Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial
30 de junho de 2009
Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.
Olá, sou Charlene Walker do laboratório de Charles Kimmel na Universidade do Oregon, Instituto de Neurociência. E eu sou Gregory Walsh. Trabalho no laboratório de Cecilia Moens na Divisão de Ciências Básicas do Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson.
Hoje vamos mostrar um procedimento para produzir peixes-zebra diplóides com característica genética dupla pelo método de pressão precoce. Este método utiliza pressão hidrostática para despolimerizar microtúbulos em um óvulo fertilizado com espermatozoides irradiados por UV. Realizado com o tempo certo.
Isso impede a expulsão do segundo corpo polar, gerando um embrião diplóide cujos cromossomos homólogos são os dois produtos da meiose.Um. Esta técnica foi desenvolvida no início da década de 1970, quando trabalhava no laboratório de George Reisinger na Universidade do Oregon. Em nosso laboratório, utilizamos este procedimento em duas telas genéticas de quarta geração.
Os gametas de peixes mutagênicos F1 podem ser analisados diretamente em busca de mutações recessivas que causem fenótipos no desenvolvimento em descendentes homozigotos gyno, geneticamente diplóides. Como o peixe-zebra apresenta alta interferência genética, utilizamos também este método para mapear mutações nos cromossomos e estimar a distância dessas mutações em relação ao centrômero. Vamos começar: na tarde anterior ao experimento, prepare-se para a coleta de esperma separando machos e fêmeas que serão espremidas; machos mais velhos podem ser utilizados, já que eles não contribuirão com material genético.
As fêmeas devem apresentar-se grandes e gordas na região abdominal, enquanto os machos devem parecer amarelados e ágeis. Mantenha os machos e as fêmeas durante a noite em tanques separados de retenção, onde possam ser facilmente acessados pela manhã. Na manhã do experimento, prepare a solução de Hank e adicione bicarbonato de sódio.
Leve à instalação de peixes em um recipiente com gelo. A solução de Hank's trica um cronômetro e tubos para coleta de esperma. Finalmente, uma vez na instalação de peixes, dilua a trica em água para peixes.
Isso será usado para anestesiar os peixes no próximo passo. Para iniciar a coleta de esperma, prepare um frasco transparente com solução de Hank sobre gelo. Hank gelado o suficiente para cerca de 50 microlitros por macho a ser espremido; anestesie um ou dois machos por vez.
Por imersão e trica, eles podem ser retirados do anestésico com uma colher plástica. Enxágue os machos com água de aquário e seque levemente em uma toalha de papel. Isso é muito crítico porque a água ativa os espermatozoides.
Uma vez secos, posicione os peixes em um suporte de espuma sob um microscópio estereoscópico com baixa ampliação e iluminação epiluminosa. Separe as nadadeiras pélvicas com pinça e posicione uma micropipeta na abertura da cloaca para iniciar a coleta de esperma. Massageie suave, mas firmemente, os lados do peixe com pinça lisa de metal enquanto o esperma esbranquiçado sai do poro genital; colete-o na micropipeta utilizando sucção suave, recolhendo o esperma de vários machos em gelo.
Solução salina fria de Hanks. Espermatozoides de cinco a 10 machos são suficientes para fertilizar óvulos de 20 a 30 fêmeas. O espermatozoide mantido em Hanks frio continuará a fertilizar óvulos com eficiência por várias horas.
Colete espermatozoides suficientes para fazer uma suspensão turva para inativação por UV. Comece enchendo o fundo de uma placa de Petri de vidro com gelo. Coloque um vidro de relógio sobre o gelo dentro da placa.
Em seguida, use a pipeta para transferir o esperma do tubo de ensaio para o vidro de relógio. Certifique-se de recolher o máximo possível do esperma na pipeta, sem aspirar bolhas de ar. É essencial evitar a formação de bolhas no esperma; expulse o esperma em uma camada fina e uniforme sobre o vidro de relógio e descarte a pipeta.
Após a transferência do esperma, coloque a placa de Petri em um crosslinker de UV. Ligue o crosslinker configurado para entregar 900 JUULs de energia. Após o crosslinking, use uma pipeta limpa para remover o esperma do vidro de relógio e transferi-lo para um tubo fendor marcado como esperma UV e coloque-o no gelo.
Para iniciar a coleta de ovos, anestesie duas fêmeas por vez. Na Trica, é fundamental não manter os peixes em trica por muito tempo, pois a anestesia prolongada pode matar os peixes. Em seguida, enxágue os peixes em água para peixes e seque levemente com um papel toalha.
Isso é crítico porque o excesso de água fará as ovos incharem e impedirá a fertilização. Coloque a fêmea em uma placa de Petri plástica de 35 milímetros com os dedos úmidos, mas não molhados. Pressione suave, porém firmemente, sobre o abdômen.
Se ela estiver pronta para pôr ovos, eles sairão facilmente; colete os ovos com uma espátula e devolva a fêmea à água. Os bons ovos têm uma cor amarelada e translúcida, enquanto os ovos que permaneceram muito tempo dentro da fêmea são brancos e aquosos. Para garantir a obtenção de ovos bons, colete-os durante as primeiras duas horas após a iluminação do ambiente de criação de peixes e mantenha os ovos cobertos para evitar que sequem.
Após coletar os ovos, adicione de 30 a 50 microlitros da suspensão de espermatozoides UV aos ovos e agite suavemente com a ponta de uma pipeta. Adicione imediatamente cerca de um mililitro de água para peixes e inicie o cronômetro. Os ovos deixados para se desenvolverem neste ponto serão haploides.
Os seguintes passos devem ser realizados dentro de 90 segundos após a fertilização. Inicie o cronômetro no momento em que os ovos forem ativados pela adição de água.
O momento exato da metáfase da meiose um depende da temperatura. O momento da aplicação e remoção da pressão é otimizado para 28,5 graus Celsius. Após iniciar o cronômetro, aguarde alguns instantes, então adicione mais água e movimente os ovos para o centro da placa.
Usando uma pipeta de pasteur cortada e polida, transfira os ovos fertilizados para os frascos de pressão, se necessário, e adicione mais água para ovos ao frasco até que esteja quase transbordando, deixando uma gota de água no anel dos frascos. Em seguida, coloque uma tampa de borracha sobre a gota de água e fixe a tampa plástica sobre a borracha.
Coloque os frascos de cabeça para baixo no cilindro de pressão, adicionando mais água de ovo. Para reabastecer o cilindro, coloque a tampa firmemente sobre ele. Uma vez fechado, posicione o cilindro na prensa com o êmbolo para cima e aplique uma pressão de 8.000 libras por polegada quadrada.
Deixe o cilindro na prensa até seis minutos após o momento da ativação, por um tempo total de 4,5 minutos de pressão. Seis minutos após a ativação, retire o cilindro da prensa. Retire os frascos do cilindro e seque-os cuidadosamente para evitar o resfriamento dos embriões.
Reinicie o cilindro e reabasteça-o com água de ovo. Prepare os próximos frascos preenchendo-os parcialmente com água de ovo conforme necessário. Repita esses passos para todos os lotes de ovos.
O cilindro comporta até dois frascos por vez, portanto, talvez seja interessante atrasar a fertilização dos ovos por um a dois minutos para verificar se outras fêmeas já presentes na trica produzem ovos. Isso ajudará a acelerar o processo, tratando mais lotes ao mesmo tempo. Além disso, se você comprimir os peixes enquanto a prensa estiver sendo usada, os ovos podem ficar muito secos para serem viáveis até que a prensa possa ser utilizada novamente. Após 24 horas da fertilização, um embrião haploide de peixe-zebra terá um corpo curto e rechonchudo, uma cauda curta e um cérebro menos definido.
No entanto, todos terão as mesmas partes do corpo, como somitos, notocorda, olhos e ouvidos. Como diplóides, haplóides e diplóides todos exibem movimentos de flexão livre por volta de 24 horas. Após a fertilização, os irmãos diplóides EP possuem caudas longas, cérebros bem modelados e devem ter viabilidade de cerca de 60 a 70%.
Estes se assemelham muito aos controles implantados não tratados. Normalmente, um lote de embriões haplo apresentará uma mistura de embriões com boa aparência, embriões mortos e todos os estágios intermediários. A proporção entre embriões com boa aparência e os defeituosos reflete os genes deletérios presentes no genoma feminino.
As mutações são relativamente fáceis de identificar mesmo com esse fundo, pois haverá vários indivíduos, até 50%, com o mesmo fenótipo característico. É importante garantir que os embriões produzidos por este método sejam verdadeiros tic OIDs, pois os controles geram um ninhada de ovos normais desenvolvidos reservando parte do esperma sem inativação por UV e uma ninhada de embriões haploides reservando uma ninhada de ovos fertilizados com esperma UV sem passar pelo procedimento EP; os haploides não são viáveis após dois a três dias. Os embriões EP desenvolvidos devem parecer diplóides normais.
Embora alguns monstros EP irregulares possam ocorrer, posturas de diplóides EP devem ser amplamente viáveis, entre 70 e 90%. A presença de haplóides na postura EP utilizada sugere uma falha no processo EP, por exemplo, a prensa não manter a pressão. A presença de diplóides na postura de haplóides sugere inativação incompleta do esperma, por exemplo, uma falha no agente reticulante.
Acabamos de mostrar como é fácil realizar a fertilização in vitro com peixe-zebra e como produzir embriões diplóides de peixe-zebra derivados geneticamente por meio da partenogênese, inibindo a segunda divisão meiótica. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o momento da pressão inicial é preciso e que a prensa mantém sua pressão em 8.000 libras por polegada quadrada durante todo o tratamento. Certifique-se de calibrar sua prensa.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para gerar embriões diplóides zigóticos de peixe-zebra utilizando pressão hidrostática para despolimerizar microtúbulos em ovos fertilizados com espermatozoides irradiados por UV. A técnica permite a criação de embriões que são homozigotos em todos os locos não separados de seus centrômeros por meio de recombinação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Genética
Contexto
- Embriões diplóides de peixe-zebra ginogenéticos são produzidos com apenas contribuição genética materna.
- O método envolve o bloqueio da segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização.
- Espermatozoides irradiados com UV são usados para fertilizar os ovos.
- A recombinação durante a primeira divisão meiótica afeta a homozigose.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a criação de peixes-zebra diplóides ginogenéticos.
- Explorar as implicações desse método para estudos genéticos.
- Fornecer um protocolo que possa ser replicado em outros laboratórios.
Métodos Utilizados
- Aplicação de pressão hidrostática para despolimerizar microtúbulos.
- Fertilização de ovos com espermatozoides irradiados por UV.
- O timing da aplicação da pressão é crítico para o sucesso.
- Observação do desenvolvimento do embrião após a fertilização.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de embriões diplóides ginogenéticos.
- Os embriões exibem homozigosidade em locos não afetados pela recombinação.
- O método demonstra reprodutibilidade entre ensaios.
- As aplicações potenciais na pesquisa genética são discutidas.
Conclusões
- O método de pressão hidrostática é eficaz para a criação de peixes-zebra diplóides ginogenéticos.
- Essa técnica pode aprimorar estudos genéticos em modelos de peixe-zebra.
- São necessárias pesquisas adicionais para explorar as implicações completas deste método.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A geração direta de embriões de peixe-zebra diploides homozigotos a partir de fêmeas heterozigotas permite acelerar a triagem genética direta, possibilitando a análise de fêmeas mutagênicas F1 em busca de mutações recessivas sem a necessidade de cruzamentos externos. Essa abordagem reduz o tempo e o consumo de recursos em fluxos de trabalho de validação de alvos, produzindo embriões homozigotos na maioria dos locos, o que facilita a triagem fenotípica rápida e a redução mecanicista de riscos associados a novos alvos. O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, ao permitir a observação direta dos efeitos de mutações homozigotas em um sistema modelo de vertebrado.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da triagem direta de fêmeas mutagenizadas F1 para fenótipos recessivos no desenvolvimento em descendentes diplóides homozigotos.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de gerações de cruzamento externo, acelerando a identificação de mutações prejudiciais em genes-alvo.
- Valor Preditivo: A homozigose em locos próximos ao centrômero permite a detecção de mutações em frequência de ~50%, favorecendo a identificação eficiente de candidatos promissores e a priorização de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz embriões geneticamente uniformes adequados para ensaios fenotípicos padronizados em telas genéticas diretas.
- Valor Operacional: Alta viabilidade (60-90%) dos embriões diplóides EP sustenta campanhas de triagem escaláveis com leituras consistentes.
- Prontidão para Ensaios: Os embriões desenvolvem morfologia e motilidade normais, permitindo a quantificação confiável de fenótipos de desenvolvimento em telas com compostos ou genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Peixes-zebra diploides homozigóticos fornecem um sistema relevante para doenças na validação de alvos identificados em telas iniciais por meio da conservação fenotípica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a estimativa da distância da mutação em relação ao centrômero, informando a força do alelo e o impacto na via para a validação do alvo.
- Modelo Pré-clínico: Diploides EP férteis adultos permitem estudos multigeracionais para avaliar os efeitos da modulação do alvo sobre o desenvolvimento e a fisiologia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de pressão precoce insere-se no continuum de descoberta que vai da mutagênese à triagem fenotípica, permitindo uma transição rápida da identificação de mutantes F1 à avaliação de fenótipos homozigotos, sem atrasos geracionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao gerar embriões homozigotos em locos não separados pela recombinação, esclarecendo a função gênica e o envolvimento em vias biológicas.
- Triagem: Fornece embriões prontos para ensaios com alta viabilidade e penetrância fenotípica, permitindo triagens confiáveis de compostos ou supressores/realçadores genéticos.
- Análises: Facilita a medição quantitativa de fenótipos de desenvolvimento, com taxas de detecção de mutações que informam a confiança no alvo e o tamanho do efeito do alelo.
- Pesquisa Translacional: Diploides homozigotos fornecem um sistema contínuo desde a descoberta até a validação pré-clínica, reduzindo a taxa de falhas devido à incerteza sobre o mecanismo do alvo.
- Reutilização Empresarial: O método constitui uma plataforma reprodutível para gerar modelos vertebrais homozigotos, aplicável em múltiplas campanhas de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a heterogeneidade genética e permitir a observação direta dos efeitos de mutações homozigotas.
- Valor Operacional: Protocolo padronizado com pressão definida (8.000 psi) e parâmetros de tempo garante reprodutibilidade entre laboratórios e lotes.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir a detecção precoce de alvos prejudiciais por meio do rastreamento acelerado de mutações recessivas.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados fenotípicos quantitativos sobre a modulação de alvos em um sistema vertebrado.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manipulação de peixes-zebra, microinjeção e operação de câmara de pressão.
- Depende de equipamento hidrostático calibrado, capaz de atingir 8.000 psi, e de um crosslinker de UV para inativação de espermatozoides.
- Necessita controle rigoroso do tempo (pressão aplicada dentro de 90 segundos após a fertilização, mantida por 4,5 minutos) para garantir a despolimerização de microtúbulos e o bloqueio da meiose II.
- A adaptação entre sistemas modelo é limitada pelo tempo reprodutivo específico do peixe-zebra e sua sensibilidade à pressão.
- As limitações práticas incluem eficiência variável conforme a frequência de recombinação, com locos teloméricos apresentando homozigose <1%, exigindo abordagens complementares de mapeamento.
