Name: Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Aprenda técnicas eletrofisiológicas para pesquisa da visão usando Limulus Polyphemus. Este método demonstra registros de eletroretinograma, nervo óptico e intrarretinianos in vivo.

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Os autores gostariam de agradecer o Dr. Werner Birgit por sua ajuda com a produção deste artigo vídeo. Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de CARREIRA NSF.

Parte 1: Preparação Experimental Procedimentos experimentais realizados em caranguejos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Boston. Os animais são comprados dos laboratórios de Biologia Marinha (Woods Hole, MA) ou outro fornecedor e alojados em um aquário de água salgada aerada em uma sala exposta a um ciclo claro-escuro regulamentado. O esquema de iluminação é importante para entraining relógio circadiano do caranguejo e andar de bicicleta o olho diariamente entre seus estados diurnos e noturnos. Imediatamente antes de iniciar qualquer procedimento invasivo, o animal é resfriado em um balde de gelo por 10-15 minutos, até que seu movimento é lento e, em seguida, preso a uma plataforma de madeira com dois parafusos de aço inoxidável inserida no prosoma e dois na opisthosoma. A plataforma é ponderada por baixo com granito de modo a afundar na água. Após experimentos terminal o animal é sacrificado por imersão em pasta de gelo novamente e mielotomia o cérebro, que fica acima da boca, com um bisturi. Parte 2: Soluções Solução Limulus Ringer é composta de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 ìm TES, HEPES 50 ìm e 10ml / L Pen-Strep mix (penicilina-estreptomicina, 10.000 unidades / ml) . Parte 3: Gravação Eletrorretinograma Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, vaselina, solução de Ringer, uma pipeta, um LED verde, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável, e um cotonete. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar o ERG (Figura 1A). O corpo da câmara é projetado para manter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para o acoplamento da solução condutora a um amplificador e um furo de pequeno porte para acomodar um LED. Um ultrabright LED com emissão de pico por volta de 520nm funciona melhor. </li><li> Para começar, a parte inferior da câmara é revestida com vaselina e garantiu sobre o olho com dois parafusos. </li><li> A câmara é então preenchido com solução salina e tampado com a tampa. </li><li> Depois de penhora câmara o caranguejo é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O cabo de LED é inserida na tampa de câmara. </li><li> A liderança do sinal é cortada ao fio, cloreto e o eletrodo referência é cortada para um dos parafusos implantados. </li><li> Ambos os terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial de alta impedância (X células 3x4, FHC Inc) para amplificação de sinal e amplificador de o filtro está definido para passar freqüências abaixo de 10Hz. </li><li> A saída do amplificador é alimentado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Após a instalação a porta da gaiola está fechada para bloquear a luz da sala de atingir o animal. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa pisca o LED, registra o evocado ERG sinal, e mede a amplitude da resposta pico a pico. A escolha do paradigma de flash depende do objetivo experimental. Por exemplo, uma breve (100ms) pulso de 5V aplicada a cada 10 minutos para o LED evita efeitos de adaptação luz quando o monitoramento de mudanças circadiano na sensibilidade dos olhos. </li></ol> Parte 4: gravação do nervo óptico Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, fio, um trépano, solução de Ringer, fórceps, tesouras Vannas, uma câmara de gravação, uma pinça curva, sondas agulha fina, um maçante bisturi, tesouras cirúrgicas, e um eletrodo de sucção. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar as respostas do nervo óptico (Figura 1B). O interior da câmara é dois centímetros de diâmetro, bem aberto que tem uma abertura semicircular fina fenda na parede inferior para acomodar o nervo e isolá-lo do tecido circundante. </li><li> Antes de penhora câmara de uma agulha de calibre 16 é inserido entre os músculos da dobradiça para o coração e ~ 20cc de sangue é drenado do animal. Exsanguination não é necessária, mas torna a dissecção do nervo óptico mais fácil. </li><li> A localização do nervo óptico é estimado pelo desenho na carapaça de uma linha ligeiramente curva entre os olhos laterais e mediana. </li><li> Um buraco circular é então cortada na carapaça com uma trefina. O buraco é o mesmo diâmetro que a câmara também. O centro do buraco está localizado 2-3 cm anterior ao olho lateral e ligeiramente dorsal à linha para que o nervo percorre a porção ventral do poço. </li><li> Tecido conjuntivo é liberado até que o nervo é totalmente visível e livre de torno e subjacentes do tecido. </li><li> Um fio de linha é enrolada ao redor do nervo e puxou para dentro da câmara através da ranhura na parte inferior. Através desta mesma abertura do nervo é suavemente guiado para a câmara, puxando a corda. Ao mesmo tempo, a câmara também é inserido no furo. A câmara é então aposta a carapaçacom parafusos eo poço é preenchido com solução de Ringer. </li><li> Depois de penhora câmara o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O bem é visualizado sob um estereoscópio (SMZ-168, Jed Pella Inc) e algodão é preenchido em torno da abertura no fundo para evitar fugas de sangue e soro fisiológico para fora da câmara. </li><li> Tecido conjuntivo residual ao redor do nervo é removida com tesoura fina e pinça, ea câmara é abastecido com solução de Ringer fresco é. </li><li> Um nick é feita no vaso sanguíneo que encapsula o nervo e, através desta abertura que o nervo é cuidadosamente desheathed longo de seu comprimento com uma tesoura fina, pinças, sondas e agulhas. </li><li> Um feixe de fibras minúsculas é separado do nervo utilizando a sonda e corte no final mais afastada do olho para a gravação de fibras aferentes e no final mais próximo ao olho para a gravação de fibras eferentes. No vídeo o fim das gravações de fibra aferente é cortado. </li><li> Um eletrodo microsuction (AM Systems Inc) preenchidas com solução de Ringer é usado para a gravação do nervo óptico. A ponta do eletrodo é montado no feixe de nervos pelo fogo polimento final de um vidro de borosilicato 1 milímetro de diâmetro capilar. </li><li> A ponta do eletrodo é rebaixada para a câmara de bem com um manipulador manual (WPI Inc), eo feixe de fibras cortadas é sugado para a ponta. Sucção é fornecido por uma seringa Gilmont conectados ao eletrodo por meio de tubulação. </li><li> Uma conexão BNC fornece a liderança de sinal e um fio de cloreto de prata enrolada em torno do eletrodo para reduzir o ruído fornece a liderança de referência. Os dois terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial para a amplificação do sinal e filtragem de ruído (X células 3x4, FHC Inc). A saída do amplificador é enviado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) e interfaces digitais com um pico discriminador (APM, FHC Inc) que os registros de trens de pico. A luz pode ser entregue a uma única célula no olho através de um tubo de luz de fibra óptica ou para todo o olho através de um display de vídeo controlado por computador. </li></ol> Parte 5: gravação intra Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma em forma de L plataforma de acrílico com furos roscados, um suporte de microeletrodos com uma pipeta de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino. <ol><li> Uma placa de acrílico artesanais com furos pré-é usado para gravar as respostas intracelulares. Os furos são espaçados para a montagem de um micromanipulador motorizado (PPM5000, WPI Inc). A placa é anexado ao animal com dois parafusos na lateral e um na parte superior. </li><li> Após fixação da placa o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O microposicionador é parafusada na placa, com o seu braço móvel alinhado sobre o olho. </li><li> Um lote de micropipetas de vidro são puxados a partir de 1 mm OD vidro borossilicato e as pontas são backfilled via ação capilar, colocando o micropipetas em um pequeno frasco de solução de KCl 3M. </li><li> O resto das pipetas são preenchidos manualmente com a solução de sal e inserido em um suporte do eletrodo. </li><li> O suporte do eletrodo é conectado ao palco a cabeça de um amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) aposta no braço microposicionador. </li><li> Uma seção pequena da retina (~ 1mm2) é exposto pelo corte de distância da interface córnea com uma lâmina de barbear. </li><li> Uma gota de solução de Ringer é colocado na retina exposta para evitar a secagem ea ponta micropipeta é avançada através da abertura no tecido da retina. </li><li> Quando a ponta entra na solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular está envolvido e impedância de eletrodo é medido. Micropipetas com impedância fora do intervalo de 20-70 MW são descartados. Aqueles nesta faixa são avançados em passos micron e empalado em células vibrando a ponta da pipeta eletronicamente ou mecanicamente. </li><li> Três tipos de células podem ser encontradas no olho. Retinular células apresentam apenas uma resposta despolarizante à luz, as células excêntrico mostram um trem de potenciais de ação montado em uma resposta despolarizante, e as células de pigmento não mostram nenhuma resposta clara a todos. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em Labview. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Sistemas de Cambridge Research). Os estímulos são entregues às células empalado com um tubo de fibra óptica ou exibição de vídeo. Respostas de tensão são observados no osciloscópio e digitalizados pelo programa para computador. </li></ol> Parte 6: Resultados Representante A ERG representativa é mostrado na Figura 2A. A forma de onda representa a elétrica resumiuresposta à luz dos principalmente a células fotorreceptoras retinular, uma vez que em muito ultrapassam as células excêntrico e são eletricamente acoplados a eles. Não há forma de onda componentes múltiplos de diferentes tipos de células da retina como com o ERG de mamíferos. Retorno de um relógio circadiano no cérebro Limulus modula as propriedades fisiológicas das células da retina em uma base diária, fazendo com que o curso amplitude e tempo do ERG para variar ao longo do tempo (1). Conforme mostrado na Figura 2B, ERG amplitude é maior durante a noite subjetiva do animal menor e durante o dia subjetiva. Um traço de representante de uma resposta de fibra do nervo óptico único para a luz é mostrado na Figura 3. Células excêntricas todos se comportam da mesma ordem, mostrando um aumento transitório na taxa de descarga pico seguido de uma decadência a um nível sustentado. A decadência taxa reflete a ação combinada de adaptação luz e aumento dependente da auto-inibição em células excêntricas (2). Outros padrões espiga, como a luz-dependente diminui na taxa, são vistos no cérebro Limulus, mas não o olho (3). Traços representativos da resposta de tensão de uma célula de células de pigmento, células retinular, e excêntrico à luz são mostrados na Figura 4. Apenas os dois últimos tipos de células da retina são visuais. O curso de amplitude e tempo de sua resposta depende da qualidade da gravação e da localização do eletrodo no interior da célula. Geralmente, o eletrodo penetra nas células de pigmento ou células retinular por causa de seu grande tamanho e número. Neste último caso, uma despolarização transitória que decai a um nível sustentado é gravado. A decadência é devido à adaptação de luz por células retinular (2). Se o eletrodo entra em uma célula excêntrico, grandes potenciais de ação são registrados no axônio (40-70mV) e potenciais de ação pequeno montado em uma forma de onda despolarizante (&lt;25mV) perto da soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Diagramas esquemático das câmaras utilizadas para a gravação eletrorretinograma (A) e gravação de nervo óptico (B). Bar é igual a 7mm de A e 5mm de B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Traço Exemplo de um ERG Limulus evocado por um pulso de 100ms LED 5V no escuro (A) ea flutuação pico-a-pico em ERG amplitude ao longo do tempo na escuridão constante (B). Escuridão foi iniciado no momento indicado pelo triângulo branco. O crescimento da amplitude do ERG durante o tempo indicado pelo triângulo preto é devido à adaptação de luz, que aumenta a sensibilidade do olho no escuro. A variação cíclica na amplitude do ERG depois disso é devido ao relógio interno do animal circadiano. Pontos no tempo B são cada 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Traço Exemplo de uma resposta do nervo óptico de fibra à luz brilhou em um único receptor ommatidial. Forma de onda acima do rastreamento mostra momento estímulo. Células excêntricas, cujos axônios dão origem a fibras nervosas, todas apresentam um padrão semelhante de disparar como este nas condições de iluminação do experimento (5 segundos o flash no escuro total). Codificação da retina com picos é um Limulus propriedade tem em comum com mamíferos, ao contrário de outros invertebrados. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4 traços Exemplo da resposta de tensão à luz dos três tipos de células presentes no olho Limulus lateral:. Células de pigmento (A), célula retinular (B), e célula excêntrico (C). A primeira célula é não-visual. Os dois últimos despolarizar em cima de um flash de luz. A despolarização é maior para as células retinular porque transdução da luz e enviar o sinal através de junções para a célula excêntrico, com alguma perda ao longo do caminho. Na célula excêntrico, potenciais de ação disparados pelo axônio são vistos andando sobre a despolarização devido à backpropagation pico na soma. A amplitude dos potenciais de ação tem sido atenuada na figura para melhor visualização do potencial despolarizante. O potencial de repouso das células é-50mV.

<ol><li>Barlow, R. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li>
<li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li>
<li>Snodderly, D. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li>
<li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+a+neural+code+for+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li>
<li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limulus+lateral+eye%3A+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li>
<li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li>
</ol>

Nós ilustramos como realizar gravações ERG, gravações nervo óptico, e gravações de caranguejos-ferradura intra-in vivo. As técnicas de gravação cada fornecer informações diferentes sobre a base neural da visão, e todos eles podem ser usados ​​para estudar a função da retina em animais vivos graças aos olhos grandes do caranguejo e da carapaça dura. Atividade do nervo óptico pode até mesmo ser gravado a partir de animais se comportando livremente no oceano com a construção adequada de eletrodos (4). Essas técnicas também...

<table><tbody><tr><td>LED</td><td>Fonte de luz</td><td>Newark Inc</td><td>33C1292</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de sucção</td><td>Eletrodo</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador Extracelular XCell 3*4-Canais</td><td>Amplificador</td><td>FHC, Inc.</td><td>40-40-8B</td><td></td></tr><tr><td>Gravação intracelular</td><td>Amplificador</td><td>Cisne</td><td>IR-283A</td><td></td></tr><tr><td>APM</td><td>Discriminador de Potenciais de Ação Neurais</td><td>FHC, Inc.</td><td>APM</td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Quadro de Vídeo</td><td>Cambridge Research Systems</td><td>Bits++</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador Piezopatch</td><td>Microposicionador</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PPM5000</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de Pulso Quadrado</td><td>Estimulador Nervoso</td><td>Grass Technologies</td><td>Modelo S48</td><td></td></tr><tr><td>P-97</td><td>Puxador de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de Vidro de Borossilicato</td><td>Vidro do eletrodo</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Cavalo&amp;#8211; caranguejo (&lt;em&gt;Limulus polyphemus&lt;/em&gt;)</td><td>Animal</td><td>Laboratórios Biológicos Marinhos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas</td><td>Puxador de vidro</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio com zoom</td><td>Microscópio</td><td>Jed Pella Inc.</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr></tbody></table>

usando o caranguejo-ferradura, limulus polyphemus, em vision research

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

O caranguejo-ferradura americano, Limulus Polifemo é uma das mais antigas criaturas na terra, eo animal continua a desempenhar um papel indispensável na pesquisa biomédica. Não só o seu sangue contém células especiais que os cientistas usam para detectar bacteriotoxins em nossos medicamentos, mas seus olhos também contêm uma rede neural que tem proporcionado uma visão muito sobre os processos fisiológicos que operam em nosso sistema visual, como a adaptação de luz e inibição lateral. O caranguejo-ferradura continua a ser um modelo atraente para a investigação da visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, seus neurônios da retina são grandes e de fácil acesso, seu sistema visual é compacto e extensivamente estudado, e seu comportamento visual é bem definida. Além disso, a estrutura eo funcionamento dos olhos são modulados em uma base diária por um relógio circadiano no cérebro do animal s. Em suma, o sistema visual de caranguejos-ferradura é bastante simples de ser entendido ainda complexo o suficiente para ser interessante. Neste vídeo apresentamos três paradigmas eletrofisiológicos para investigar as bases neurais da visão que podem ser realizados in vivo com Limulus. Eles estão gravando eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra. Eletrorretinograma (ERG) gravações medida com uma superfície do eletrodo a resposta resumiu elétrica de todas as células do olho para um flash de luz. Eles podem ser usados ​​para monitorar a sensibilidade global do olho para prolongar os períodos de tempo. Gravações nervo óptico medir a atividade spiking de fibras nervosas individuais com um eletrodo microsuction extracelular. Elas podem ser usadas para estudar as mensagens visuais transmitidas do olho para o cérebro, bem como relógio circadiano-alimentado de volta mensagens do cérebro para os olhos. Medida intra gravações com um microeletrodo intracelular as flutuações de tensão induzida pela luz em células individuais do olho. Elas podem ser usadas para elucidar os mecanismos celulares de processamento da retina.

Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura,<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Esses paradigmas eletrofisiológicos pode ser usado para investigar as bases neurais da visão em um laboratório de pesquisa ou ensino.

Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é uma das criaturas mais antigas da Terra, e o animal continua a desempenhar um papel indispensável em...

Olá, sou Chris Paglia, diretor do Laboratório de Processamento de Informação Visual no Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Boston. Oi, sou Jacque Liu, aluna de doutorado no laboratório do Dr. Paglia. Os esforços de pesquisa do nosso laboratório são direcionados à compreensão dos cálculos neurais que permitem aos animais enxergar.Para esta pesquisa, utilizamos uma das criaturas mais antigas da Terra, o caranguejo-ferradura americano. Agora, esses animais podem ser fósseis vivos. Eles continuam desempenhando um papel indispensável na pesquisa biomédica.Não apenas seu sangue contém células especiais que os cientistas utilizam para detectar toxinas bacterianas em nossos medicamentos, mas seus olhos também possuem uma rede neural que forneceu grande compreensão sobre o funcionamento do nosso sistema visual. A base celular de processos como adaptação à luz e inibição lateral foi revelada pela primeira vez em estudos dos olhos compostos laterais do animal, e por esse trabalho pioneiro, o Dr. Keffer Hartline recebeu o Prêmio Nobel em 1967. O caranguejo-ferradura permanece um modelo atrativo para pesquisas sobre visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, e seus neurônios retinianos são grandes e facilmente acessíveis.Seu sistema visual é compacto e amplamente estudado, e seu comportamento visual é bem definido. Além disso, a estrutura e a função dos olhos são moduladas diariamente por um relógio circadiano no cérebro do animal. Em resumo, o sistema visual dos caranguejos-ferradura é simples o suficiente para ser compreendido, mas complexo o suficiente para ser interessante.Neste vídeo, ilustraremos três paradigmas experimentais para investigar a base neural da visão que podem ser realizados in vivo com este modelo animal clássico. Para pesquisas sobre visão, eles são: gravação eletroretinográfica, gravação do nervo óptico e gravação intrarretiniana. Os caranguejos-ferradura são mantidos em um tanque de água salgada arejada, em uma sala exposta a um ciclo luz-escuridão regulado.Antes de iniciar qualquer uma dessas técnicas de gravação, os animais são resfriados em um balde de gelo por cerca de 10 minutos e, em seguida, fixados em uma plataforma de madeira colocando dois parafusos de aço inoxidável no prosoma e dois no soma dos EPIs. A plataforma é ponderada na parte inferior com granito para que afunde na água. O eletroretinograma ou ERG é utilizado para monitorar a sensibilidade ocular ao longo do tempo.Mede a resposta elétrica bruta de todas as células do olho. Para o flash de luz, as ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, solução de Ringer com vaselina, uma pipeta, um LED, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável e um cotonete. Utilizamos uma câmara de gravação feita em laboratório para medir o ERG.O corpo é projetado para conter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para acoplar a solução condutiva a um amplificador e um pequeno orifício dimensionado para acomodar um LED antes da fixação. A parte inferior da câmara é revestida com vaselina.As câmaras são então fixadas sobre o olho do caranguejo-ferradura com dois parafusos preenchidos com solução salina e tampados. O animal é colocado em uma gaiola hermética à luz, dentro de um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. O cabo do LED é inserido na tampa da câmara.O eletrodo de sinal é conectado ao fio da câmara e o eletrodo de referência a um dos parafusos implantados, e ambos os eletrodos são ligados ao estágio inicial de um amplificador diferencial de alta impedância para amplificação do sinal e filtragem de ruído. Em seguida, a caixa é fechada para impedir que a luz ambiente alcance o animal. O estágio ad é conectado ao amplificador, e os filtros do amplificador são ajustados para permitir a passagem de frequências abaixo de aproximadamente 10 hertz.A partir daí, o sinal sobe para o osciloscópio, para visualização, e para uma placa de aquisição de dados, para análise e armazenamento no computador; utilizamos um programa personalizado escrito em LabVIEW para fornecer estímulos luminosos a partir do LED e para registrar o sinal de ERG. O LED é acionado com um pulso de 100 milissegundos de cinco volts a cada 10 minutos. À esquerda, é exibida a forma de onda do ERG correspondente a cada flash luminoso, e à direita é traçada a amplitude de pico a pico das formas de onda sucessivas dos flashes para acompanhar as alterações na sensibilidade ocular ao longo do tempo.Com gravações de ERG, pode-se estudar os efeitos da adaptação à luz e da modulação neural circadiana. O olho transmite mensagens visuais ao cérebro e as respostas de potenciais de ação das fibras de seu nervo óptico. As mensagens codificadas podem ser estudadas por meio de gravações extracelulares de fibras nervosas individuais.Mensagens do relógio circadiano retroalimentadas para o olho também podem ser estudadas por este método. As ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, solução de Ringer, eletrodos, tesoura, câmara de registro, pinça curva, sonda de agulha fina, bisturi rombo, tesoura cirúrgica e eletrodo seccional. As câmaras de registro projetadas com uma saliência para acomodar o nervo permitem que 20 mililitros de sangue sejam drenados do cavalo ou caranguejo mediante a inserção de uma agulha de calibre 16 entre os músculos da articulação e até o coração.A exsanguinação não é necessária, mas facilita a dissecação do nervo óptico com o animal fixado na plataforma. A localização do nervo óptico é estimada traçando-se uma linha levemente curva no carpo entre os olhos lateral e mediano. Em seguida, faz-se um orifício circular no carpo com um refin.O orifício tem o mesmo diâmetro da base da câmara. O centro do orifício está localizado cerca de dois centímetros à frente do olho lateral e ligeiramente dorsal à linha, de modo que o nervo percorra a porção ventral da câmara. O tecido conjuntivo sobrejacente é removido até que um segmento completo do nervo fique visível, e o nervo exposto é separado do tecido circundante e subjacente. Um filamento é passado ao redor do nervo e puxado para dentro da câmara através da abertura semicircular na base.Através dessa mesma abertura, o nervo é suavemente guiado para dentro da câmara puxando-se o fio. À medida que o nervo entra na câmara, a base é empurrada para dentro do orifício para minimizar o estiramento do nervo. A câmara é então fixada com dois parafusos e preenchida com solução de Ringer.Após a fixação da câmara, o animal é colocado em uma gaiola de maré clara em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. O interior da câmara é visualizado sob um estereoscópio e algodão é colocado ao redor da abertura da parte inferior para evitar vazamento de sangue para dentro e de solução de Ringer para fora da câmara. A câmara é reabastecida com solução de Ringer fresca.O tecido residual é removido com tesoura fina e pinça. Um pequeno corte é feito na bainha que encapsula o nervo e o nervo é separado da bainha com uma sonda de agulha fina. A bainha é gradualmente desenrolada e removida mediante cortes ao longo do comprimento do nervo.Um pequeno feixe de fibras é então separado do nervo usando a sonda e cortado na extremidade mais distante do olho para gravação de fibras aferentes e na extremidade mais próxima do olho para gravação de fibras eferentes. Utilizamos um eletrodo de sucção do sistema AM preenchido com solução de Springer para gravação, que é conectado por tubulação a uma seringa de Gilson para sucção. A ponta do eletrodo é fabricada por polimento a chama da extremidade de uma capilar de vidro borossilicatado com diâmetro de um milímetro. Uma conexão A e C fornece o cabo do sinal, e o cabo de referência é um fio de cloreto de prata enrolado ao redor do eletrodo para reduzir o ruído.A ponta do eletrodo é posicionada na câmara de gravação e a extremidade cortada do feixe nervoso é aspirada para dentro da ponta de vidro por sucção. Os cabos do sinal e de referência são conectados ao estágio inicial de um amplificador diferencial para amplificação do sinal e filtragem de ruídos. A saída do amplificador é enviada a um osciloscópio para visualização e a uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento em computador.Utilizamos um programa personalizado escrito em LabVIEW para controlar estímulos luminosos e um discriminador digital de potenciais de ação para registrar trenos de disparos. Um guia de luz de fibra óptica é empregado para iluminação de célula única, enquanto um display de vídeo controlado por computador é usado para estimulação por padrões com gravações do nervo óptico, permitindo estudar a transmissão de sinais entre os olhos e o cérebro na retina. O registro envolve a inserção de um microeletrodo diretamente nas células do olho e a gravação das flutuações de voltagem intracelular induzidas pela luz.As ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma plataforma lúcido em forma de L. Os furos roscados acomodam um microeletrodo sobre o eletrodo de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino. Após a captura do caranguejo, uma árvore segura, uma plataforma de madeira, uma placa lúcido com furos roscados pré-definidos é fixada ao carpo com dois parafusos laterais e um parafuso superior.O animal é colocado em uma gaiola hermética à luz, dentro de um tanque preenchido com água do mar sobre as brânquias. Um posicionador micro motorizado é fixado firmemente à lâmina com parafusos e o braço do posicionador é alinhado sobre o olho. Um lote de micropipetas de vidro é puxado a partir de vidro de silicato com um milímetro de diâmetro externo, e as pontas são preenchidas por trás por ação capilar.Colocando as pipetas em um frasco com solução de cloreto de potássio 3 molar por alguns minutos, o restante da pipeta é preenchido manualmente com a solução salina e inserido em um suporte para microeletrodo previamente preenchido com solução, a fim de evitar a formação de bolhas. O suporte para eletrodo é então inserido no estágio principal de um amplificador intracelular fixado ao microposicionador. Uma seção da retina é exposta cortando cuidadosamente uma pequena área quadrada da córnea dorsal.Com o bisturi, uma gota de Solução de Ringer é colocada sobre o tecido exposto para evitar secagem, e a micropipeta é avançada em direção à retina. Quando a ponta da pipeta toca a solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular é ativado e a impedância do eletrodo é medida; micropipetas com impedâncias fora da faixa de 20 a 70 megaohms são descartadas. Aquelas dentro dessa faixa são avançadas em passos microscópicos para dentro da retina e introduzidas nas células mediante vibração eletrônica da ponta; estímulos luminosos são aplicados para penetrar células por meio de um cabo de fibra óptica ou exibição em vídeo.Três tipos de células podem ser encontrados no olho do caranguejo-ferradura: células ular, células excêntricas e células de pigmento. As células ular apresentam uma grande resposta de despolarização à luz, as células excêntricas exibem uma sequência de potenciais de ação sobreposta a uma resposta de despolarização, e as células de pigmento não apresentam qualquer resposta à luz. A resposta é observada em um osciloscópio e registrada em um computador por meio de gravações intrarretinianas. Pode-se estudar a base celular da visão.Para concluir, demonstramos como realizar gravações de eletroretinograma, gravações do nervo óptico e gravações intrarretinianas em caranguejos-ferradura in vivo. Esses métodos são amplamente utilizados e fornecem insights únicos sobre os mecanismos neurais do processamento de informações visuais em caranguejos-ferradura. Eles não são apenas simples de aplicar em um laboratório de pesquisa, mas também podem ser facilmente incorporados a um laboratório didático de neurofisiologia visual.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é sem dúvida a fonte mais conveniente para grandes quantidades de sangue de invertebrados. O sangue é simples na composição, com apenas um tipo celular na circulação geral, o Amebocyte granular, e apenas três proteínas abundante no plasma, hemocianina, as proteínas C-reativa e α2-macroglobulina. O sangue é coletado a partir do coração e as células de sangue e plasma são separados por centrifugação.

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

A técnica de dissecção ilustra enucleação do olho do rato para fixação do tecido para realizar fenotipagem em alto rendimento telas.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

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Aprenda técnicas eletrofisiológicas para pesquisa da visão usando Limulus Polyphemus. Este método demonstra registros de eletroretinograma, nervo óptico e intrarretinianos in vivo.

Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

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