Name: Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-25T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a criar monocamadas auto-organizadas de polietilenoglicol em microeletrodos de ouro para prevenir biofouling e permitir o padrão de biomoléculas por eletroforese. Este método viabiliza aplicações em biossensores e dispositivos biomédicos.

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Reconhecemos Melissa Grunlan para discussões úteis sobre a formação de SAM. Esta pesquisa foi suportada em parte pela A. Robert Welch Foundation (A-1585).

Preparação de reagentes Prepare TUBOS tampão (80 mM PIPES, 1mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ajustado para pH 6,8 com KOH). Alíquotas e armazenar glicose oxidase, catalase e glicose a -70 ° C e taxol a -20 ° C de acordo com protocolos existentes. 1,2 alíquotas e tubulina armazenar a -70 ° C de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor. Microeletrodos padrão de Au utilizando litografia <ol><li> Corte em pastilhas de silício 1,5 1 cm &#39;substratos cm, utilizando um escriba ou cortador de bolacha. Limpe os substratos, colocando-os num copo com acetona o suficiente para cobri-los e sonicate por 5 minutos. Sem permitir que os substratos para secar, lave-os em acetona fresco, logo em seguida enxágüe em isopropanol e seco usando nitrogênio. </li><li> Au fabricar microeletrodos nos substratos limpos usando o padrão, fotolitografia tom positivo ou litografia por feixe de elétrons, dependendo do tamanho das características desejadas. 3 Ao projetar a geometria padrão, manter o diâmetro de cada padrão de eletrodo inferior a 100 microns para garantir a cobertura pela PEG SAM (descrito na próxima seção). Incluem suportes de contato (~ 300 mm 2) posicionados 300-500 mm do padrão com uma linha de 1 milímetro de conectar o teclado com o eletrodo (Fig. 1). Coloque os padrões litográficos perto do meio do substrato para permitir o espaço em torno do padrão para a montagem da câmara de fluxo. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Geometria da amostra. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. </li><li> Após o desenvolvimento do padrão na camada de resistir, um arranhão na linha de resistir a partir do bloco de contato para a borda do substrato usando uma pinça (Fig. 1). Após a deposição de metal, do zero vai permitir o contato elétrico entre o eletrodo ea borda do substrato. A câmara de deposição, de preferência com duas fontes, é utilizado para depositar a camada metálica. Os eletrodos são formados pela deposição de 2 nm de Cr (por adesão), seguido de 6 nm de Au, sem quebra de vácuo. A microbalança de cristal de quartzo equipado dentro da câmara pode ser usada para medir a espessura dos filmes durante a deposição. </li></ol> Preparar o SAM <ol><li> Pré-aqueça o forno e em uma área bem ventilada a 75 ° C. Preparar a solução de silanização, adicionando 20 mL de tolueno para um copo de vidro de 250 ml. Em seguida, adicione 1 mL PEG-silano (ou seja, 5% v / v) para o tolueno, utilizando uma pipeta de plástico. Misture o PEG-silano bem pipetando cima e para baixo 5 a 10 vezes e depois mexendo com a pipeta de 30 segundos. </li><li> Coloque as amostras padrão no recipiente com o lado virado para cima padrão, certificando-se que eles são completamente submersas na solução de PEG-silano tolueno e são espaçadas ao longo do fundo do copo. Colocar o copo no forno e asse 18-21 horas a 75 ° C. Enquanto o SAM está se formando, preparar o counterelectrode (veja abaixo) e montar os componentes adicionais necessários para as etapas restantes. </li><li> Após 18-21 horas no forno, o tolueno deve evaporar deixando as amostras padrão em um resíduo PEG-silano viscoso. Adicionar 20 mL de tolueno para o copo e mergulhar as amostras por 1-2 minutos. Remove as amostras do copo e enxaguar com tolueno, em seguida, isopropanol, e finalmente seco com nitrogênio. Neste ponto, as amostras devem olhar limpo ea camada de SAM deve ser invisível a olho nu. SAMs preparado desta maneira são utilizáveis ​​por até dois dias, quando armazenados em local seco (25 ° C, umidade moderada). Sem sucesso SAM resultados a formação de um revestimento de resíduo nublado ou irregular hued na superfície. </li></ol> Fabricar o counterelectrode Na mesma configuração de câmara de deposição utilizado para deposição de microeletrodos, faça uma counterelectrode depositando 1 nm de Cr, seguido por 4 nm de Au para um 22 x 50 mm N º 1 ou lamela de vidro n º 0. O counterelectrode deve ser quase transparente com um tom cinzento-claro ou rosa. Armazenar os counterelectrode revestido virado para cima em uma placa de Petri para mantê-lo limpo. Tubulina polimerizar em MTs <ol><li> Descongelar unlabeled tubulina e tubulina rodamina e imediatamente se combinam em uma proporção de 1:2 rotulados para unlabeled obter MTs brilhante. Mix pipetando cima e para baixo várias vezes. Polimerizar a tubulina para 20-40 minutos em um banho de água aquecida a 37 ° C. O comprimento do MTs será maior por mais tempo de polimerização. Enquanto a polimerização da tubulina é, prepare um tampão PIPES-taxol, adicionando taxol a 20 mM em um tubo de microcentrífuga contendo tampão PIPES. Misture o taxol bem pipetando cima e para baixo várias vezes e vórtex, e depois colocar o tubo no banho aquecida a 37 ° C. Após a polimerização, diluir a MTs por 1 / 100 em tampão PIPES-taxol quente e escudoda luz. MTs preparada desta forma alongada ao longo do tempo e pacote, que pode ser reduzido pela diluição. </li><li> Prepare uma mistura de oxigênio 10x de limpeza (OS) através da combinação de 30 mL tampão PIPES fria (0-4 ° C), 5 mL de 50% 2-mercaptoetanol, 5 mL de glicose oxidase, catalase 5 mL e 5 mL de glicose. 2 A glicose deve ser adicionado por último. Mix pipetando cima e para baixo 3-5 vezes após a adição de cada componente. Coloque a mistura OS no gelo, que permanecerá em vigor durante cerca de duas horas. </li><li> Verifique se a polimerização MT foi bem-sucedida e que o MTs são estáveis ​​sob vários minutos de excitação de fluorescência pela imagem da MTs preparado com 1x mix OS. Para geração de imagens a MTs preparado desta forma, não se esqueça de usar uma combinação de excitação / emissão de fluorescência filtro adequado para rodamina. Determinar a melhor diluição de trabalho para filamentos de imagens individuais por mais diluir a MTs por 1 / 10 a 1 / 100 com tampão PIPES e imagem com 1x mix OS. </li><li> Preparar uma câmara de fluxo, imprensando uma lamela de vidro de grandes dimensões (22 x 50 mm) e pequeno (22 x 22 mm) com dois pedaços de fita dupla-face colocada 2-3 mm. A fita é facilmente cortado em tiras, colocando-o sobre uma lâmina de vidro e corte com uma lâmina de barbear. Introduzir alguns microlitros de MTs na célula de fluxo, utilizando uma micropipeta. Para imagens de alta ampliação, os objectivos de longa distância de trabalho podem ser necessárias para geração de imagens da superfície superior da câmara de fluxo. A distância entre a superfície lamela / amostra até a superfície superior da câmara de fluxo é determinado pela espessura da fita e deve ser 60-100 mm. </li></ol> Padrão de MTs por eletroforese <ol><li> Prepare uma câmara de eletroforese, colocando duas tiras finas de fita dupla face em toda a amostra padrão, SAM-revestido de tal forma que o eletrodo está entre as tiras com o caminho de ligação perpendicular à fita (Fig. 2). Coloque o counterelectrode na fita dupla-face com o lado do metal tocar a fita de modo que a borda da amostra overhangs o counterelectrode por cerca de 3 mm (Fig. 2). Cortar vários comprimentos de 15 centímetros do fio de cobre isolados ímã e tira um centímetro do isolamento fora de ambas as extremidades. Anexar um fio para a área de Au exposta do substrato usando uma pequena gota de tinta prata tendo o cuidado de evitar fazer contato elétrico com o counterelectrode (isso pode ser verificado com um multímetro). Anexar um segundo fio à counterelectrode usando a pintura prata. Fios ligados com tinta de prata pode ser ainda mais segura para as amostras com fita. <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="figura 2" /> Figura 2. Montagem de células de fluxo para um microscópio invertido de fluorescência. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. </li><li> Introduzir MTs na diluição desejada usando tampão PIPES combinado com OS em 1x de concentração final. Imagem com ampliação de 20x e localize o modelo sobre o wafer de silício antes da aplicação de uma voltagem. Opcionalmente, a câmara de fluxo pode ser selada com unha polonês para impedir fluxo de fluido e migração MT no plano da câmara de fluxo. </li><li> Aplicar uma tensão de até 1 V e observar a migração das MTs. Tensões mais baixas (até cerca de 0,5 V) pode ser usado se prendendo reversível de MTs é desejado, porém isto requer selando a câmara de fluxo para evitar desvio lateral. Unha polonês funciona bem para selar as extremidades abertas da câmara de fluxo. Em tensões acima de cerca de 0,7 V, cerca de adesão MT pode ser visto sobre o padrão, embora seja fraco. Em tensões acima de cerca de 0,9 V, a migração MT será mais rápido, ea adesão será mais forte. Acima de cerca de 1,2 V a probabilidade de indução de eletrólise (formação de bolhas de gás) e também para destruir o microeletrodos aumenta significativamente. A migração pode ser rastreado, ajustando o plano vertical do foco do microscópio. Se realizado corretamente, o MTs vai localizar na superfície do eletrodo. </li></ol>

<ol><li>Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html</a> (2009).</li>
<li>Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Microlithography%2C+Micromachining%2C+and+Microfabrication%3A+Microlithography%22">Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography</a>. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A migração dos MTs é facilmente visualizado através de microscopia de fluorescência por causa de seu brilho e da fluorescência de fundo baixa. O método é geralmente aplicável a padronização biomolécula, uma vez que só exige que as biomoléculas ser induzido a levar uma carga líquida pelo ajuste adequado do pH. Eletroosmose é evitada nesta configuração, porque não há superfícies carregadas como as paredes de sílica usada em eletroforese capilar. Várias modificações deste método é possível. Ved...

No. 1 vidro borossilicato lamelas (22 X 50 mm) foram adquiridos da VWR. Polido de grade eletrônico do tipo p &lt;111&gt; wafers de silício foram adquiridos da Addison Engineering, Inc. alta pureza pintura prata foi obtida a partir Estrutura Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Duplas multa bitola imã cobre (~ 0,08 milímetros (0,003) de diâmetro) podem ser obtidos a partir de empresas de abastecimento eletrônicos.

antifouling monocamadas auto-organizadas em microeletrodos de biomoléculas patterning

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) (PEG) monocamada auto-montados trimetoxissilano (SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formado em uma etapa única montagem e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. A SAM é usada para microeletrodos casaco estampados com a norma, litografia tom positivo. Usando o microtúbulos como um exemplo, nós aplicamos uma tensão DC para induzir a migração eletroforética para o eletrodo revestido SAM de forma reversível. A câmara de fluxo é usado para geração de imagens a migração eletroforética e padronização de microtúbulos<em&gt; In situ</em&gt; Meio de microscopia de epifluorescência. Este método é geralmente aplicável a padronização biomolécula, como se emprega a eletroforese para imobilizar moléculas-alvo e, portanto, não requer específicas interações moleculares. Além disso, evita problemas encontrados ao tentar padrão as moléculas SAM diretamente usando técnicas litográficas. A compatibilidade com litografia por feixe de elétrons permite que este método seja usado para biomoléculas padrão em nanoescala.

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) monocamada auto-montados (PEG-SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formada em uma única etapa e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. Eletroforese é então utilizado para padronização biomoléculas até a nanoescala.

Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

Apresentamos um procedimento para a formação de uma monocamada autoassemblada (SAM) de trimetoxisilano de poli(etilenoglicol) (PEG) em um substrato de silício com ouro...

Este procedimento inicia-se pela fabricação de um microeletrodo sobre um substrato de silicone. Uma camada auto-organizada de polietilenoglicol é formada sobre o microeletrodo e o substrato para prevenir a aderência indesejada de microtúbulos. Em seguida, são preparados microtúbulos marcados com rumina.Por fim, microtúbulos são padronizados sobre os eletrodos tratados por eletroforese. Olá, sou John Noel do Laboratório Nana do Departamento de Física e do Laboratório de Biomecânica Molecular do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Texas A&M. Sou Wil free Teza do departamento de física e diretor do Centro de Ciência e Tecnologia Skill na Universidade Texas A&M.E eu sou Juan Quang, diretor do Laboratório de Biomecânica Molecular do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para fabricar microeletrodos revestidos com uma monocamada auto-organizada não aderente. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o paling de microtúbulos usando eletroforese.Então vamos começar. Para iniciar, use um riscador ou cortador de pastilhas para cortar pastilhas de silício em pedaços de um centímetro por 1,5 centímetro para usar como substratos. Agora limpe os substratos colocando-os em um béquer com acetona suficiente para cobri-los e sonique por cinco minutos, sem permitir que os substratos sequem.Lave-os com acetona fresca e, em seguida, lave-os imediatamente com isopropanol e utilize nitrogênio para secá-los. Utilizando litografia fotônica positiva padrão ou litografia por feixe de elétrons, fabrique os microeletrodos de ouro sobre os substratos limpos. Ao projetar a geometria do padrão, mantenha o diâmetro de cada padrão de eletrodo abaixo de 100 micrômetros. Para garantir a cobertura pela camada auto-organizada de trimetóxissilano de polietilenoglicol ou SAM de PEG, inclua pistas de contato posicionadas entre 300 e 500 micrômetros do padrão, com uma linha de um milímetro conectando a pista ao eletrodo.Após o desenvolvimento do padrão na camada de resistência, utilize pinças para riscar uma linha na resistência desde o contato metálico até a borda do substrato. Durante a deposição do metal, o risco permitirá o contato elétrico entre o eletrodo e a borda do substrato. Uma câmara de deposição, preferencialmente com duas fontes, é utilizada para depositar a camada metálica.Os eletrodos são formados pela deposição de dois nanômetros de cromo, seguida por seis nanômetros de ouro. Sem quebrar o vácuo, um microbalanço de cristal de quartzo equipado dentro da câmara pode ser usado para medir a espessura dos filmes durante a deposição. Agora podemos começar a preparar a monocamada auto-organizada em um local bem ventilado, pré-aquecendo um forno a 75 graus Celsius. Prepare a solução de silanização adicionando um mililitro de silano PEG a 20 mililitros de tolueno em um béquer de vidro de 250 mililitros.Misture bem pipetando para cima e para baixo de cinco a dez vezes e, em seguida, agite com a pipeta por 30 segundos. Coloque as amostras de padrão no béquer com o lado do padrão voltado para cima, certificando-se de que estejam completamente submersas na solução e uniformemente espaçadas no fundo do béquer. Coloque o béquer no forno e aqueça por 18 a 21 horas enquanto o Sam está se formando.Prepare o eletrodo de referência depositando um nanômetro de cromo seguido por quatro nanômetros de ouro sobre uma lamínula de vidro de 22 por 50 milímetros. O eletrodo de referência deve ser quase transparente, com uma tonalidade cinza clara ou rosa. Armazene o eletrodo de referência com o lado revestido voltado para cima em uma placa de Petri para mantê-lo limpo.Após 18 a 21 horas no forno, retire o béquer do forno. O tolueno deverá ter evaporado, deixando as amostras do padrão em um resíduo viscoso de peg cline. Adicione 20 mililitros de tolueno ao béquer e deixe as amostras em imersão por um a dois minutos.Retire as amostras do béquer e enxágue-as com tolueno, depois com isopropanol e, finalmente, seque-as com nitrogênio. Neste ponto, as amostras devem parecer limpas e a camada de Sam deve ser invisível a olho nu. As amostras preparadas desta forma podem ser utilizadas por até dois dias quando armazenadas em condições frescas e secas.A formação malsucedida de SAM resulta em um resíduo opaco ou com coloração irregular revestindo a superfície. Com os SAMs preparados, podemos agora iniciar a polimerização da tubulina em microtúbulos. Comece descongelando a tubulina não marcada e a tubulina marcada com r domine, e imediatamente combine-as numa proporção de dois para um, não marcada para marcada, para obter microtúbulos brilhantes.Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, polimerize a tubulina por 20 a 40 minutos em banho-maria aquecido a 37 graus Celsius enquanto a tubulina estiver polimerizando. Prepare um tampão pipes Taxol misturando Taxol 20 micromolar com tampão pipee.Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes e fazendo vortex, e em seguida coloque o tubo no banho aquecido a 37 graus Celsius. Após a polimerização, dilua os microtúbulos em tampão Taxol aquecido e proteja-os da luz. Verifique se a polimerização dos microtúbulos foi bem-sucedida e se os microtúbulos permanecem estáveis durante vários minutos de excitação por fluorescência.Imaginando os microtúbulos preparados com uma mistura eliminadora de oxigênio após a polimerização completa da tubulina em microtúbulos. Vamos iniciar a padronização do MTS por eletroforese. Para começar, corte um pedaço de fita dupla face em tiras finas colocando-a sobre uma lâmina de vidro e usando uma lâmina de barbear para cortar; posicione duas tiras de fita dupla face sobre a amostra revestida com Sam padronizada, de modo que o eletrodo fique entre as tiras, com o caminho de conexão perpendicular à fita.Coloque o eletrodo auxiliar sobre a fita adesiva dupla face com o lado metálico em contato com a fita, de modo que a borda da amostra ultrapasse o eletrodo auxiliar em cerca de três milímetros. Corte vários pedaços de fio esmaltado de cobre com 15 centímetros de comprimento e retire um centímetro do esmalte em ambas as extremidades. Use uma pequena gota de tinta de prata para fixar um fio na área de ouro exposta do substrato, tomando cuidado para evitar contato elétrico com o eletrodo auxiliar.Agora, use tinta de prata para fixar um segundo fio ao contra-eletrodo. Os fios dos eletrodos fixados com tinta de prata podem ser ainda mais seguros aos exemplos com fita adesiva. Em seguida, utilizando uma pipeta, introduza os microtúbulos na diluição desejada, visualize a imagem em 20 x de aumento e localize o padrão na pastilha de silício antes de aplicar uma tensão.Devido à profundidade da câmara de fluxo, podem ser necessários objetivos com longa distância de trabalho para imagens da superfície superior da câmara de fluxo. A distância entre a superfície da amostra e a superfície superior da câmara de fluxo é determinada pela espessura da fita e deve estar entre 60 e 100 micrômetros. Aplique uma tensão de até um volt e observe a migração dos microtúbulos.Se for desejado o aprisionamento reversível de microtúbulos, utilize esmalte de unha para selar a câmara de fluxo e evitar deriva lateral, e use voltagens mais baixas, até cerca de 0,5 volts. A migração pode ser monitorada ajustando o plano vertical de foco do microscópio com as voltagens aplicadas em torno de 0,9 a 1,2 volts, momento em que os microtúbulos se localizam nas superfícies dos eletrodos.Uma tensão mais alta tornará a migração mais rápida e a adesão mais forte, mas uma tensão excessiva induzirá eletrólise e despolimerização. Microtúbulos: acabamos de mostrar como preparar microeletrodos revestidos com SAM para o confinamento de MTs, porque o revestimento de SAM impede a absorção de microtúbulos nos microeletrodos. Este procedimento também pode ser utilizado para o confinamento reversível de microtúbulos.Além disso, este processo não se limita apenas aos microtúbulos, mas também pode ser utilizado para padronizar biomoléculas em geral. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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