Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

Olá, sou Marcus to do laboratório de Steven Helm, do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para a construção de uma biblioteca ambiental com inserção de grande tamanho. Auxiliando-me no procedimento de hoje está San Lee, que realizará o empacotamento de fago e a infecção do hospedeiro da biblioteca, Escherichia coli, bem como Elise Hawley e Chin Yang, que realizarão a seleção de colônias.

Temos este procedimento em nosso laboratório para estudar a estrutura e o metabolismo da comunidade microbiana em ambientes marinhos e terrestres. Então, vamos começar. Este protocolo para criação de uma biblioteca de DNA fo smid inicia-se após o isolamento e a fragmentação do DNA genômico a partir de amostras de biomassa, procedimentos que detalhamos em artigos complementares da JoVE.

Os próximos passos preparam o DNA SHE para a ligação no vetor SMID PCC um. O primeiro passo é reparar as extremidades dos fragmentos de DNA SHE e realizar a fosforilação. Nas extremidades cinco primas, todos os reagentes necessários para esta etapa estão incluídos no kit de produção da biblioteca PCC um SMID da Epicenter. Para montar a reação de reparo de extremidades, descongele todos os reagentes no gelo, depois combine o tampão de reparo de extremidades, mistura de dNTPs, enzima mista, até 20 microgramas de DNA do inserto SHE a 0,5 microgramas por microlitro e água, até completar 80 microlitros. Centrifugue brevemente o tubo para levar todo o líquido para o fundo.

Incube a reação de reparo de extremidades à temperatura ambiente por 45 minutos a uma hora. Em seguida, aqueça e inative as enzimas a 70 graus Celsius por 10 minutos. Durante a incubação do reparo de extremidades, você pode preparar o gel para o próximo passo.

Eletroforese em gel com campo pulsado, ou PFGE, seu objetivo é isolar moléculas de DNA que variam de 30 a 60 kilobases. A PFGE é um método eletroforético para separar esses grandes fragmentos, que migram juntos durante a eletroforese padrão. Para começar, prepare um gel a 1% usando agarose de baixo ponto de fusão em 150 mililitros de tampão de eletroforese 1X TAE.

Escolha pentes que permitam carregar toda a amostra de 80 microlitros de DNA após reparo de extremidades, mais tampão de carregamento, em um ou dois poços. Tenha especial cuidado ao manipular o gel, pois géis de agarose de baixo ponto de fusão quebram com muita facilidade durante a solidificação.

Prepare a câmara de eletroforese. Adicione 2,2 litros de XTAE ao recipiente e ligue a máquina para circular o tampão de corrida. Ajuste o dispositivo de refrigeração para 14 graus Celsius e configure a bomba para 70 RPM.

Inclua um marcador PFG de faixa intermediária também da NEB. Para evitar cortar o gel muito alto, extruda aros da seringa de gel e corte uma pequena tampa da extremidade com o bisturi. Coloque a tampa na frente do poço e feche com aros fundido.

Certifique-se de que o tampão de eletroforese tenha esfriado até 14 graus Celsius antes de carregar seu gel. No primeiro poço, carregue cinco microlitros do digesto Lambda Hindi III da New England Biolabs. No segundo poço, carregue um microlitro do marcador de tamanho controle Smid diluído em 10 microlitros de água estéril mais tampão de carregamento.

Em seguida, carregue sua mistura com reparo de extremidades e inativada pelo calor, mais o tampão de carregamento. Feche a tampa e programe a máquina. A eletroforese em gel será realizada durante a noite ou por 12 horas.

Quando a eletroforese terminar, use uma coloração com cyber gold para visualizar o DNA. Dilua o cyber gold em 250 mililitros de TAE 1X, coloque o gel na solução e cora por uma hora no escuro, pois o cyber gold é sensível à luz. Enquanto o gel está sendo corado, prepare um banho-maria a 70 graus Celsius e outro a 45 graus Celsius para a etapa de extração do gel que se segue.

O próximo passo é excisar e fazer a eletroforese em gel. Purifique o DNA dentro da faixa de tamanho desejada, de 30 a 60 quilobases. Leve seu gel corado junto com um tubo microfúga vazio, rasgado e rotulado e um bisturi estéril até o transiluminador de luz azul.

Cubra o transluminador com filme plástico para evitar contaminação cruzada do seu gel. Coloque os óculos de proteção e ligue a luz azul. Agora você pode visualizar seu DNA genômico com as extremidades reparadas e o marcador de tamanho controle FO smid. Com o bisturi, recorte um fragmento de gel com largura de cinco a sete milímetros que tenha migrado junto e ligeiramente acima do marcador de tamanho controle smid.

Utilize o marcador PFG como limite superior para o seu corte. Transfira o corte para o tubo rasgado. Você pode armazenar os cortes a menos 20 graus Celsius por até um ano antes de prosseguir.

Agora é a hora de fazer o gel. Purifique o DNA do seu fragmento. Pese o tubo contendo o seu fragmento de gel e calcule o peso do fragmento subtraindo o peso do tubo vazio.

Em seguida, aqueça o fragmento no banho-maria a 70 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Após o fragmento de gel se fundir completamente, transfira o tubo rapidamente para o banho-maria a 45 graus Celsius. Tenha em mente que um miligrama de gel sólido possui um volume de um microlitro após a fusão.

Adicione uma unidade ou um microlitro de preparação da enzima Jase por 100 microlitros de aros fundido. Incube a 45 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione dois a quatro microlitros a mais de les e incube a 45 graus Celsius por mais uma hora com aquecimento.

Inative o gel a 70 graus Celsius por 10 minutos após o aquecimento. Após a inativação da enzima, coloque o tubo em gelo por 10 minutos e, em seguida, centrifugue na velocidade máxima, 13.000 RPM, por 15 minutos para formar um pellet com quaisquer partículas insolúveis.

Tendo cuidado para não perturbar o pellet. Remova o sobrenatante superior contendo seu DNA purificado e transfira-o para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, dilua com três mililitros de água estéril para lavar e concentrar o DNA.

Transfira a solução do tubo cônico de 15 mililitros para a unidade de filtro centrífugo Ancon Ultra com membrana ultra cell 10. Coloque a unidade de filtro em um rotor de balde oscilante utilizando um tubo cônico de 50 mililitros como adaptador e gire a 4.000 ×g por seis a oito minutos. Centrifugue até restar aproximadamente de 100 a 500 microlitros de solução.

Permaneça no filtro e descarte o fluxo que passou. Em seguida, adicione mais três mililitros de água estéril ao tubo cônico vazio. Transfira a solução para o tubo Amon e repita a etapa de centrifugação.

Lave o tubo de falcão pela terceira vez e reduza o volume final coletado no filtro para 50 a 100 microlitros. Você não precisa se preocupar em perder a amostra. O filtro reterá 50 microlitros de líquido mesmo após centrifugação prolongada.

Transfira a solução de DNA restante do tubo AmCon para uma unidade de filtro centrífugo MicroCon YM 50 pré-lavada e enxágue o tubo Amon com mais 50 microlitros de água estéril para recuperar todo o DNA. Centrifugue a unidade de filtro centrífugo MicroCon YM 50 em uma microcentrífuga a 10.000 ×g até que o filtro ainda esteja ligeiramente coberto por líquido. Verifique a cada minuto.

Se apenas uma pequena quantidade de líquido permanecer no filtro, vire o filtro ao contrário e recupere sua solução de DNA por meio de uma segunda etapa de centrifugação a 1000 ×g por três minutos em um tubo microcentrífuga novo. O volume resultante não deve exceder de 10 a 15 microlitros no total.

Caso contrário, seu DNA pode estar muito diluído para a ligação. Verifique a concentração da solução de DNA resultante por meio do NanoDrop ou ensaio com Pico Green. Recuperado e reparado.

O DNA agora está pronto para ser ligado ao vetor de clonagem PCC one FO SMID. Para a ligação, descongele todos os reagentes em gelo. Em seguida, combine-os na ordem listada aqui, misturando após cada adição. Primeiro, adicione água estéril para atingir um volume final de reação de 10 microlitros.

Em seguida, adicione 10 x tampão de ligação rápida, A-T-P-P-C-C 10 milimolar, um vetor SMID e o inserto em uma proporção molar de 10 para 1. E, por fim, DNA ligase rápida. Centrifugue brevemente o tubo para recolher todo o líquido no fundo.

Toque no tubo e centrifugue novamente. Incube a reação de ligação à temperatura ambiente por duas horas e inative a enzima pelo calor por 10 minutos a 70 graus Celsius. Neste ponto, você pode armazenar a reação de ligação a menos 20 graus Celsius ou prosseguir para a etapa de encapsidamento fágico.

O próximo passo é gerar fagos bacterianos que funcionarão para introduzir sua biblioteca FO SMID em *E. coli*. Dois ou três dias antes de planejar realizar o passo de embalagem do fago, faça um esgotamento da cepa fornecida EPI 300 T1 resistente em uma placa de LB simples e incube durante a noite a 37 graus Celsius para obter colônias isoladas. Você pode selar essa placa e armazená-la a 4 graus Celsius para uso futuro. No dia anterior às reações de embalagem, inocular 50 mililitros de caldo Albee contendo 10 milimolares de sulfato de magnésio com uma única colônia da sua placa Epi 300. Agite a 225 RPM e 37 graus Celsius durante a noite.

No dia das reações de embalagem, inocular 50 mililitros frescos de caldo LB acrescido de sulfato de magnésio 10 milimolar com cinco mililitros da cultura mantida durante a noite. Incubar as bactérias a 37 graus Celsius até uma DO600 entre 0,8 e 1,0. Não ultrapassar DO600 de 1,0.

Dilua sua amostra antes de medir no espectrofotômetro para obter um resultado preciso. Armazene na gelo ou a quatro graus Celsius até que esteja pronto para prosseguir ou por até 72 horas. Agora que as bactérias estão prontas para infecção, é hora de preparar o descongelamento do fago.

Os fagos máximos extraídos por embalagem Lambda são mantidos no gelo. Usando um tubo por reação de ligação, o descongelamento levará cerca de 10 a 15 minutos. Enquanto isso, resfrie previamente um tubo vazio de 1,5 mililitro no gelo novamente, utilizando um tubo por reação.

Uma vez que os extratos de embalagem Lambda tenham descongelado, transfira imediatamente 25 microlitros de cada extrato de embalagem para um tubo microfuga de 1,5 mililitro previamente resfriado e coloque no gelo. Retorne o extrato de embalagem restante para menos 80 graus Celsius. Deixar os extratos de embalagem descongelados no gelo por muito tempo reduzirá a eficiência de infecção.

Em seguida, adicione 10 microlitros da reação de ligação a cada 25 microlitros dos extratos descongelados sobre gelo, misturando por pipetagem várias vezes sem introduzir bolhas de ar. Centrifugue brevemente para reunir todo o líquido no fundo dos tubos e incube as reações de empacotamento em banho-maria a 30 °C por 90 minutos. Após 80 minutos de incubação, descongele o extrato de empacotamento restante sobre gelo.

Após a conclusão da reação de embalagem de 90 minutos, adicione os 25 microlitros restantes do extrato de embalagem a cada tubo de reação. Incube as reações por mais 90 minutos a 30 graus celsius. Após a segunda incubação, adicione 100 microlitros do tampão de diluição de fago preparado em cada tubo de embalagem e misture suavemente, adicionando cinco microlitros de clorofórmio a cada tubo.

Agora você deve ter um volume total de 165 microlitros no tubo. Pode formar-se um precipitado viscoso após a adição de clorofórmio. Evite esse precipitado, bem como a fase orgânica de clorofórmio, ao pipetar as partículas de fago.

Neste momento, você pode armazenar as partículas de fago empacotadas a quatro graus por vários dias, se necessário, mas utilize fago recém-preparado para obter os melhores resultados. Agora você está pronto para infectar as células hospedeiras, que foram cultivadas durante as etapas de empacotamento do fago, com o fago empacotado. Adicione o fago empacotado às células hospedeiras resistentes EPI 300 T1 com OD 600 entre 0,8 e 1,0 na proporção de 400 microlitros de células resistentes EPI 300 T1 para cada 10 microlitros de partículas de fago.

Para evitar a pipetagem de clorofórmio do fundo do tubo dos fagos empacotados, utilize 125 microlitros das partículas de fago empacotadas e cinco mililitros de células hospedeiras resistentes preparadas em epi 300 T, misturando suavemente e, em seguida, incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. O próximo passo é determinar o título dos fagos empacotados. Isso é feito plaqueando as bactérias infectadas em meio de cultura para selecionar as células infectadas.

Em seguida, conte as colônias resultantes e divida pelo volume de fago adicionado às bactérias que você plaqueou. O SMID C1 contém um gene de resistência à cloranfenicol. Para selecionar clones infectados, plaque as bactérias em placas de LB contendo cloranfenicol.

Espalhe duas vezes 50 microlitros e duas vezes 10 microlitros das células resistentes a EPI 300 T1 infectadas com fago em quatro placas separadas e coloque as placas de cabeça para baixo em um incubador a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas, não mais que 48 horas, até a formação de colônias. Enquanto isso, recolha as células resistentes a EPI 300 T1 remanescentes da infecção de cinco mililitros por centrifugação a 3.500 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante.

Adicione um mililitro de LB com 20% de glicerol ao tubo de ressuspensão. Suspenda o pellet celular e alíquota em 100 microlitros cada em tubos criogênicos de dois mililitros, congele imediatamente e armazene a menos 80 graus Celsius. Para uso posterior na etapa de seleção de colônias no dia seguinte, conte o número de clones nas quatro placas no incubador a 37 graus Celsius e determine o título do fago empacotado, que será utilizado na próxima etapa.

O estoque congelado resistente a glicerol de EPI 300 T contém células transduzidas com todos os diferentes plasmídeos da sua biblioteca. Em seguida, espalhe uma quantidade apropriada com base no título viral e no tamanho da placa de cada smid. Clone em um quadrado de 2,45 por 2,45 milímetros.

Placas de bioensaio de LB com cloranfenicol usando esferas de vidro. Adicione também uma pequena quantidade de caldo LB à placa para espalhar suas células uniformemente. Tenha em mente que o preparo do estoque glicerinado concentra suas células cerca de cinco vezes.

Incubar a 37 graus Celsius por 24 horas nos dias da seleção de colônias; preparar 96 ou 3 placas de 84 poços contendo 200 microlitros ou 70 microlitros por poço de caldo LB, suplementado com 12,5 microgramas de cloranfenicol por mililitro de caldo para seleção com antibiótico e 10% de glicerol para congelamento. Utilizamos o sistema automatizado de preenchimento de placas qfi três para esta etapa.

O próximo passo é selecionar colônias das suas placas LB CLORAMFENICOL preparadas e transferi-las para as suas placas de 96 ou 3 placas de 84 poços preparadas para congelamento. Para esta etapa, estamos utilizando o robô de seleção de clones qix dois, de acordo com o manual do usuário, para criar um ambiente estéril ao redor da área de seleção de clones. Ligue a luz UV por 30 minutos enquanto a luz UV estiver ligada.

Prepare 500 mililitros de água sanitária a 1%, 500 mililitros de água desionizada estéril e 500 mililitros de etanol a 80%. Quando a luz ultravioleta se apagar, encha as bandejas conforme rotulado, de trás para frente. Coloque primeiro a água sanitária a 1%, depois a água desionizada autoclavada e, na bandeja da frente, o etanol a 80%.

Certifique-se de que estão cheios, pois as agulhas de seleção não podem ser lavadas adequadamente sem solução de lavagem suficiente. Após configurar os parâmetros para uma seleção ideal, remova as tampas das suas placas bacterianas e das placas de 96 ou 384 poços preenchidas com LB e posicione-as entre os pinos no Q Picks. As placas da área de trabalho devem ficar bem ajustadas ao canto frontal direito para que não se movimentem durante a seleção.

Em seguida, feche o painel frontal. Após todos os parâmetros serem definidos, o procedimento de coleta pode começar. Quando toda a coleta for concluída, enxágue as escovas e as bandejas com água desionizada e coloque sobre a bancada para secar.

Limpe qualquer derramamento que possa ter ocorrido e limpe o interior do CICS com etanol a 80%. Certifique-se de que todas as placas de estoque glicerinado estejam rotuladas e coloque-as no incubador a 37 graus Celsius por 24 horas para cultivar uma cultura a partir de cada colônia selecionada. Deixe um bilhete no incubador contendo o número da data das placas incubadas, horário da incubação, horário de retirada e suas iniciais.

Após a incubação, você terá sua biblioteca. Cada poço contém uma cultura de um clone bacteriano contendo o PCC com um fragmento de DNA ligado a um pedaço de DNA fragmentado da sua amostra inicial. Congele as placas a menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo e parabenize-se por um trabalho bem-sucedido.

O protocolo apresentado descreve o procedimento para gerar uma biblioteca ambiental de SMID com o objetivo de capturar o conteúdo genético de uma comunidade microbiana em um habitat específico. Este protocolo deve criar uma biblioteca de SMID representativa do conteúdo genético do ambiente amostrado e deve permitir ao leitor otimizar etapas críticas. Se a quantidade de clones de SMID de FO obtida ao final de todo o procedimento for muito baixa.

Acabamos de mostrar como construir a biblioteca FO SMID a partir de DNA genômico derivado de uma amostra de água marinha. Ao realizar este procedimento, é importante iniciar com DNA genômico de alta qualidade. Tenha todos os seus placas e reagentes prontos antes de começar e planeje tempo suficiente para este processo de múltiplas etapas.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.