Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

Olá, sou Marcus do laboratório de Steven Helm no Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje mostraremos um procedimento para a construção de uma grande biblioteca ambiental de inserção. Ajudando-me no procedimento de hoje está San Lee, que realizará a embalagem de fagos e infecção do hospedeiro da biblioteca e coli, bem como Elise Hawley e Chin Yang, que realizarão a colheita da colônia.

Temos este procedimento em nosso laboratório para estudar a estrutura e o metabolismo da comunidade microbiana em ambientes marinhos e terrestres. Então vamos começar. Este protocolo para a criação de uma biblioteca de DNA fo smid começa após o isolamento e cisalhamento do DNA genômico de procedimentos de amostras de biomassa que detalhamos no acompanhamento de Jo de artigos.

Os próximos passos preparam o DNA SHE para ligação no vetor SMID PCC. O primeiro passo é reparar as extremidades dos pedaços de DNA SHE e fosforilar. As cinco extremidades principais, todos os reagentes necessários para esta etapa estão incluídos no kit de produção da biblioteca PCC one SMID do epicentro para configurar a reação de reparo final, descongelar todos os reagentes no gelo e, em seguida, combinar o tampão de reparo final DNTP, misturar um TP até 20 microgramas de ela inserir DNA a 0,5 microgramas por microlitro de mistura enzimática e água Para atingir 80 microlitros brevemente centrifugue o tubo para levar todo o líquido ao fundo.

Incube a reação de reparo final em temperatura ambiente por 45 minutos a uma hora. Em seguida, aquece, ele inativa as enzimas a 70 graus Celsius por 10 minutos. Durante a incubação do reparo final, você pode preparar o gel para a próxima etapa.

Eletroforese em gel de campo pulsado ou PFGE, seu objetivo é isolar moléculas de DNA que variam de 30 a 60. Kilobases PFGE é um método eletroforético para resolver esses grandes fragmentos que correm juntos durante a eletroforese padrão. Para começar, prepare um gel de 1% usando aros de baixo ponto de fusão em 150 mililitros de um tampão de corrida XTAE.

Escolha pentes que permitam carregar toda a amostra de 80 microlitros de DNA de reparo final mais o tampão de carregamento em um ou dois poços. Tenha especial cuidado ao manusear o gel como géis agros de baixo ponto de fusão. Quebre muito facilmente enquanto o gel está solidificando.

Prepare a câmara de eletroforese. Adicione 2,2 litros de um XTAE na câmara e ligue a máquina para circular o buffer de funcionamento. Defina o dispositivo de resfriamento para 14 graus Celsius e ajuste a bomba para 70 RPM.

Inclua um marcador PFG de médio alcance também do NEB. Para evitar cortar o gel muito alto, faça a extrusão de aros da seringa de gel e corte um pequeno tampão da extremidade com o bisturi. Coloque o bujão na frente do poço e sele com aros fundido.

Certifique-se de que o buffer de corrida esfriou a 14 graus Celsius antes de carregar o gel. No primeiro poço carregam cinco microlitros de New England Biolabs Lambda Hindi três digerem. No segundo poço, carregue um microlitro do marcador de tamanho de controle Smid diluído em 10 microlitros de água estéril mais tampão de carga.

Em seguida, carregue sua extremidade reparada e mistura inativada por calor mais buffer de carregamento. Feche a tampa e programe a máquina. O gel funcionará durante a noite ou 12 horas.

Quando o gel terminar de funcionar, use uma mancha de ouro cibernético para visualizar o DNA diluir o ouro cibernético. Em 250 mililitros de um XTAE, coloque seu gel na solução e mante por uma hora no escuro cyberg gold é sensível à luz enquanto o gel está manchando. Prepare um banho-maria a 70 graus Celsius e um F 45 graus Celsius para a etapa de extração do gel a seguir.

O próximo passo é extirpar e gelificar. Purifique o DNA dentro da faixa de tamanho desejada de 30 a 60 quilobases. Leve seu gel corado junto com um tubo de micro subterfúgio vazio rasgado e rotulado e um bisturi estéril para o transiluminador de luz azul.

Forre o transiluminador com filme plástico para evitar a contaminação cruzada do seu gel. Amanheça os óculos de visualização e acenda a luz azul. Agora você pode ver seu DNA genômico reparado final e o marcador de tamanho de controle FO smid Com o bisturi, retire uma fatia de gel de cinco a sete milímetros de largura que migrou com e ligeiramente acima do marcador de tamanho de controle smid.

Use o marcador PFG como um limite superior para sua fatia. Transfira a fatia para o tubo rasgado. Você pode armazenar as fatias a menos 20 graus Celsius por até um ano antes de prosseguir.

Agora é hora de gelificar. Purifique o DNA de sua fatia. Pese o tubo que contém sua fatia de gel e calcule o peso da fatia subtraindo o peso da lágrima.

Em seguida, derreta a fatia no banho-maria a 70 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Depois que a fatia de gel estiver completamente derretida, transfira o tubo rapidamente para o banho-maria a 45 graus Celsius. Tendo em mente que um miligrama de gel sólido tem um volume de um microlitro após a fusão.

Adicione uma unidade ou um microlitro de preparação enzimática Jase por 100 microlitros de aros derretido. Incube a 45 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione dois a quatro microlitros a mais e incube a 45 graus Celsius para uma hora a mais de calor.

Inative o gel a 70 graus Celsius por 10 minutos após o calor. Inativando a enzima, colocou o tubo no gelo por 10 minutos e depois centrifugou na velocidade máxima. 13, 000 RPM por 15 minutos para pellet quaisquer partículas insolúveis.

Tomando cuidado para não mexer no pellet. Remova o sobrenadante superior contendo seu DNA purificado e transfira-o para um tubo de falcão de 15 mililitros. Em seguida, dure-o com três mililitros de água estéril ao lado de lavar e concentrar o DNA.

Transfira a solução do tubo Falcon de 15 mililitros para a unidade de filtro centrífugo Ancon Ultra com uma membrana ultra cell 10. Coloque a unidade de filtro em um rotor de balde oscilante usando um tubo de falcão de 50 mililitros como adaptador e gire a 4.000 GS por seis a oito minutos. Centrifugue até aproximadamente 100 a 500 microlitros de solução.

Permaneça no filtro e descarte o fluxo. Em seguida, adicione mais três mililitros de água estéril ao tubo de falcão vazio. Transfira a solução para o tubo Amon e repita a etapa de centrifugação.

Lave o tubo de falcão uma terceira vez e reduza o volume final coletado no filtro para 50 a 100 microlitros. Você não precisa se preocupar em perder a amostra. O filtro retém 50 microlitros de líquido mesmo após centrifugação prolongada.

Transfira a solução de DNA restante do tubo AmCon para uma unidade de filtro centrífugo MicroCon YM 50 pré-lavada e enxágue o tubo Amon com mais 50 microlitros de água estéril para recuperar toda a centrífuga de DNA. A unidade de filtro centrífugo MicroCon YM 50 em uma microcentrífuga a 10.000 GS até que o filtro ainda esteja ligeiramente coberto com líquido. Verifique a cada minuto.

Se apenas uma pequena quantidade de líquido for deixada no filtro. Vire o filtro de cabeça para baixo e recupere sua solução de DNA por uma segunda etapa de centrifugação a 1000 GS por três minutos em um novo tubo de microcentrífuga. O volume resultante não deve exceder 10 a 15 microlitros no total.

Caso contrário, seu DNA pode estar muito diluído para a ligação. Verifique a concentração da solução de DNA resultante por NanoDrop ou Pico Green Assay. Recuperado e reparado.

O DNA agora está pronto para ser ligado ao vetor de clonagem PCC um FO SMID para o descongelamento de ligação de todos os reagentes no gelo. Em seguida, combinado na ordem listada aqui, misturando após cada adição. Primeiro, adicione água estéril para atingir um volume de reação de 10 microlitros.

Em seguida, 10 x tampão de ligação de ligação rápida, 10 milimolares A-T-P-P-C-C um vetor SMID e insira em uma proporção de 10 para um molar. E, finalmente, a ligação rápida do DNA Ligase. Centrifugue brevemente o tubo para levar todo o líquido para o fundo.

Toque no tubo e gire novamente. Incubar a reação de ligação à temperatura ambiente por duas horas e inativar a enzima por 10 minutos a 70 graus Celsius. Neste ponto, você pode armazenar a reação de ligação a menos 20 graus Celsius ou prosseguir para a etapa de empacotamento do fago.

O próximo passo é gerar fagos de bactérias que funcionarão para introduzir sua biblioteca FO SMID em e coli dois ou três dias antes de planejar a etapa de embalagem do fago, riscar a EPI 300 T fornecida uma cepa de revestimento resistente em uma placa LB simples e incubar durante a noite a 37 a graus Celsius para obter colônias únicas. Você pode selar esta placa e armazená-la a quatro graus Celsius para uso futuro. No dia anterior às reações de embalagem, inocule 50 mililitros de caldo Albee mais 10 milimolares de sulfato de magnésio com uma única colônia de sua placa Epi 300 Agite a 225 RPM e 37 graus Celsius durante a noite.

No dia das reações de embalagem, inocular caldo fresco de 50 mililitros LB mais 10 milimolares de sulfato de magnésio com cinco mililitros da cultura noturna. Cultura, a bactéria a 37 graus Celsius para um OD 600 de 0,8 a 1,0. Não exceda OD 600 de 1.0.

Dilua sua amostra antes de medir no espectrofotômetro para obter um resultado preciso. Armazene no gelo ou a quatro graus Celsius até que esteja pronto para prosseguir ou até 72 horas. Agora que as bactérias estão prontas para a infecção, é hora de preparar o descongelamento do fago.

As placas máximas que a Lambda Packaging extrai no gelo. Usando um tubo por reação de ligação, o descongelamento levará cerca de 10 a 15 minutos. Enquanto isso, pré-resfrie um tubo vazio de 1,5 mililitro no gelo novamente usando um tubo por reação.

Depois que os extratos da embalagem Lambda forem descongelados, transfira imediatamente para 25 microlitros de cada extrato da embalagem para o tubo de microfuge de 1,5 mililitro pré-resfriado e coloque no gelo. Retorne o extrato restante da embalagem a 80 graus Celsius negativos. Deixar os extratos de embalagem descongelados no gelo por muito tempo reduzirá a eficiência da infecção.

Em seguida, adicione 10 microlitros da reação de ligação a cada 25 microlitros dos extratos descongelados no gelo misturado pipetando a solução várias vezes sem introduzir bolhas de ar. Centrifugue brevemente para consolidar todo o líquido no fundo dos tubos e incube as reações de embalagem em banho-maria a 30 graus Celsius por 90 minutos. Após 80 minutos de incubação, descongele o extrato restante da embalagem no gelo.

Após a conclusão da reação de embalagem de 90 minutos, adicione os 25 microlitros restantes de extrato de embalagem a cada tubo de reação. Incube reações por mais 90 minutos a 30 graus Celsius. Após a segunda incubação, adicione 100 microlitros do tampão de diluição de fago preparado em cada tubo de embalagem e misture delicadamente e adicione cinco microlitros de clorofórmio a cada tubo.

Agora você deve ter um volume total de 165 microlitros no tubo. Um precipitado viscoso pode se formar após a edição do clorofórmio. Evite este precipitado, bem como a fase de clorofórmio orgânico ao pipetar as partículas de fago.

Neste ponto, você pode armazenar as partículas de fago embaladas a quatro graus por vários dias, se necessário, mas use o fago recém-preparado para obter melhores resultados. Agora você está pronto para infectar as células hospedeiras, que você tem crescido ao longo das etapas de empacotamento do fago com o fago empacotado. Adicionar fago empacotado a EPI 300 T uma célula hospedeira resistente OD 600,8 a 1,0 na proporção de 400 microlitros de epi 300 T uma célula resistente para cada 10 microlitros de partículas de fago.

Para evitar a pipetagem de qualquer clorofórmio do fundo do tubo do fago embalado, usamos 125 microlitros das partículas de fago embaladas e cinco mililitros de epi 300 T uma célula hospedeira resistente preparada misturada suavemente e depois incubamos a 37 graus Celsius por 30 minutos. O próximo passo é determinar o título do fago empacotado. Você faz isso colocando as bactérias infectadas no meio para selecionar as células infectadas.

Em seguida, contando as colônias resultantes e dividindo pelo volume de fago adicionado às bactérias que você plaqueou. O SMID C one contém um gene de resistência ao cloranfenicol. Portanto, para selecionar clones infectados, coloque as bactérias em placas de cloranfenicol contendo LB.

Espalhe duas vezes 50 microlitros e duas vezes 10 microlitros das células resistentes EPI 300 T infectadas por fagos em quatro placas separadas e coloque as placas de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 graus Celsius por 16 a 24 horas, não mais do que 48 horas até que as colônias se formem. Enquanto isso, colha as células resistentes residuais EPI 300 T one da infecção de cinco mililitros por centrifugação a 3.500 GS por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante.

Adicione um mililitro de LB com 20% de glicerol ao tubo resus. Suspenda o pellet celular e coloque 100 microlitros cada em tubos de frascos criogênicos de dois mililitros, congele imediatamente e armazene a 80 graus Celsius negativos. Para uso posterior na etapa de colheita de colônias no dia seguinte, conte o número de clones nas quatro placas na incubadora de 37 graus Celsius e determine o título do fago embalado, que você usa na próxima etapa.

O estoque de glicerol EPI 300 T resistente congelado contém células transduzidas com todos os diferentes plasmídeos em sua biblioteca. Em seguida, espalhe uma quantidade apropriada com base no título viral e no tamanho da placa de cada smid. Clone em 2 45 por 2 45 milímetros quadrados.

Placas de bioensaio de LB com cloranfenicol usando esferas de vidro. Adicione também uma pequena quantidade de caldo LB ao prato para espalhar suas células uniformemente. Lembre-se de que preparar o estoque de glicerol também concentra suas células cerca de cinco vezes.

Incube a 37 graus Celsius por 24 horas nos dias de colheita da colônia, prepare 96 ou 3 placas de 84 poços cheias de 200 microlitros ou 70 microlitros por poço de caldo LB. Suplementado com 12,5 microgramas de cloranfenicol por mililitro de caldo para seleção de antibióticos e 10% de glicerol para congelamento. Usamos o sistema automatizado de enchimento de três placas qfi para esta etapa.

O próximo passo é escolher colônias de suas placas LB CHLORANFENICOL preparadas em suas placas preparadas de 96 ou 3 84 poços para congelamento. Para esta etapa, estamos usando o robô de coleta de clones qix two, de acordo com o manual do usuário, para criar um ambiente estéril ao redor da área de coleta de clones. Ligue a luz UV por 30 minutos enquanto a luz UV estiver acesa.

Prepare 500 mililitros de alvejante a 1%, 500 mililitros de água deionizada estéril e 500 mililitros de etanol a 80%. Quando a luz ultravioleta se desligar, encha as bandejas conforme rotulado de trás para frente. Preencha com 1% de alvejante, depois com água deionizada em autoclave e 80% de etanol na bandeja frontal.

Certifique-se de que estão cheias, pois as agulhas de colheita não podem ser lavadas adequadamente sem solução de lavagem suficiente. Depois de configurar os parâmetros para uma colheita ideal, retire as tampas de suas placas bacterianas e suas placas de 96 ou 3 84 poços preenchidas com LB e posicione-as entre os postes nas palhetas Q. As placas da área de trabalho devem estar apertadas contra o canto direito frontal para que não possam se mover durante a colheita.

Em seguida, feche o painel frontal. Uma vez que todos os parâmetros são definidos, o procedimento de picking pode começar. Quando toda a colheita estiver concluída, enxágue as escovas e bandejas com água deionizada e coloque na bancada para secar.

Limpe quaisquer derramamentos que possam ter ocorrido e limpe o interior do CICS com etanol a 80%. Certifique-se de que todas as placas de estoque de glicerol estejam rotuladas e coloque-as na incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas para cultivar uma cultura de cada colônia colhida. Deixe uma nota na incubadora que contenha a data, número das placas incubadas, hora da incubação, hora da remoção e suas iniciais.

Após a incubação, você tem sua biblioteca. Cada poço contém uma cultura de um clone bacteriano contendo o PCC um fo smid ligado a um pedaço de DNA puro de sua amostra inicial. Congele as placas a 80 graus Celsius negativos para armazenamento de longo prazo e parabenize-se pelo trabalho bem feito.

O protocolo apresentado descreve o procedimento de como gerar uma biblioteca ambiental para capturar o conteúdo genético de uma comunidade microbiana em um determinado habitat. Esse protocolo deve criar uma biblioteca SMID, que seja representativa do conteúdo genético do ambiente amostrado, e deve permitir que o leitor otimize as etapas críticas. Se a quantidade de clones de fibra óptica obtidos no final de todo o procedimento for demasiado baixa.

Acabamos de mostrar como construir a biblioteca FO SMID a partir de DNA genômico derivado de uma amostra de água marinha. Ao fazer este procedimento, é importante começar com DNA genômico de alta qualidade. Tenha todas as suas placas e reagentes prontos antes de começar e planeje tempo suficiente para esse processo de várias etapas.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.