Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

Olá, sou Chris Paglia, diretor do Laboratório de Processamento de Informação Visual no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Boston. Oi, sou Jacque Liu, aluna de doutorado no laboratório do Dr. Paglia. Os esforços de pesquisa do nosso laboratório são direcionados à compreensão dos cálculos neurais que permitem aos animais enxergar.

Para esta pesquisa, utilizamos uma das criaturas mais antigas da Terra, o caranguejo-ferradura americano. Agora, esses animais podem ser fósseis vivos. Eles continuam desempenhando um papel indispensável na pesquisa biomédica.

Não apenas seu sangue contém células especiais que os cientistas utilizam para detectar toxinas bacterianas em nossos medicamentos, mas seus olhos também possuem uma rede neural que forneceu grande compreensão sobre o funcionamento do nosso sistema visual. A base celular de processos como adaptação à luz e inibição lateral foi revelada pela primeira vez em estudos dos olhos compostos laterais do animal, e por esse trabalho pioneiro, o Dr. Keffer Hartline recebeu o Prêmio Nobel em 1967. O caranguejo-ferradura permanece um modelo atrativo para pesquisas sobre visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, e seus neurônios retinianos são grandes e facilmente acessíveis.

Seu sistema visual é compacto e amplamente estudado, e seu comportamento visual é bem definido. Além disso, a estrutura e a função dos olhos são moduladas diariamente por um relógio circadiano no cérebro do animal. Em resumo, o sistema visual dos caranguejos-ferradura é simples o suficiente para ser compreendido, mas complexo o suficiente para ser interessante.

Neste vídeo, ilustraremos três paradigmas experimentais para investigar a base neural da visão que podem ser realizados in vivo com este modelo animal clássico. Para pesquisas sobre visão, eles são: gravação eletroretinográfica, gravação do nervo óptico e gravação intrarretiniana. Os caranguejos-ferradura são mantidos em um tanque de água salgada arejada, em uma sala exposta a um ciclo luz-escuridão regulado.

Antes de iniciar qualquer uma dessas técnicas de gravação, os animais são resfriados em um balde de gelo por cerca de 10 minutos e, em seguida, fixados em uma plataforma de madeira colocando dois parafusos de aço inoxidável no prosoma e dois no soma dos EPIs. A plataforma é ponderada na parte inferior com granito para que afunde na água. O eletroretinograma ou ERG é utilizado para monitorar a sensibilidade ocular ao longo do tempo.

Mede a resposta elétrica bruta de todas as células do olho. Para o flash de luz, as ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, solução de Ringer com vaselina, uma pipeta, um LED, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável e um cotonete. Utilizamos uma câmara de gravação feita em laboratório para medir o ERG.

O corpo é projetado para conter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para acoplar a solução condutiva a um amplificador e um pequeno orifício dimensionado para acomodar um LED antes da fixação. A parte inferior da câmara é revestida com vaselina.

As câmaras são então fixadas sobre o olho do caranguejo-ferradura com dois parafusos preenchidos com solução salina e tampados. O animal é colocado em uma gaiola hermética à luz, dentro de um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. O cabo do LED é inserido na tampa da câmara.

O eletrodo de sinal é conectado ao fio da câmara e o eletrodo de referência a um dos parafusos implantados, e ambos os eletrodos são ligados ao estágio inicial de um amplificador diferencial de alta impedância para amplificação do sinal e filtragem de ruído. Em seguida, a caixa é fechada para impedir que a luz ambiente alcance o animal. O estágio ad é conectado ao amplificador, e os filtros do amplificador são ajustados para permitir a passagem de frequências abaixo de aproximadamente 10 hertz.

A partir daí, o sinal sobe para o osciloscópio, para visualização, e para uma placa de aquisição de dados, para análise e armazenamento no computador; utilizamos um programa personalizado escrito em LabVIEW para fornecer estímulos luminosos a partir do LED e para registrar o sinal de ERG. O LED é acionado com um pulso de 100 milissegundos de cinco volts a cada 10 minutos. À esquerda, é exibida a forma de onda do ERG correspondente a cada flash luminoso, e à direita é traçada a amplitude de pico a pico das formas de onda sucessivas dos flashes para acompanhar as alterações na sensibilidade ocular ao longo do tempo.

Com gravações de ERG, pode-se estudar os efeitos da adaptação à luz e da modulação neural circadiana. O olho transmite mensagens visuais ao cérebro e as respostas de potenciais de ação das fibras de seu nervo óptico. As mensagens codificadas podem ser estudadas por meio de gravações extracelulares de fibras nervosas individuais.

Mensagens do relógio circadiano retroalimentadas para o olho também podem ser estudadas por este método. As ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, solução de Ringer, eletrodos, tesoura, câmara de registro, pinça curva, sonda de agulha fina, bisturi rombo, tesoura cirúrgica e eletrodo seccional. As câmaras de registro projetadas com uma saliência para acomodar o nervo permitem que 20 mililitros de sangue sejam drenados do cavalo ou caranguejo mediante a inserção de uma agulha de calibre 16 entre os músculos da articulação e até o coração.

A exsanguinação não é necessária, mas facilita a dissecação do nervo óptico com o animal fixado na plataforma. A localização do nervo óptico é estimada traçando-se uma linha levemente curva no carpo entre os olhos lateral e mediano. Em seguida, faz-se um orifício circular no carpo com um refin.

O orifício tem o mesmo diâmetro da base da câmara. O centro do orifício está localizado cerca de dois centímetros à frente do olho lateral e ligeiramente dorsal à linha, de modo que o nervo percorra a porção ventral da câmara. O tecido conjuntivo sobrejacente é removido até que um segmento completo do nervo fique visível, e o nervo exposto é separado do tecido circundante e subjacente. Um filamento é passado ao redor do nervo e puxado para dentro da câmara através da abertura semicircular na base.

Através dessa mesma abertura, o nervo é suavemente guiado para dentro da câmara puxando-se o fio. À medida que o nervo entra na câmara, a base é empurrada para dentro do orifício para minimizar o estiramento do nervo. A câmara é então fixada com dois parafusos e preenchida com solução de Ringer.

Após a fixação da câmara, o animal é colocado em uma gaiola de maré clara em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. O interior da câmara é visualizado sob um estereoscópio e algodão é colocado ao redor da abertura da parte inferior para evitar vazamento de sangue para dentro e de solução de Ringer para fora da câmara. A câmara é reabastecida com solução de Ringer fresca.

O tecido residual é removido com tesoura fina e pinça. Um pequeno corte é feito na bainha que encapsula o nervo e o nervo é separado da bainha com uma sonda de agulha fina. A bainha é gradualmente desenrolada e removida mediante cortes ao longo do comprimento do nervo.

Um pequeno feixe de fibras é então separado do nervo usando a sonda e cortado na extremidade mais distante do olho para gravação de fibras aferentes e na extremidade mais próxima do olho para gravação de fibras eferentes. Utilizamos um eletrodo de sucção do sistema AM preenchido com solução de Springer para gravação, que é conectado por tubulação a uma seringa de Gilson para sucção. A ponta do eletrodo é fabricada por polimento a chama da extremidade de uma capilar de vidro borossilicatado com diâmetro de um milímetro. Uma conexão A e C fornece o cabo do sinal, e o cabo de referência é um fio de cloreto de prata enrolado ao redor do eletrodo para reduzir o ruído.

A ponta do eletrodo é posicionada na câmara de gravação e a extremidade cortada do feixe nervoso é aspirada para dentro da ponta de vidro por sucção. Os cabos do sinal e de referência são conectados ao estágio inicial de um amplificador diferencial para amplificação do sinal e filtragem de ruídos. A saída do amplificador é enviada a um osciloscópio para visualização e a uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento em computador.

Utilizamos um programa personalizado escrito em LabVIEW para controlar estímulos luminosos e um discriminador digital de potenciais de ação para registrar trenos de disparos. Um guia de luz de fibra óptica é empregado para iluminação de célula única, enquanto um display de vídeo controlado por computador é usado para estimulação por padrões com gravações do nervo óptico, permitindo estudar a transmissão de sinais entre os olhos e o cérebro na retina. O registro envolve a inserção de um microeletrodo diretamente nas células do olho e a gravação das flutuações de voltagem intracelular induzidas pela luz.

As ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma plataforma lúcido em forma de L. Os furos roscados acomodam um microeletrodo sobre o eletrodo de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino. Após a captura do caranguejo, uma árvore segura, uma plataforma de madeira, uma placa lúcido com furos roscados pré-definidos é fixada ao carpo com dois parafusos laterais e um parafuso superior.

O animal é colocado em uma gaiola hermética à luz, dentro de um tanque preenchido com água do mar sobre as brânquias. Um posicionador micro motorizado é fixado firmemente à lâmina com parafusos e o braço do posicionador é alinhado sobre o olho. Um lote de micropipetas de vidro é puxado a partir de vidro de silicato com um milímetro de diâmetro externo, e as pontas são preenchidas por trás por ação capilar.

Colocando as pipetas em um frasco com solução de cloreto de potássio 3 molar por alguns minutos, o restante da pipeta é preenchido manualmente com a solução salina e inserido em um suporte para microeletrodo previamente preenchido com solução, a fim de evitar a formação de bolhas. O suporte para eletrodo é então inserido no estágio principal de um amplificador intracelular fixado ao microposicionador. Uma seção da retina é exposta cortando cuidadosamente uma pequena área quadrada da córnea dorsal.

Com o bisturi, uma gota de Solução de Ringer é colocada sobre o tecido exposto para evitar secagem, e a micropipeta é avançada em direção à retina. Quando a ponta da pipeta toca a solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular é ativado e a impedância do eletrodo é medida; micropipetas com impedâncias fora da faixa de 20 a 70 megaohms são descartadas. Aquelas dentro dessa faixa são avançadas em passos microscópicos para dentro da retina e introduzidas nas células mediante vibração eletrônica da ponta; estímulos luminosos são aplicados para penetrar células por meio de um cabo de fibra óptica ou exibição em vídeo.

Três tipos de células podem ser encontrados no olho do caranguejo-ferradura: células ular, células excêntricas e células de pigmento. As células ular apresentam uma grande resposta de despolarização à luz, as células excêntricas exibem uma sequência de potenciais de ação sobreposta a uma resposta de despolarização, e as células de pigmento não apresentam qualquer resposta à luz. A resposta é observada em um osciloscópio e registrada em um computador por meio de gravações intrarretinianas. Pode-se estudar a base celular da visão.

Para concluir, demonstramos como realizar gravações de eletroretinograma, gravações do nervo óptico e gravações intrarretinianas em caranguejos-ferradura in vivo. Esses métodos são amplamente utilizados e fornecem insights únicos sobre os mecanismos neurais do processamento de informações visuais em caranguejos-ferradura. Eles não são apenas simples de aplicar em um laboratório de pesquisa, mas também podem ser facilmente incorporados a um laboratório didático de neurofisiologia visual.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.