Preparação de Aplysia Sensório-motor Neuronal culturas de células

Culturas primárias de neurônios sensório-motores AIA fornecem uma preparação modelo para estudar a formação de sinapses e a plasticidade sináptica in vitro. Este vídeo demonstra a identificação e microdissecção de neurônios sensoriais e motores dos gânglios da OIA, bem como os métodos para estabelecer e manter neurônios sensórios motores em cultura. Olá, sou Aliza do Laboratório de Kelsey Martin no Departamento de Psiquiatria e no Departamento de Química Biológica da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

Olá, também sou Wan do laboratório de marketing. Hoje vou mostrar a vocês o procedimento de carting e neurônios motores sensoriais da Clac Apia Konica. Em nosso laboratório, usamos esse procedimento para estudar a célula e a biologia molecular da formação de sinaps e plasticidade sináptica.

Então vamos começar. Para começar a cultivar um neurônio pleio, primeiro prepare placas de cultura revestindo o poço de vidro de uma placa de cultura de fundo de vidro fosco com lisina poli L feita em furo de sódio. Adicione o suficiente para cobrir completamente o vidro e incubar em temperatura ambiente durante a noite.

Após a incubação, remova completamente a lisina poli L enxaguando em água do mar artificial quatro a cinco vezes. Após remover o último enxágue, adicione dois mililitros de uma solução contendo metade da solução L 15 com sais e L-glutamina e metade hemolinfa. Este meio de cultura deve ser adicionado ao prato pelo menos uma hora antes do plaqueamento das células para que a hemolinfa grude no prato.

Em seguida, limpe as ferramentas e pratos de charutos com etanol. Enxágue-os bem com água bidestilada e coloque-os por pelo menos uma hora sob luz ultravioleta na capela de cultura. Para preparar eletrodos afiados para microdissecção de neurônios, use um microeletrodo polar e capilares de vidro de 100 milímetros de comprimento com diâmetro externo de 1,5 milímetro e diâmetro interno de 0,86 a 1,12 milímetros.

Use parâmetros de tração que produzam um eletrodo com uma ponta fina longa e fina de resistência tão alta que não haja entrada capilar de fluido. Quando colocado em solução, um menisco fluido no eletrodo danificará o neurônio durante o isolamento. Em seguida, prepare o meio de cultura da solução anestésica e a solução de protease.

Quando estiver pronto, use ápia adulta de cerca de 80 a 100 gramas para isolamento de neurônios sensoriais e de neurônios motores LFS. Use ápia juvenil de um a quatro gramas para isolamento de L sete neurônios motores para tornar o meio de cultura uma alíquota fresca ou descongelada de hemolinfa OIA é necessária. A hemolinfa pode ser coletada em massa na primavera de cada ano para abastecer o laboratório ao longo do ano, selecione animais de grande porte que pesam entre 500 gramas e um quilo para extrair a hemolinfa.

Para começar, enrole o animal em uma almofada descartável para que apenas uma pequena parte do animal fique exposta. Limpe essa parte da pele com etanol e segure-a enquanto outra pessoa usa uma lâmina de barbear estéril para fazer uma incisão na área exposta. Aperte o animal para que a hemolinfa esguiche em um béquer limpo.

Certifique-se de que não entre em contato com a pele suja do animal. Repita este processo fazendo uma incisão em um local diferente no mesmo animal. Agrupe coleções de cada animal individualmente, mas não misture hemoclaudicações coletadas de animais diferentes.

Como isso pode introduzir contaminantes. Gire a hemolinfa a 2000 vezes G por 10 minutos para remover as células sanguíneas. Alíquota do sobrenadante em alíquotas de 10 mililitros e rotular as amostras por animal.

Essas alíquotas podem ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos, mas não a 20 graus Celsius negativos ou um precipitado começará a dissecar os gânglios anestesiando os animais. Para fazer isso, injete cloreto de magnésio 0,35 molar em adultos com apsia para adultos de 80 a 100 gramas, use uma seringa de 60 mililitros com uma agulha de calibre 18 de 1,5 polegada para juvenis de um a quatro gramas. Use uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 21.

Entre no animal em um ângulo de cerca de 35 graus. Certifique-se de não entrar muito profundamente para evitar penetrar nos órgãos internos. O animal deve ficar muito distendido e relaxado.

Em seguida, prenda o animal anestesiado em um prato de dissecação com um alfinete na cabeça e a cauda e o pé voltados para cima. Agulhas de calibre 18 funcionam bem para prender animais de 80 a 100 gramas e agulhas de calibre 21. Trabalhe bem em animais de um a quatro gramas.

Segure a pele do pescoço com uma pinça de dente e corte a pele no tecido conjuntivo subjacente ao longo de todo o comprimento do pé, da cabeça à cauda, com a tesoura cirúrgica. Prenda os dois lados para baixo e, em seguida, use uma pinça e uma tesoura. Corte o esôfago e puxe-o para o lado para expor os gânglios usando uma pinça fina e encontre uma tesoura, corte os gânglios.

Deixe uma boa quantidade de nervos, pois isso torna mais fácil fixar os gânglios. Após o tratamento com protease para digerir os gânglios, coloque-os em solução de protease. Em seguida, incube-os a 34 a 35 graus Celsius.

Animais de 80 a 100 gramas devem ser digeridos por 135 minutos e animais de um a quatro gramas por 105 minutos. Aumente o tempo de incubação para facilitar o desembainhamento. Diminua o tempo de incubação para evitar danos proteolíticos dos neurônios após a incubação.

Use a pinça de ponta fina para transferir e lavar os gânglios em água do mar artificial três vezes. Mantenha os gânglios em L 15 médios para revestir os gânglios. Transfira os gânglios digeridos pela protease para um prato revestido de charuto de 60 milímetros ou 35 milímetros contendo L 15.

Os gânglios estão agora prontos para serem dissecados sob um microscópio estéreo com halogênio externo. Remova os gânglios das pétalas dos gânglios pleurais. Agora prenda os gânglios pleurais na orientação correta usando alfinetes de insetos e uma pinça fina com a pinça fina e a tesoura cirúrgica Vana.

Levante cuidadosamente o tecido conjuntivo e corte-o para expor o aglomerado sensorial. Tenha cuidado para não danificar os corpos celulares neuronais. Em seguida, remova o excesso de tecido conjuntivo do prato e adicione mais meio.

Certificando-se de nunca expor o gânglio da bainha ao ar. Agora prossiga com a remoção dos neurônios de interesse para a cultura. O cluster sensorial consiste em aproximadamente 200 neurônios agrupados de 40 a 50 mícrons de diâmetro.

Coloque um pino para fazer um poste a uma curta distância do gânglio. Em seguida, isole os neurônios usando um eletrodo longo e afiado. Retire os neurônios identificados, um por um, tocando o corpo celular fora do centro.

Certifique-se de não empalar o neurônio. Em seguida, lenta e firmemente, puxe o soma celular junto com o axônio para longe do gânglio. Bata suavemente o eletrodo contra o pino para desalojar os neurônios do eletrodo.

Em seguida, use uma ponta de pipeta descartável para transferir neurônios individuais da placa de sigar para uma placa de cultura para evitar que os neurônios grudem na ponta da pipeta de plástico. Aspire o meio de cultura através da ponta antes de ser usado para transferir neurônios. Tome muito cuidado para evitar expor os neurônios a bolhas de ar ou a forças extremas.

Distribua os neurônios uniformemente por todo o prato. Em seguida, use um eletrodo afiado para endireitar suavemente os processos dos neurônios e bata-os no fundo do prato. Em seguida, deixe o prato no microscópio para incubar em temperatura ambiente por pelo menos três horas. Durante a noite.

A incubação é rotineira. Cubra o palco com papel alumínio para protegê-lo da luz. Certifique-se de que a platina do microscópio não seja perturbada durante este período.

Após a incubação em temperatura ambiente, transfira suavemente o prato para uma incubadora de 18 graus Celsius para crescimento contínuo. Após três horas a 18 graus Celsius, a cultura deve aderir ao prato e após seis a 12 horas, o crescimento de novos neuritos deve ser visível. Comece isolando os neurônios motores do LFS.

Prenda o gânglio de forma que a superfície ventral fique voltada para cima. Usando uma pinça, puxe a bainha do tecido conjuntivo para trás para expor toda a metade do gânglio que contém os neurônios motores do LFS e retire as partes restantes do gânglio. Remova qualquer tecido conjuntivo do prato e adicione mais L 15.

Em seguida, remova os neurônios motores LFS. Ajuda notar que os neurônios LFS são diferenciados dos neurônios L EENs vizinhos com base em uma pequena mancha de pigmento escuro em seu sam. Para isolar o neurônio motor L sete ou L 11, fixe o gânglio de forma que a superfície dorsal fique voltada para cima.

Usando uma pinça, puxe a bainha do tecido conjuntivo para trás para expor a metade do gânglio contendo L sete e L 11. Tenha cuidado para nunca tocar ou danificar o neuronal. Portanto, coloque um alfinete para fazer um poste a uma curta distância do gânglio.

O neurônio L sete pode ser diferenciado do neurônio L 11 por três critérios. Primeiro, o L 11 é cod para L sete. Em segundo lugar, o corpo celular L 11 é mais oblongo.

E terceiro, o axônio L 11 tende a se ramificar perto dos neurônios isolados do corpo celular, removendo neurônios com um eletrodo afiado, conforme descrito para os neurônios sensoriais. Agora isole, transfira e espalhe os neurônios na placa de cultura, conforme descrito anteriormente. Para preparar a co-cultura sensório-motora, use o eletrodo de vidro para persuadir o axônio sensorial a entrar em contato com o neurônio motor.

Faça isso com muito cuidado usando o lado do eletrodo cônico para finalmente fazer com que o axônio sensorial entre em contato fisicamente com o axônio do neurônio motor. Não levante a placa de cultura, mas deslize suavemente a placa ao longo da platina do microscópio. Siga o procedimento de incubação descrito anteriormente com a mesma taxa de crescimento prevista. Oito.

Vamos apenas mostrar-lhe como fazer um aplicativo protetor solar neurônio motor. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de deixar as culturas no estágio do microscópio sem serem perturbadas durante a noite antes de movê-las para a incubadora. É isso.

Obrigado por assistir e boa sorte por seus experimentos.