Name: Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Aprenda um método de alta taxa de transferência para criopreservação de espermatozóides de zebrafish e fertilização in vitro. Este protocolo eficiente permite congelar amostras de 100 machos em menos de duas horas, mantendo viabilidade por mais de sete anos.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 HG002995 &quot;lavrar o Genoma Zebrafish: uma abordagem genética reversa&quot; a CBM.

Parte A: Soluções de congelamento de esperma 1. Peixe Ginsberg Ringers (Faça novo a cada 3 dias; Ginsburg, 1963) NOTA: ordem de adição é importante para evitar PRECIPITAÇÃO Em 450 ml estéril ddH2O dissolver: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Em seguida, acrescentar: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Trazer um volume final de 500 ml com ddH2O estéril e armazenar a 4 ° C. 2. Médio congelamento (Faça diária fresco) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> SEM Metanol <ul><li> Peixe Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). </li><li> Leite em pó desnatado 1,5 gm </li></ul></li><li> Com metanol NOTA: ordem de adição é importante para evitar PRECIPITAÇÃO <ul><li> Peixe Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). </li><li> 1 ml de metanol </li><li> Leite em pó desnatado 1,5 g </li></ul> Depois de montar media congelamento, misture bem por 20 min. em agitador orbital ou rocker. Antes de usar, alíquota em 1 ml tubos eppendorf, evitando bolhas de superfície. </li></ol> Parte B: Materiais necessários para o congelamento de esperma Materiais necessários para o congelamento de esperma <ol><li> 10 ml Pipetas descartáveis ​​(Fisherbrand # cat 22-358697) </li><li> Copos de 250ml de água de peixe contendo MESAB / tricaina </li><li> vidros de relógio (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (ou equivalente) e dicas </li><li> Esponja titular de peixe (para segurar enquanto aperta masculino) </li><li> Dissecando microscópio com iluminação de palco acima </li><li> Forceps plana (por exemplo, tipo Millipore) </li><li> 2,0 ml frascos criogênicos (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene gato # 03-337-7AA) </li><li> Isopor recipiente com ~ 15 cm de finamente trituradas ICE1 seca </li><li> 15 ml cônico tubos (Falcon # 352099) </li><li> Dewar frasco contendo nitrogênio líquido </li><li> Pinças longas (por exemplo, CMS Fisher gato Cuidados de Saúde n º 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Tanque de recuperação para os homens </li><li> Um tubo eppendorf cheia de mídia congelamento sem metanol </li><li> Um tubo eppendorf preenchido com media de congelamento com metanol </li><li> Cryofreezer (eg Taylor-Warton K-series) </li></ol> 1 Um método simples para fazer finamente trituradas gelo seco é envolvê-la em uma toalha e pulverizá-la com um martelo. Um método mais eficiente é usar um moedor de gelo seco, por exemplo, modelo Clawson RE-2. Parte C: método de congelamento de esperma <ol><li> MARK TUBOS CAPILARES: Antes de começar, marque a tubos capilares 10μl com uma caneta de laboratório ao nível de 3,33 mL (ou seja, 16,7 milímetros de baixo, ver Fig. 1.1.). </li><li> Anestesiar MASCULINO: masculino Place (s) no copo contendo MESAB / tricaina diluído em água de peixe (receita em &quot;O Livro dos Zebrafish&quot;) </li><li> PEIXE SECO: Uma vez anestesiados, levante peixe fora de anestésico usando uma colher de plástico e suavemente blot peixe seco numa toalha de papel, com especial atenção para a secagem do lado ventral. Água ativa de esperma por isso é importante para secar completamente em torno da cloaca. Peixes posição no suporte de esponja, acima do lado ventral (Fig. 1.2). Se região em torno de barbatana anal é ainda úmida, secar delicadamente com uma kimwipe. Tome cuidado para não apertar o esperma prematuramente! </li><li> Lugar marcado tubo capilar em borracha adaptador pipeta boca que está incluído com tubos capilares. O adaptador é uma mangueira de borracha que tem um bocal em uma extremidade e um suporte capilar, de outro. Alternativamente, o tubo capilar pode ser conectado a uma seringa Hamilton 50μl através de um pequeno pedaço de tubo de tygon do diâmetro apropriado. </li><li> Masculino lugar no âmbito e expor a abertura urogenital, cuidadosamente espalhar as barbatanas pélvicas além usando a extremidade do tubo capilar. </li><li> Coletar esperma: esperma por expulsar gentilmente acariciando os lados do peixe com uma pinça suave (por exemplo, Millipore), ou apertando suavemente os lados do peixe entre o dedo indicador eo polegar. Coletar o esperma em tubo capilar, uma vez que é expelido através de sucção suave (Fig. 1.2). Evite fezes que pode ser expulso com o esperma. </li><li> Normalizar o volume esperma para 3,3 mL: Se o volume de esperma atinge ou ultrapassa marca de caneta no tubo capilar (ou seja, 16,7 milímetros ou mais), então vá para a etapa 8. Se o volume do esperma não atingir o volume alvo, então normalizar o volume para marcar caneta usando Médio congelar sem metanol (Fig. 1.3). Quantidade mínima de esperma que é aceitável varia com a qualidade do esperma. Esperma bom é branco e opaco. Escassa de esperma parece aguado. Em geral, aceitamos como mínimos: 1 mL de esperma bom (ou 1 / 3 da meta) e 2 mL de esperma pobres (ou dois terços da meta). Volume agora é normalizada para 3,3 mL. </li><li> ADD crioprotetor ao esperma: Suck up Medium congelação com Metanol para a marca laranja (aprox. volume total é agora 20 l;. Fig 1.4). Expulsar mistura de esperma e crioprotetor em área limpa de um vidro de relógio, com especial atenção para não introduzir bolhas. Misture suavemente pipetando cima e para baixo ~ 4 vezes (evitar a introdução de bolhas). </li><li> LOCAL DE ESPERMA 10μl em cada um dos dois criotubos: Pipetar 10 mL do esperma: solução crioprotetor no fundo de duas criotubos separados que têm sido rotuladas com a informação relevante (Fig. 1.5). Movendo-se rapidamente, frascos de tampa e coloque-os na parte inferior da temperatura ambiente de 15 ml tubos Falcon e um cryovial / tubo. Tampa do tubo Falcon e insira o par de tubos cryovial contendo Falcon em gelo seco esmagado. </li><li> FREEZE ESPERMA DE 20 MIN. Em gelo seco: O gelo seco deve ser em forma de pó fino, não pellets. Os tubos devem ser inseridos no gelo seco profundo o suficiente para que apenas seus limites show (Fig. 1.6). , A fim de manter o controle de tubos em gelo seco, dê a cada par de tubos Falcon um número 1-20 (escrito nas tampas) e registrar o tempo eles vão para o gelo seco. </li><li> Criotubos PLACE em nitrogênio líquido:. Após o esperma foi congelado em gelo seco por 20 min, transferi-los para um contendo nitrogênio líquido frasco de Dewar. O esperma é armazenado aqui até a hora de colocar em freezer de nitrogênio líquido. Ao colocar nas caixas de freezer, caixa de freezer lugar em um banho de nitrogênio líquido para que as amostras não aquecer. Use pinças de metal compridas para recuperar frascos de frasco dewar e lidar com cryogloves. Alternativamente, criotubos podem ser transferidos diretamente de gelo seco na caixa se a caixa de freezer freezer é mantida imersa em nitrogênio líquido em um recipiente de isopor. </li><li> Criotubos armazenar a longo prazo em um freezer criogênico de nitrogênio líquido. Para manter a viabilidade de espermatozóides, é importante que os frascos são armazenados imersos em nitrogênio líquido. Em nossa experiência, os frascos armazenados na fase vapor perdem viabilidade ao longo do tempo. A velocidade é importante! O tempo entre a adição do crioprotetor e colocando frascos de esperma em gelo seco (ou seja, as etapas 6-10) deve ser superior a 30 seg. </li></ol> Parte D: Método Fertilização In Vitro Utilizando Espermatozóides criopreservados Nós achamos que isso funciona melhor com duas pessoas. Uma pessoa aperta os ovos de fêmeas, enquanto que a outra pessoa derrete o esperma. <ol><li> Definir um banho de água a 33 ° C. </li><li> Retire do freezer cryovial nitrogênio líquido e transferência para nitrogênio líquido contendo frasco dewar até estar pronto para descongelar. </li><li> Squeeze ovos de fêmeas em 35 milímetros placa de Petri de plástico. Se possível, tente obter três garras de ovos e combinam em um prato. Se você não pode obter três garras bem dentro de 1 min de sua primeira embreagem, então vá para a etapa 4 (uma embreagem boa é suficiente). Definição de embreagem boa:&gt; 150 ovos uniformemente bom olhar (amarelada ou seja, sem detritos branco indicativo de degradação). Mantenha prato coberto, enquanto o esperma é descongelado. </li><li> Remover o frasco de nitrogênio líquido e retire a tampa. Frasco rapidamente mergulhe ~ 1 / 2 caminho em 33 ° C banho de água por 8-10 seg. </li><li> Adicionar rapidamente 70 mL à temperatura ambiente Hanks para o frasco e misture pipetando para cima e para baixo. Imediatamente adicionar aos ovos e misture delicadamente com a ponta da pipeta. </li><li> Sem demora, ative o esperma e os ovos, adicionando 750 mL de água de peixe. Agite para misturar. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Após 5 min, preencha prato com água de peixe e prato de incubar a 28 ° C. Depois de 2-3 horas, contagem e transferência de embriões fértil para pratos de 100mm (50/dish). Contagem de ovos inférteis, para que a fertilização de freqüência pode ser determinada. </li><li> Cuide bem das larvas! Para os primeiros 5 dias, mudar a água diariamente e eliminar os embriões mortos. Coloque apenas larvas que têm bexigas natatórias em berçário no dia 5. </li></ol> E parte: Resultados Representante Nós usamos esta metodologia crypreservation para fazer uma biblioteca de 8.600 amostras de esperma congelado para lavrar entre os anos de 2001 e 2003. Temos descongelados 106 dessas amostras e determinada a sua fertilidade. Fertilidade é a relação de embriões viáveis ​​produzidos em uma fertilização in vitro no dividido pelo número total de ovos que foram fertilizados com o esperma congelado. Frescos (não cryporeserved) esperma normalmente tem&gt; de fertilidade de 95%; espermatozóides criopreservados tem de fertilidade muito menor: uma média de 29% (n = 106 frascos). A variabilidade de frasco para frasco de fertilidade é grande, variando de menos de 1% para tão alto quanto 62%. Esta variabilidade é representada pelas barras de erro representam grande desvio padrão na Figura. 2. No entanto, em 106 amostras de esperma descongelado até à data temos apenas uma vez experimentado 0% de fertilidade tanto em amostras de esperma e não conseguiu recuperar a mutação Tilling correspondente. Pelo descongelamento frascos de esperma da nossa biblioteca ao longo de vários anos (2001-2008), descobrimos que a fertilidade média de amostras de esperma congelado por este método permaneceestável ao longo do tempo (Fig. 2). A fecundidade média das amostras de esperma congelado descongeladas em 2001 foi de 23,5% (com base em 11 amostras de esperma) e em 2008 foi de 25% (com base em 21 amostras de esperma). Uma série de outros pesquisadores agora estão usando esse protocolo de congelamento de esperma em seus laboratórios. Alguns relataram um bom sucesso com as taxas de fertilidade e amostra-to-sample variabilidade semelhante ao que temos observado. Outros têm supostamente não conseguiu fazer este protocolo de trabalho em suas mãos. Acreditamos que as fontes prováveis ​​de problemas são: <ol><li> A não utilização da criotubos exata ou tubos cônicos que sugerimos no protocolo, levando a uma taxa diferente de refrigeração quando em gelo seco; </li><li> A não utilização de gelo seco em pó, levando a uma taxa de resfriamento sub-ótima; </li><li> Usando peixes machos com baixa fertilidade: você deve conseguir pelo menos 1 ml de esperma de um único macho. Você também pode testar a fertilidade masculina, ao fazer uma fertilização in vitro com esperma fresco, no entanto isso pode ser enganador, porque leva muito pouco esperma fresco para chegar perto de 100% de fertilidade. </li><li> Usando óvulos sub-padrão de qualidade na fertilização in vitro. Usando nada além de embreagens perfeito sempre leva para perto de 0% a fertilidade, mesmo a partir de amostras de esperma que realmente têm boa fertilidade (com base na fertilidade do frasco duplicado). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemática da metodologia de congelamento de esperma. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fertilidade de espermatozóides criopreservados permanece estável ao longo do tempo. Fertilidade por cento é o número de embriões viáveis ​​produzidos em uma fertilização in vitro, dividido pelo número total de ovos que foram fertilizados com o esperma congelado. &quot;N&quot; refere-se ao número de frascos de esperma criopreservados cuja fertilidade foi testado no ano correspondente. Barras de erro representam o desvio padrão. Uma vez que cada frasco de esperma de um macho é diferente, frasco-ampola para a variabilidade é observada.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Uma série de outros pesquisadores agora estão usando esse protocolo de congelamento de esperma em seus laboratórios. Alguns têm relatado a fertilidade semelhantes ea variabilidade de amostra para amostra mesmo que temos observado. Outros têm supostamente não conseguiu fazer este protocolo de trabalho em suas mãos. Acreditamos que as fontes prováveis ​​de problemas são: <ol><li> A não utilização da criotubos exata ou tubos cônicos que sugerimos no protocolo, levando a uma taxa diferente de refrigeração quando em gelo seco; </li><li> A não utilização de gelo seco em pó, levando a uma taxa de resfriamento sub-ótima; </li><li> Usando peixes machos com baixa fertilidade: você deve conseguir pelo menos 1 ml de esperma de um único macho. Você também pode testar a fertilidade masculina, ao fazer uma fertilização in vitro com esperma fresco, no entanto isso pode ser enganador, porque leva muito pouco esperma fresco para chegar perto de 100% de fertilidade. Maiores, machos de cor mais enérgica normalmente dão espermatozóides de qualidade mais elevada. </li><li> Usando óvulos sub-padrão de qualidade na fertilização in vitro. Usando nada além de embreagens perfeito sempre leva para perto de 0% a fertilidade, mesmo a partir de amostras de esperma que realmente têm boa fertilidade (com base na fertilidade do frasco duplicado). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l pipetas descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Placas de relógio</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>Frascos criogênicos de 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Caixas criogênicas de 10 x 10</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Criofreezer</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Por exemplo</td></tr></tbody></table>

um método de alta taxa de transferência para zebrafish criopreservação de espermatozóides e in vitro fertilização

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Este é um método de criopreservação de esperma zebrafish que é uma adaptação do método de Harvey (Harvey et al., 1982). Temos introduziu duas alterações ao protocolo original que tanto racionalizar o processo e uniformidade da amostra aumenta. Primeiro, vamos normalizar todos os volumes de espermatozóides usando a mídia de congelamento que não contém o crioprotetor. Esperma, segundo criopreservados são armazenados em criotubos, em vez de tubos capilares. As taxas de esperma congelamento e descongelamento (δ ° Tempo / C) são provavelmente as duas variáveis ​​mais críticas para o controle deste procedimento. Por esta razão, não substituem os tubos diferentes das especificadas. Trabalhando em equipes de dois, é possível congelar o esperma de 100 homens por equipe, em ~ 2 hrs. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% (medida pelo número de embriões viáveis ​​gerada em uma fertilização in vitro, dividido pelo número total de ovos fertilizados) e esta fertilidade por cento é estável durante muitos anos.

Este é um high-throughput protocolo de criopreservação de esperma para zebrafish. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% na fertilização in vitro subseqüentes e é estável durante muitos anos.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

Este é um método para a criopreservação de esperma de peixe-zebra que consiste em uma adaptação do método de Harvey (Harvey et al., 1982). Introduzimos duas alterações para...

Olá, sou Bruce Draper da Universidade da Califórnia, Davis, Departamento de Biologia Molecular e Celular, e sou Cecilia Moans da Divisão de Ciências Básicas do Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson, em Seattle. Hoje, Cecilia e eu vamos demonstrar o protocolo de criopreservação de esperma de peixe-zebra, que é uma modificação do protocolo original de Brian Harvey. Vamos mostrar a vocês que, trabalhando em equipes de duas pessoas, é possível criopreservar esperma de 100 machos individuais em menos de duas horas.Embora haja uma ampla variação na fertilidade após o descongelamento, em média, obtemos 25% de fertilidade, e isso provém de uma biblioteca que foi criopreservada por mais de sete anos. Então, vamos começar. Antes de realizar este procedimento, primeiramente, prepare as soluções de congelamento de espermatozoides.A solução de Ringer para peixes Ginsburg é preparada fresca a cada três dias, e o meio de congelamento é preparado fresco diariamente, com e sem metanol. A composição dessas soluções pode ser encontrada nas informações suplementares online que acompanham este protocolo. Os materiais utilizados neste procedimento podem afetar a taxa de congelamento e descongelamento, o que por sua vez pode afetar a fertilidade do esperma congelado.Por esse motivo, uma lista de materiais recomendados também é fornecida como informação suplementar on-line. É preferível congelar o esperma em gelo seco finamente triturado, em vez de pelotas de gelo seco. Uma maneira simples de triturar o gelo seco é envolvê-lo em uma toalha e pulverizá-lo com um martelo.Um método mais eficiente é usar um moedor de gelo seco, como o modelo RE com garras, para congelar o esperma de peixe-zebra. Primeiro, marque tubos capilares de 10 microlitros com uma caneta de laboratório no nível de 3,33 microlitros ou cerca de 16,7 milímetros a partir da base. Para anestesiar os machos, coloque dois a quatro machos em um béquer contendo água para peixes com trica diluída. A receita pode ser encontrada no livro do peixe-zebra.Uma vez anestesiado, levante o peixe do anestésico usando uma colher de plástico e seque-o suavemente em uma toalha de papel. Preste especial atenção em secar o lado ventral. A água ativa os espermatozoides, portanto é fundamental secar completamente ao redor do ika.Posicione o peixe no suporte de esponja com o lado ventral voltado para cima. Se a região ao redor das nadadeiras pélvicas ainda estiver úmida, seque-a suavemente com um lenço de papel Kim. Coloque o tubo capilar marcado em um adaptador de pipeta de borracha que acompanha os tubos capilares.O adaptador é uma mangueira de borracha que possui um bocal em uma extremidade e um suporte para capilar na outra. Alternativamente, o tubo capilar pode ser conectado a uma seringa Hamilton de 50 microlitros. Usando um pequeno pedaço de tubo de tigon com o diâmetro apropriado, coloque o macho sob o microscópio e exponha a abertura urogenital separando cuidadosamente as nadadeiras pélvicas.Usando a extremidade do tubo capilar, expulse o esperma massageando suavemente os lados do peixe com pin&ccedil;as lisas ou apertando levemente os lados do peixe com o indicador e o polegar; colete o esperma em um tubo capilar &agrave; medida que for expelido, utilizando suc&ccedil;&atilde;o suave. Evite fezes que possam ser expelidas junto com o esperma. O volume alvo de esperma &eacute; de 3,3 microlitros.A quantidade mínima de esperma aceitável varia conforme a qualidade do esperma. O esperma bom é branco e opaco, enquanto o esperma ruim tem aparência aquosa. De modo geral, a quantidade mínima aceitável de esperma é um microlitro de esperma bom ou um terço do alvo, e dois microlitros de esperma ruim ou dois terços do alvo.Se o volume de esperma não atingir o volume-alvo de 3,3 microlitros, é necessário normalizar o volume até a marca da caneta usando meio de congelação sem metanol. Se o volume de esperma já atingir ou ultrapassar a marca da caneta no tubo capilar, prossiga para a próxima etapa. Agora, adicione o crioprotetor ao esperma.Aspire o meio congelante com metanol até a marca laranja. O volume total aproximado agora é de 20 microlitros. Expulse suavemente a mistura de espermatozoides e crioprotetor em uma área limpa de uma lâmina de relógio, misturando delicadamente por pipetagem para cima e para baixo cerca de quatro vezes, evitando introduzir bolhas.Aliquotar o esperma em dois tubos criogênicos pipetando 10 microlitros da solução crioprotetora de esperma no fundo de cada tubo identificado. Tampe rapidamente os tubos e coloque cada tubo criogênico em um tubo Falcon separado de 15 mililitros. À temperatura ambiente, tampe os tubos Falcon e insira-os em gelo seco finamente pulverizado.Os tubos devem ser inseridos profundamente o suficiente para que apenas as tampas fiquem visíveis, a fim de facilitar o acompanhamento dos tubos de falcão. Numere-os e registre o horário em que cada tubo é colocado no gelo seco. Deixe o esperma congelar no gelo seco por 20 minutos.Após o congelamento do esperma, transfira os dois frascos de criopreservação para um frasco dewar contendo nitrogênio líquido, para armazenamento temporário. Coloque a caixa de congelamento em um banho de nitrogênio líquido para que as amostras não aqueçam.Use pin&ccedil;as met&aacute;licas longas para recuperar os frascos do frasco doer e manuseie-os com luvas criog&ecirc;nicas. Alternativamente, os frascos criog&ecirc;nicos podem ser transferidos diretamente do gelo seco para o congelador. Se a caixa do congelador for mantida imersa em nitrog&ecirc;nio l&iacute;quido em um recipiente de isopor para armazenamento de longo prazo, coloque os frascos criog&ecirc;nicos em um congelador criog&ecirc;nico de nitrog&ecirc;nio l&iacute;quido.Para manter a viabilidade dos espermatozoides, é fundamental que os frascos sejam armazenados imersos em nitrogênio líquido; frascos armazenados na fase de vapor podem perder viabilidade ao longo do tempo. A velocidade também é essencial para manter a viabilidade espermática. O tempo entre a adição do crioprotetor e a colocação dos frascos de espermatozoides no gelo seco não deve ultrapassar 30 segundos fertilização in vitro.O uso de espermatozoides criopreservados funciona melhor com duas pessoas. Uma pessoa extrai os óvulos das fêmeas enquanto a outra descongela o esperma. Aqueça um banho-maria a 33 graus Celsius.Retire um tubo criogênico do freezer de nitrogênio líquido e transfira-o para um frasco D ou recipiente contendo nitrogênio líquido até o momento do descongelamento. Esprema os ovos de fêmeas anestesiadas em uma placa de Petri plástica de 35 milímetros. Isso é descrito em detalhes no protocolo JoVE intitulado Produção de peixes-zebra gino-genéticos por pressão precoce, que fornece uma descrição detalhada do peixe-zebra.A fecundação in vitro, um bom conjunto contém mais de 150 ovos que são uniformes e amarelados. Qualquer resíduo branco indica degradação. Se possível, tente obter três conjuntos de ovos e combine-os em um único recipiente.Se três boas posturas não forem obtidas dentro de um minuto após a primeira postura, prossiga para o próximo passo. Mantenha a placa coberta enquanto o esperma é descongelado. Enquanto isso, retire o frasco do nitrogênio líquido e remova a tampa.Mergulhe rapidamente o tubo até a metade em um banho-maria de 33 graus por oito a 10 segundos. Adicione rapidamente 70 microlitros de solução salina tamponada de Hank à temperatura ambiente ao tubo e misture pipetando para cima e para baixo; imediatamente, adicione aos ovos na placa de Petri e misture suavemente com a ponta da pipeta. Em seguida, ative imediatamente os espermatozoides e ovos adicionando 750 microlitros de água para peixes, gire para misturar e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.Após cinco minutos, encha o recipiente com peixes, água e incube a 28 graus Celsius. Após duas a três horas, conte e transfira os embriões viáveis para placas de 100 milímetros, com 50 embriões por placa. Conte também os ovos fertilizados para que a fertilidade da amostra de esperma possa ser determinada.A fertilidade dos espermatozoides é a razão entre embriões viáveis e o número total de ovos utilizados para a fertilização in vitro. Os ovos podem ser classificados a qualquer momento entre duas e seis horas após a fertilização in vitro. Quando os ovos inférteis são facilmente diferenciados dos embriões viáveis, os ovos inférteis são claros e não divididos.Quando observado com iluminação transmitida em um microscópio estereoscópico, a fertilidade média do esperma criopreservado varia amplamente. No entanto, deve ser possível obter uma fertilidade média de 25%, estável por vários anos. Este gráfico mostra a porcentagem média de fertilidade do esperma congelado entre 2001 e 2003 e analisado tão recentemente quanto em 2008.Acabamos de demonstrar um método de alto rendimento para criopreservação de espermatozoides de peixe. Ao realizar este protocolo, é importante utilizar todos os equipamentos e utensílios plásticos recomendados, bem como gelo seco moído pulverizado em vez de pelotas de gelo seco. É fundamental utilizar espermatozoides e óvulos de qualidade muito alta, e no caso dos óvulos, ao realizar a fertilização in vitro, logo após a ativação do espermatozoide, é importante utilizar o maior número possível de óvulos para aumentar o número de embriões férteis obtidos ao final, o que pode exigir três a quatro fêmeas, correto?Outro componente fundamental do protocolo é a velocidade. Nunca deve levar mais do que cerca de um minuto desde a expressão do esperma do macho até colocá-lo no gelo seco. Bem, acho que é isso.Boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Este protocolo descreve um método de microscopia de luz de baixo custo para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra, permitindo a avaliação reprodutível da cardiotoxicidade do desenvolvimento sem a necessidade de sistemas avançados de imagem.

Imagem cardíaca funcional em embriões de peixe-zebra usando microscopia padrão e análise de vídeo: aplicações em pesquisa ambiental e biomédica

Aprenda um método de alta taxa de transferência para criopreservação de espermatozóides de zebrafish e fertilização in vitro. Este protocolo eficiente permite congelar amostras de 100 machos em menos de duas horas, mantendo viabilidade por mais de sete anos.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

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