Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

Este procedimento começa com a fabricação de um microeletrodo em um substrato de silicone. Uma monocamada auto-montada de polietilenoglicol é formada sobre o microeletrodo e o substrato para evitar a incrustação dos microtúbulos. Em seguida, microtúbulos marcados com rumina são preparados.

Finalmente, os microtúbulos são padronizados nos eletrodos usando eletroforese. Olá, sou John Noel, do Nana Lab do Departamento de Física e do Laboratório de Biomecânica Molecular do Departamento de Engenharia Biomédica da Texas a and m University. Eu sou Wil livre Teza do departamento de física e diretor do Centro de Ciência e Tecnologia de Habilidades da Universidade do Texas.

E eu sou Juan Quang, diretor do Laboratório de Biomecânica Molecular do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Texas Aand M. Hoje mostraremos um procedimento para a fabricação de microeletrodos revestidos com uma monocamada automontada sem incrustação. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o empalidecimento de microtubos usando eletroforese.

Então vamos começar. Para começar, use um escriba ou cortador de wafer para cortar wafers de silício em pedaços de um centímetro por 1,5 centímetro para usar como substratos. Agora limpe os substratos colocando-os em um béquer com acetona suficiente para cobri-los e sonicar por cinco minutos sem deixar os substratos secarem.

Lave-os em acetona fresca e, em seguida, enxágue-os imediatamente novamente em isopropanol e use nitrogênio para secá-los. Usando fotolitografia de tom positivo padrão ou litografia por feixe de elétrons, fabrique os microeletrodos de ouro nos substratos limpos. Ao projetar a geometria do padrão, mantenha o diâmetro de cada padrão de eletrodo abaixo de 100 mícrons Para garantir a cobertura pela monocamada automontada de polietilenoglicol trimeth oxi seline ou pino Sam, inclua almofadas de contato posicionadas a 300 a 500 micrômetros do padrão com uma linha de um milímetro conectando a almofada com o eletrodo.

Após o desenvolvimento do padrão na camada de resistência, use uma pinça para riscar uma linha na resistência da almofada de contato até a borda do substrato. Após a deposição de metal, o arranhão permitirá o contato elétrico entre o eletrodo e a borda do substrato. Uma câmara de deposição, de preferência com duas fontes, é usada para depositar a camada de metal.

Os eletrodos são formados pela deposição de dois nanômetros de cromo, seguidos por seis nanômetros de ouro Sem quebrar o vácuo, uma microbalança de cristal de quartzo equipada dentro da câmara pode ser usada para medir a espessura dos filmes durante a deposição. Agora podemos começar a preparar a monocamada automontada em uma área bem ventilada, pré-aquecer e aquecer a 75 graus Celsius. Preparar a solução de ização adicionando um mililitro de pino de selina a 20 ml de tolueno num copo de vidro de 250 ml.

Misture bem pipetando para cima e para baixo cinco a 10 vezes e depois mexendo com a pipeta por 30 segundos. Coloque as amostras de padrão no copo com o lado do padrão para cima, certificando-se de que estejam completamente submersas na solução e espaçadas uniformemente na parte inferior do copo. Coloque o copo no forno e leve ao forno por 18 a 21 horas enquanto o Sam está se formando.

Prepare o contra-eletrodo depositando um nanômetro de cromo seguido de quatro nanômetros de ouro em uma lamínula de vidro de 22 por 50 milímetros. O contra-eletrodo deve ser quase transparente com uma tonalidade cinza claro ou rosa. Guarde o contra-eletrodo com o lado revestido para cima em uma placa de Petri para mantê-lo limpo.

Após 18 a 21 horas no forno, retire o copo do forno. O tolueno deve ter evaporado, deixando as amostras padrão em um resíduo viscoso. Adicione 20 mililitros de tolueno ao copo e deixe as amostras de molho por um a dois minutos.

Retirar as amostras do copo e lavá-las com tolueno, depois com isopropanol e, por fim, secá-las com azoto. Neste ponto, as amostras devem parecer limpas e a camada Sam deve ser invisível a olho nu. Sam's preparado desta forma são utilizáveis por até dois dias quando armazenados em condições frescas e secas.

A formação malsucedida de Sam resulta em um revestimento de resíduo turvo ou de tonalidade irregular na superfície. Com o Sams preparado, agora podemos começar a polimerização da tubulina em microtúbulos. Comece descongelando a tubulina não marcada e a tubulina de r domina e combine-as imediatamente em uma proporção de dois para um não rotulado para rotulado para obter microtúbulos brilhantes.

Misture-os bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, polimerize a tubulina por 20 a 40 minutos em banho-maria aquecido a 37 graus Celsius enquanto a tubulina está polimerizando. Prepare um tampão de Taxol de tubos misturando Taxol 20 micromolar com tampão de pipeta.

Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes e vórtice e, em seguida, coloque o tubo no banho aquecido a 37 graus Celsius. Após a polimerização, dilua os microtúbulos em tampão de pipeta quente de Taxol e proteja-os da luz. Verifique se a polimerização dos microtúbulos foi bem-sucedida e se os microtúbulos são estáveis sob vários minutos de excitação de fluorescência.

Obtendo imagens dos microtúbulos preparados com uma mistura de eliminação de oxigênio com polimerização da tubulina em microtúbulos completos. Vamos começar a padronizar o MTS com eletroforese. Para começar, corte um pedaço de fita dupla-face em tiras finas, colocando-o em uma lâmina de vidro e, usando uma lâmina de barbear para cortar, coloque duas tiras de fita dupla face na amostra revestida Sam padronizada, de modo que o eletrodo fique entre as tiras com o caminho de conexão perpendicular à fita.

Coloque o contra-eletrodo na fita dupla-face com o lado de metal tocando a fita de forma que a borda da amostra fique saliente sobre o contra-eletrodo em cerca de três milímetros. Corte vários comprimentos de 15 centímetros de fio magnético de cobre isolado e retire um centímetro do isolamento de ambas as extremidades. Use uma pequena gota de tinta prateada para prender um fio à área dourada exposta do substrato, tomando cuidado para evitar contato elétrico com o contra-eletrodo.

Agora use tinta prateada para prender um segundo fio ao balcão. Os fios do eletrodo presos com tinta prateada podem ser presos às amostras com fita adesiva. Em seguida, usando uma pipeta, introduza microtúbulos na imagem de diluição desejada com ampliação de 20 x e localize o padrão no wafer de silício antes de aplicar uma tensão.

Devido à profundidade da câmara de fluxo, podem ser necessárias objetivas de longa distância de trabalho para obter imagens da superfície superior da câmara de fluxo. A distância da superfície da amostra à superfície superior da câmara de fluxo é determinada pela espessura da fita e deve ser em torno de 60 a 100 micrômetros. Aplique uma tensão de até um volt e observe a migração dos microtúbulos.

Se for desejado o aprisionamento reversível dos microtúbulos. Use esmalte para vedar a câmara de fluxo para evitar desvio lateral e use tensões mais baixas até cerca de 0,5 volts. A migração pode ser rastreada ajustando o plano vertical de foco do microscópio com as tensões aplicadas em torno de 0,9 a 1,2 volts que os microtúbulos localizam nas superfícies dos eletrodos.

Uma tensão mais alta tornará a migração mais rápida e a adesão mais forte, mas a tensão excessiva induzirá a eletrólise e a despolimerização. Microtúbulos, acabamos de mostrar como preparar microeletrodos revestidos com Sam para padronização MT porque o revestimento SAM evita a absorção de micro tubários nos microeletrodos. Este procedimento também pode ser usado para padronização reversível de microtúbulos.

Além disso, esse processo não se limita apenas aos microtúbulos, mas também pode ser usado para padronizar biomoléculas em geral. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.