Name: Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: Aprenda a construir uma biblioteca fosmid ambiental de grandes inserções a partir de DNA genômico de amostras marinhas. Este método permite estudar a estrutura e metabolismo de comunidades microbianas em ecossistemas com variabilidade de oxigênio.

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Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. MT e SL foram apoiados por bolsas de estudo do Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution (CMDE). MT também recebeu apoio bolsa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

Um procedimento é descrito como mais eficiente gerar uma grande biblioteca a inserir fosmid com DNA genômico derivado de uma amostra de água costeiras. A montante extração do DNA genômico é descrito em um protocolo separado [3]. Como a produção fosmid-biblioteca é um processo de várias etapas, plano de pelo menos duas a três semanas a tempo para todo o procedimento, incluindo todos os passos quatro apresentaram. A extração de DNA genômico é o passo mais crucial e todos os fluxos de down-pass...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Etapa II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Produção de Biblioteca de Fosmídeos CopyControl&amp;#8482;</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>suficiente para gerar 9-10 bibliotecas de fosmídeos</td></tr><tr><td>Agarose SeaPlaque</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>placa de aquecimento com agitação</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>tampão de eletroforese 1,0X TAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema de eletroforese em campo pulsado CHEF Mapper XA, incluindo módulo de refrigeração e bomba de velocidade variável</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestão de DNA-HindIII de &amp;#955;</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>Marcar PFG MidRange I</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold 10.000X</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>filme plástico microondável</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transiluminador Safe Imager</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Preparação GELase para Digestão de Gel de Agarose</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de bisturi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtragem Centrífuga Amicon Ultra-4 com membrana Ultracel-10</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtragem Centrífuga Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>água livre de nucleases</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 ensaios*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>aquecedor digital de bloco seco</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>rotor de centrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>tubos microcentrífugos, 1,7 mL, transparentes</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Etapa III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>caldo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>tampão de diluição de fago</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8,3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>frascos criogênicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Etapa IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços com tampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>placa de 384 poços com tampa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 100 O.D. x 15 mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri 150 Dia. x 15 mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 x 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>caldo LB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Difco</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>esferas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>água sanitária</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>coletor de colônias QPix</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>cabeçote de coleta (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

grandes inserir produção ambiental biblioteca genômica

Large Insert Environmental Genomic Library Production

A grande maioria dos micróbios na natureza atualmente permanecem inacessíveis aos métodos tradicionais de cultivo. Durante a última década, a cultura independente de genômica ambiental (<em&gt; Ou seja,</em&gt; Metagenomic) abordagens surgiram, permitindo aos investigadores para colmatar esta lacuna através da captura de cultivo o conteúdo genético de comunidades microbianas indígenas diretamente do ambiente. Para este fim, bibliotecas de DNA genômico são construídos usando o padrão ainda técnicas de clonagem artful laboratório. Aqui, descrevemos a construção de uma grande biblioteca genômica ambiental inserir fosmid com DNA derivado da continuidade de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica. Este protocolo está diretamente ligada a uma série de protocolos ligados incluindo amostragem costeiros marinhos de água [1], filtração grande volume de biomassa microbiana [2] e uma extração de DNA e protocolo de purificação [3]. No início, o DNA genômico de alta qualidade é reparada final, com a criação de 5-fosforilada termina sem corte. Fim-reparado DNA é submetido a eletroforese em campo pulsado gel (PFGE) para seleção de tamanho e extração de gel é executada para recuperar fragmentos de DNA entre 30 e 60 mil pares de base (Kb) de comprimento. DNA tamanho selecionado é purificado longe da matriz de gel PFGE e ligada à fosfatase tratados com blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (Epicentro<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; Http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;). Concatemers linear de pCC1 e DNA de inserção são posteriormente headfull empacotados em partículas de fago lambda por terminase, com infecção subseqüente de resistentes aos fagos<em&gt; E. coli</em&gt; Células. Clones com sucesso transduzidas são recuperados em placas de agar LB sob seleção de antibióticos e arquivadas em formato de 384 poços da placa usando uma colônia automatizado escolher robô (Qpix2, Genetix). O protocolo atual baseia-se em várias fontes, incluindo o CopyControl Kit de Produção da Biblioteca Fosmid Epicentro e os trabalhos publicados de vários grupos de pesquisa [4-7]. Cada passo é mostrado com as melhores práticas em mente. Sempre que possível, destacar sutilezas na execução para melhorar a qualidade ea eficiência global da produção biblioteca. Todo o processo de produção biblioteca fosmid e escolhendo colônia automatizado leva pelo menos 7-10 dias, pois há muitos passos de incubação incluídos. No entanto, existem vários pontos de parada possível, que são mencionados no âmbito do protocolo.

Construção de uma biblioteca fosmid com DNA genômico ambiental isolado do contínuo de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica é descrito. A biblioteca clone resultante é escolhido em 384 poços pratos e arquivados para seqüenciamento e análise funcional a jusante pela aplicação de um sistema automatizado colônia colheita.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

A vasta maioria dos microrganismos na natureza permanece, atualmente, inacessível aos métodos de cultivo tradicionais. Ao longo da última década, métodos independentes de cultura...

Olá, sou Marcus to do laboratório de Steven Helm, do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para a construção de uma biblioteca ambiental com inserção de grande tamanho. Auxiliando-me no procedimento de hoje está San Lee, que realizará o empacotamento de fago e a infecção do hospedeiro da biblioteca, Escherichia coli, bem como Elise Hawley e Chin Yang, que realizarão a seleção de colônias.Temos este procedimento em nosso laboratório para estudar a estrutura e o metabolismo da comunidade microbiana em ambientes marinhos e terrestres. Então, vamos começar. Este protocolo para criação de uma biblioteca de DNA fo smid inicia-se após o isolamento e a fragmentação do DNA genômico a partir de amostras de biomassa, procedimentos que detalhamos em artigos complementares da JoVE.Os próximos passos preparam o DNA SHE para a ligação no vetor SMID PCC um. O primeiro passo é reparar as extremidades dos fragmentos de DNA SHE e realizar a fosforilação. Nas extremidades cinco primas, todos os reagentes necessários para esta etapa estão incluídos no kit de produção da biblioteca PCC um SMID da Epicenter. Para montar a reaç

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

O ensaio genético repórter é uma ferramenta bem estabelecida e poderosa para dissecar a relação entre as sequências de DNA e suas atividades reguladoras de genes. O acoplamento de elementos reguladores candidatos a genes repórteres que carregam etiquetas de sequência de identificação permite a paralelização massiva desses ensaios.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

Métodos para a geração de bibliotecas gRNA em larga escala devem ser simples, eficiente e econômica. Descreveremos um protocolo para a produção de bibliotecas de gRNA baseado na digestão enzimática de ADN alvo. Este método, CORALINA (geração de biblioteca gRNA abrangente através da actividade nuclease controlada) apresenta uma alternativa para síntese do oligonucleotide personalizado dispendiosos.

Um protocolo Universal para grande escala gRNA biblioteca de produção a partir de qualquer fonte de DNA

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda a construir uma biblioteca fosmid ambiental de grandes inserções a partir de DNA genômico de amostras marinhas. Este método permite estudar a estrutura e metabolismo de comunidades microbianas em ecossistemas com variabilidade de oxigênio.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

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