centrifugação para 3000 e a velocidade de super saída para zero. Agora prepare-se para carregar os gradientes despejando levemente o gradiente pesado no béquer frontal.

Solte o clamp entre os dois copos para remover qualquer ar. Em seguida, despeje o gradiente de luz no béquer traseiro. Ligue a agitação magnética.

Pressione girar na máquina COBE. Remova o clamp do tubo que conecta os dois béqueres e verifique se os gradientes pesados e leves estão se misturando. Assim que os gradientes começarem a se misturar, ligue a centrífuga.

Aguarde um minuto e ligue a bomba para carregar os gradientes de mistura para carregar o tecido. Deixe o gradiente ser baixo no béquer dianteiro, mas não o suficiente para permitir a entrada de ar no tubo de carregamento. Em seguida, amp o tubo que conecta os béqueres e carregue o tecido.

Continue adicionando o resto do tecido. Em seguida, lave o tubo que continha o tecido com 50 mililitros de solução de lavagem. E use-o para lavar o copo frontal quando o último lenço entrar no saco.

Pare simultaneamente a bomba UNC clamp na cabeça da bomba e clamp tubulação acima do saco. Continue a centrifugar por cinco minutos. Enquanto a centrifugação continua, leve os 12 tubos de coleta ao capô e solte suas tampas.

Conecte o tubo de coleta ao tubo amarelo e coloque a ponta de coleta estéril no tubo cônico número um. Em seguida, solte o tubo amarelo e prenda o tubo verde. Quando o giro terminar, aumente lentamente o super para 100.

Colete 150 mililitros no tubo um. Em seguida, colete 30 mililitros em tubos de dois a 12. Quando a coleta estiver concluída, pressione a parada no COBE.

Agora que a purificação terminou, os ilhós podem ser avaliados e cultivados. Após a recolha das fracções purificadas dos ilhós, retirar uma amostra de cada um dos 12 tubos de colheita e manar com diona. A coloração mostrará camadas de bruxo contendo ilhós de alta pureza versus camadas com baixa pureza.

Os ilhós coletam o tecido de alta e baixa pureza e agrupam cada um, giram e lavam duas vezes Após a segunda lavagem, aumente o volume de cada um para 250 mililitros com o tampão de lavagem final. Para avaliar as frações agrupadas, comece coletando duas amostras de um mililitro da alta das frações agrupadas e uma amostra de um mililitro da baixa transfira cada amostra de um mililitro para um tubo cônico contendo nove mililitros de solução de lavagem. Em seguida, transfira um mililitro de cada tubo de 15 mililitros para um prato de contagem.

Examine e conte as células ao microscópio. Após contagem das células, calcular o número de frascos necessários para a cultura dos ilhós utilizando a seguinte fórmula total, EIN dividido pela pureza dos ilhós na forma decimal dividido por 30 000 EIN por frasco. Por exemplo, 100.000 ilhós com 90% de pureza são cultivados em quatro frascos.

Transferir os ilhós para frascos T 1 75 e cultivar numa incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Depois de ficar com dione, os ilhós aparecem vermelhos. Isso permite avaliar a pureza dos ilhós.

Esses ilhós são recolhidos em frascos de cultura T 1 75 e colocados na incubadora. Acabamos de demonstrar um procedimento para isolar um grande número de ilhós pancreáticos humanos de qualidade, o que é importante para o sucesso do transplante de ilhós. Com base em nossa experiência, assim que 40 a 50% dos ilhós humanos estiverem livres do tecido interno circundante, precisamos interromper a digestão o mais rápido possível, diluindo e também resfriando a mistura digestiva.

Também é importante manusear o tecido com cuidado durante a coleta, lavagem e mistura. Recomendamos usar o método de purificação da Universidade de Illinois Chicago, que resulta em uma recuperação superior de ilhós humanos altamente puros. Este método também reduziu significativamente o tempo de isolamento, o que minimizará a lesão associada à isquemia no ilhó.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.