Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

Olá, sou Bruce Draper, da Universidade da Califórnia Davis, departamento de Biologia Molecular e Celular, e sou Cecilia Moans, da Divisão de Ciências Básicas do Centro de Pesquisa do Câncer Fred Hutchinson, em Seattle. Hoje, Cecilia e eu vamos demonstrar o protocolo de preservação do choro de esperma do peixe-zebra, que é uma modificação do protocolo original de Brian Harvey. Mostraremos que, trabalhando em equipes de dois, é possível criopreservar espermatozoides de 100 machos individuais em menos de duas horas.

Embora haja uma ampla gama de fertilidade após o descongelamento, em média, recebemos 25% de fertilidade, e isso é de uma biblioteca que foi criopreservada por mais de sete anos. Então vamos começar. Antes de realizar este procedimento, primeiro faça as soluções de congelamento de esperma.

A solução de ringer Ginsburg Fish é feita fresca a cada três dias, e o meio de congelamento é feito fresco diariamente com e sem metanol. A composição dessas soluções pode ser encontrada nas informações suplementares on-line que acompanham este protocolo. Os materiais usados neste procedimento podem afetar a taxa de congelamento e descongelamento, o que, por sua vez, pode afetar a fertilidade do esperma congelado.

Por esse motivo, uma lista de materiais recomendados também é fornecida como informações on-line suplementares. É melhor congelar o esperma em gelo seco finamente triturado, em vez de pastilhas de gelo seco. Uma maneira simples de triturar gelo seco é envolvê-lo em uma toalha e pulverizá-lo com um martelo.

Um método mais eficiente é usar um moedor de gelo seco, como garras e modelo RE dois, para congelar o esperma do peixe-zebra. Primeiro marque tubos capilares de 10 microlitros com uma caneta de laboratório no nível de 3,33 microlitros ou cerca de 16,7 milímetros do fundo para anestesiar os machos, coloque de dois a quatro machos em um béquer contendo trica diluída e água de peixe. A receita pode ser encontrada no livro do peixe-zebra.

Uma vez anestesiado, retire o peixe do anestésico usando uma colher de plástico e seque-o suavemente em uma toalha de papel. Preste atenção especial ao desenho do lado ventral. A água ativa o esperma, por isso é fundamental secar completamente ao redor do ika.

Posicione o peixe no suporte da esponja com o lado ventral para cima. Se a região ao redor das barbatanas pélvicas ainda estiver úmida, seque-a suavemente com um lenço umedecido. Coloque o tubo capilar marcado em um adaptador de pipeta de boca de borracha incluído com os tubos capilares.

O adaptador é uma mangueira de borracha que possui um bocal em uma extremidade e um suporte capilar na outra. Alternativamente, o tubo capilar pode ser conectado a uma seringa Hamilton de 50 microlitros. Usando um pequeno pedaço de tubo tigon de diâmetro apropriado, coloque o macho sob a luneta e exponha a abertura urogenital afastando cuidadosamente as barbatanas pélvicas.

Usando a extremidade do tubo capilar, extraia o esperma acariciando suavemente as laterais do peixe com uma pinça lisa ou apertando suavemente as laterais do peixe com o dedo indicador e o polegar, colete o esperma em um tubo capilar à medida que é expelido com sucção suave. Evite fezes que possam ser expelidas com o esperma. O volume alvo de esperma é de 3,3 microlitros.

A quantidade mínima de espermatozóides aceitável varia de acordo com a qualidade do esperma. O esperma bom é branco e opaco, enquanto o esperma dos poros parece aquoso. Em geral, a quantidade mínima aceitável de espermatozóides é de um microlitro de espermatozóides bons ou um terço do alvo e dois microlitros de espermatozóides porosos ou dois terços do alvo.

Se o volume de espermatozóides não atingir o volume alvo de 3,3 microlitros, é necessário normalizar o volume para a marca da caneta usando meio de congelamento sem metanol. Se o volume de espermatozóides já atingir ou exceder a marca da caneta no tubo capilar, prossiga para a próxima etapa. Agora adicione o crioprotetor ao esperma.

Sugue o meio de congelamento com metanol até a marca laranja. O volume total aproximado agora é de 20 microlitros. Expulse a mistura de esperma e crioprotetor para uma área limpa de um vidro de relógio suavemente misturado pipetando para cima e para baixo cerca de quatro vezes e evite a introdução de bolhas.

Aliquote o esperma em dois frascos criogênicos pipetando 10 microlitros da solução crioprotetora de esperma no fundo de cada frasco rotulado. Movendo-se rapidamente, tampe os frascos e coloque cada frasco criogênico em um tubo de falcão separado de 15 mililitros. À temperatura ambiente, tampe os tubos de falcão e insira-os em gelo seco em pó fino.

Os tubos devem ser inseridos com profundidade suficiente para que apenas as tampas apareçam para acompanhar os tubos de falcão. Numere-os e registre o tempo que cada tubo entra no gelo seco. Deixe o esperma congelar no gelo seco por 20 minutos.

Depois que o esperma for congelado, transfira os dois frascos criogênicos para um frasco de azoto líquido contendo o frasco de alimentação. Para armazenamento temporário. Coloque a caixa do freezer em um banho de nitrogênio líquido para que as amostras não aqueçam.

Use pinças de metal longas para recuperar os frascos do frasco do fazedor e manuseie-os com luvas criogênicas. Alternativamente, os frascos criogênicos podem ser transferidos diretamente do gelo seco para o freezer. Se a caixa do freezer for mantida imersa em nitrogênio líquido em um recipiente de isopor para armazenamento de longo prazo, coloque os frascos criogênicos em um freezer de nitrogênio líquido criogênico.

Para manter a viabilidade do esperma, é crucial que os frascos sejam armazenados imersos em frascos de nitrogênio líquido armazenados na fase de vapor podem perder a viabilidade com o tempo. A velocidade também é fundamental para manter a viabilidade do esperma. O tempo entre a adição do crioprotetor e a colocação dos frascos de esperma em gelo seco não deve ser superior a 30 segundos Fertilização in vitro.

O uso de esperma criopreservado funciona melhor com duas pessoas. Uma pessoa espreme os óvulos das fêmeas enquanto a outra descongela o esperma. Defina um banho-maria para 33 graus Celsius.

Remova um frasco criogênico do freezer de nitrogênio líquido e transfira-o para um nitrogênio líquido contendo D ou frasco até que esteja pronto para descongelar. Esprema os ovos das fêmeas anestesiadas em uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros. Isso é descrito em detalhes no protocolo JoVE intitulado Making Gyno Genetic implantado peixe-zebra por pressão inicial, que fornece uma descrição detalhada do peixe-zebra.

Na fertilização in vitro, uma boa ninhada contém mais de 150 ovos uniformes e amarelados. Qualquer detrito branco é indicativo de degradação. Se possível, tente obter três ninhadas de ovos e combinadas em um prato.

Se três embreagens boas não forem obtidas dentro de um minuto da primeira embreagem, prossiga para a próxima etapa. Mantenha o prato coberto enquanto o esperma é descongelado. Enquanto isso, remova o frasco do nitrogênio líquido e remova a tampa.

Mergulhe rapidamente o frasco até a metade em banho-maria a 33 graus por oito a 10 segundos. Adicione rapidamente 70 microlitros de temperatura ambiente, solução salina tamponada de Hank ao frasco e misture pipetando para cima e para baixo imediatamente adicione aos ovos na placa de Petri e misture delicadamente com a ponta da pipeta. Em seguida, ative imediatamente o esperma e os óvulos adicionando 750 microlitros de redemoinho de água de peixe para misturar e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.

Após cinco minutos, encha o prato com peixe, água e incube a 28 graus Celsius. Após duas a três horas, conte e transfira os embriões viáveis para placas de 100 milímetros a 50 embriões por placa. Conte também com óvulos fertilizados para que a fertilidade da amostra de esperma possa ser determinada.

A fertilidade do esperma é a proporção de embriões viáveis em relação ao número total de óvulos que foi usado para a fertilização in vitro. Os óvulos podem ser classificados a qualquer momento de duas a seis horas após a fertilização in vitro. Quando os ovos inférteis são facilmente distinguidos dos embriões viáveis, os ovos inférteis são claros e indivisíveis.

Quando visto com iluminação trans em um microscópio estereoscópico, a fertilidade média do esperma criopreservado varia muito. No entanto, deve ser possível obter uma média de 25% de fertilidade estável por vários anos. Este gráfico mostra a porcentagem média de fertilidade dos espermatozoides congelados entre 2001 e 2003 e pensados até 2008.

Acabamos de demonstrar um método de alto rendimento para chorar preservando zero esperma de peixe. Ao fazer este protocolo, é importante usar todo o desgaste e equipamento de plástico recomendado, bem como usar gelo seco picado pulverizado em vez de pellets de gelo seco. É fundamental usar espermatozóides e óvulos de alta qualidade e, no caso dos óvulos, ao fazer a fertilização in vitro, ao fazer o esperma, é importante usar o maior número possível de óvulos para melhorar o número de embriões férteis que você obtém na outra extremidade, o que pode levar de três a quatro fêmeas, Certo?

Outro componente chave do protocolo é a velocidade. Nunca deve demorar mais do que cerca de um minuto para ir da extração do esperma do homem para colocá-lo no gelo seco. Bem, eu acho que é isso.

Boa sorte com seus experimentos.