Geração de humanos CD40-activated células B

Olá, meu nome é Alexander Shiku Van Hagen. Sou membro do Laboratório de Imunologia e Imunologia do Transplante no Hospital Universitário de Colônia. Neste vídeo, vamos mostrar como podemos gerar células B humanas ativadas por CD40 a partir de células mononucleares do sangue periférico.

Um dos principais interesses do nosso laboratório é o estudo das funções independentes de anticorpos das células BB. Além de seu papel como produtoras de anticorpos, as células B desempenham um papel importante como células apresentadoras de antígenos tanto em condições fisiológicas quanto em doenças autoimunes. Após a ativação, as células B podem adquirir fortes capacidades apresentadoras de antígenos e imunoestimuladoras, especialmente quando ativadas por meio de CD40.

CD40. As células B ativadas apresentam diversas vantagens em comparação com as células dendríticas. Elas podem ser facilmente expandidas a um custo relativamente baixo a partir de pequenas quantidades de sangue periférico, mesmo de pacientes com câncer.

Agora nossa estudante de doutorado, Tanya Leic, e nossa técnica LER, vão lhe apresentar uma introdução passo a passo sobre como gerar células B humanas ativadas por CD40 a partir de sangue periférico. Olá, meu nome é Tanya Livi. Sou estudante de doutorado e quero demonstrar a vocês como gerar células B humanas ativadas por CD40.

Este procedimento foi otimizado em nosso laboratório. Os principais passos são, primeiramente, o preparo das células alimentadoras. Para isso, utilizamos células N IH 33 transfectadas com ligante humano de CD 40, que são irradiadas com 78 gray e semeadas em placas de seis poços.

Em segundo lugar, iniciamos o cultivo de células B ativadas por CD40 humanas a partir de PBMC purificados, que são tratados com interleucina humana quatro e ciclosporina A; essas células são então semeadas sobre células fetais em placas de seis poços. Esse procedimento é repetido no sétimo dia e, em seguida, a cada três a quatro dias até o 14º dia de cultivo celular. Para obter células B ativadas por CD40 humanas altamente puras, iniciamos a geração dessas células com PBMC humanos recém-purificados ou adequadamente conservados.

Primeiro, lavamos os PBMCs duas vezes, ressuspendendo as células em 50 mililitros de PBS. Centrifugue os PBMCs por sete minutos a 1300 RPM, correspondendo a 260 5G. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células novamente em 50 mililitros de PBS, centrifugando novamente por sete minutos a 1100 RPM, correspondendo a 190 G. Após isso, descarte o sobrenadante novamente para a determinação da contagem celular reus.

Suspenda os PBMCs em 20 mililitros de PBS e misture bem as células por vortexamento, determinando então a contagem celular. Centrifugue a quantidade necessária de PBMCs para o cultivo de B CD40 por cinco minutos a 1200 RPM, correspondente a 220,5 × g. Utilizando uma placa de seis poços, você precisará de quatro vezes 10 à sexta potência de células por poço, mais 24 vezes 10 à sexta potência de células por placa.

Em seguida, ressuspenda os PBMCs a uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio de cultura CD40B. Suplemente a suspensão celular com IL-4 humana fresca numa concentração de 50 unidades por mililitro para estimulação e ciclosporina A numa concentração de 0,63 micrograma por mililitro para inibir o crescimento de células T. Agora, a suspensão de PBMCs está pronta para estimulação com ligante CD40.

Até onde sabemos, atualmente não há disponível ligante SOMAL CD40 em grau funcional GMP. Portanto, utilizamos células NIH 3T3 transfectadas com ligante CD40 humano para estimular a sobrevivência, diferenciação e proliferação celulares, já que a linhagem celular NIH 3T3 pode sobreviver em cultura por vários meses. A perda da expressão do ligante CD40 deve ser excluída regularmente por meio de análises.

CD40 ligante transfectado, NIH 3T3 é uma linhagem celular aderente cultivada a 37 graus com 5% de CO₂ em meio seletivo, suplementado com G418 numa concentração de 0,7 miligrama por mililitro. Esta linhagem de fibroblastos aderentes nunca deve ficar completamente confluente e deve ser repicada duas vezes por semana. Para repicar as células aderentes, aspire o meio, lave uma vez com 10 mililitros de PBS, agitando suavemente. Aspire novamente o meio e adicione 4 mililitros de tripsina-EDTA em um frasco de 75 centímetros quadrados.

Incube o frasco por cinco a 10 minutos a 37 graus na estufa. Retire o frasco novamente. Utilize batidas suaves para destacar as células do plástico.

Em seguida, adicione 10 mililitros do meio selvagem, movimente suavemente e transfira as células para um tubo de 50 mililitros. Centrifugue as células NA83T3 por cinco minutos a 1200 RPM, correspondente a 125 ×g. Suspender cuidadosamente as células em pellet no meio selvagem de 10 milimolar.

Determine a contagem celular para o subcultivo N IH três três e re-suspenda 1,5 vezes 10 à sexta potência de células alimentadoras em 10 mililitros de meio selvagem. Transfira-as para um frasco de 75 centímetros quadrados e adicione G 4 1 8 numa concentração de 0,7 miligrama por mililitro para selecionar as células transfectadas que portam resistência à neomicina. Por fim, incube as células alimentadoras a 37 graus em 5% de CO2 para estimulação de B CD 40.

Retire o restante das células NI 8 3 3 e irradie-as letalmente com 78 Gy para interromper sua proliferação. Dilua as células alimentadoras irradiadas em meio do tipo wire, com uma densidade celular de 0,1 × 10⁶ células por mililitro, adicionando dois mililitros por poço em uma placa de seis poços. Deixe as células nas placas de seis poços aderirem novamente antes de utilizá-las como células alimentadoras, incubando-as por 24 horas a 37 °C e 5% CO₂ para estimulação de linfócitos B com ligante CD40.

Verifique ao microscópio se as células alimentadoras semeadas um dia antes estão aderidas. Se as células alimentadoras estiverem aderidas, remova o SUP natin de cada poço e lave-as rapidamente duas vezes. Primeiro, lave cada poço com dois mililitros de PBS e depois com dois mililitros.

Meio de lavagem CD40 B para estimulação na suspensão de PBMC. Preparar pouco antes com uma densidade celular de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro para as células alimentadoras. Para isso, transferir suavemente quatro mililitros da suspensão celular para cada uma.

Incube bem a placa a 37 graus em 5% de CO₂ no sétimo dia. As células B CD40 podem ser subcultivadas para a primeira subcultura de CD40. Células B ativadas no sétimo dia e subculturas subsequentes a cada três a quatro dias.

Colete suavemente as células agrupadas das seis placas de 12 poços por ressuspensão, suspendendo-as com uma pipeta de 10 mililitros. Transfira os linfócitos B CD40 para um tubo de 50 mililitros. Centrifugue os linfócitos B CD40 por sete minutos a 1200 RPM, correspondendo a 220,5 ×g, completamente.

Troque o meio pelo meio de lavagem CD40B e determine a contagem celular das células B ativadas CD40. Re-suspenda as células B CD40 a uma concentração de um vezes 10 elevado a seis células por mililitro no meio de cultura CD40B.

Em seguida, suplemente a suspensão celular com IL humana quatro fresca numa concentração de 50 unidades por mililitro e ciclosporina A numa concentração de 0,63 micrograma por mililitro para estimulação. Uc, células alimentadoras irradiadas preparadas um dia antes. É claro que as células alimentadoras irradiadas devem novamente ser verificadas quanto à aderência ao microscópio imediatamente antes do uso.

Se aderentes, lave as células de suporte rapidamente duas vezes: uma vez com PBS e outra vez com meio de lavagem CD40B, depois adicione cuidadosamente quatro mililitros da suspensão de CD40B ajustada a uma concentração de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro em cada poço de uma placa de seis poços. O subcultivo é repetido de forma idêntica após três a quatro dias, duas vezes por semana, até se obterem aglomerados celulares de linfócitos B humanos altamente puros ativados por CD40 no dia 14 do cultivo.

Neste momento, as células B ativadas por CD40 expressam moléculas coestimuladoras como CD80, CD86, CD83, moléculas de MHC e a chamada tríade de homing para linfonodos composta pelo ligante de CD62, CCR7 e LFA-1, que pode ser verificada por Fox durante a geração, para fins de solução de problemas. Consulte a versão textual deste protocolo. Esperamos que, no futuro, as células B ativadas por CD40 possam servir como uma ferramenta importante para a imunoterapia do câncer.

Boa sorte com seus experimentos.