Visualizar o coração batendo no Drosophila

Duas técnicas serão apresentadas aqui para a visualização de um coração batendo em Drosophila para a dissecção do coração adulto. Primeiro, a cabeça e o tórax são removidos por um único corte ao longo da linha indicada. Em seguida, a genitália é removida e a cavidade abdominal do corpo é aberta com uma pinça no intestino e, no caso de uma mosca fêmea, os ovários são removidos.

O corpo adiposo abdominal nos segmentos abdominais três e quatro é cuidadosamente sugado para expor o coração adulto para a imobilização do coração larval. Uma única larva colocada em solução tampão é fixada aplicando cola histoacral primeiro ao redor da região da cabeça da larva. As larvas são esticadas suavemente e mais cola é aplicada na extremidade posterior e, em seguida, nos flancos da parede do corpo da larva.

Olá, sou GI Fler. Oi, eu sou Karen er. Nós dois somos membros do programa de Desenvolvimento e Envelhecimento do Instituto Burnham de Pesquisa Médica.

Hoje mostraremos os procedimentos que desenvolvemos para visualizar o coração pulsante de Laval e da drosófila adulta. Usamos essas duas preparações como uma forma de visualizar, examinar e quantificar os parâmetros de batimentos cardíacos na mosca da fruta. Drosófila. Antes de começar, primeiro preparamos uma solução de hemolinfa artificial.

Esta solução contém entrada de sacarose, helo, que deve ser adicionada à hemolinfa artificial de soluções de estoque refrigeradas imediatamente antes do uso. Para evitar a contaminação bacteriana, leve a hemolinfa artificial à temperatura ambiente e oxigene a solução borbulhando ar por pelo menos 15 minutos. Em seguida, puxe vários capilares finos usando um extrator de pipeta padrão, que será necessário para a remoção de corpos gordurosos na mosca.

Depois de tudo preparado, as moscas adultas devem ser anestesiadas. Isso pode ser feito usando uma breve exposição para tirar uma soneca por dois a cinco minutos, mas tome cuidado para não deixar as moscas na soneca por mais de cinco minutos. A exposição de curto prazo ao frio também pode ser usada para anestesiar moscas, mas o dióxido de carbono não é recomendado, pois tem efeitos mais duradouros na frequência cardíaca e na idade.

Em seguida, as moscas anestesiadas são colocadas com o lado dorsal voltado para baixo em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica nas asas e no corpo deve aderir reversivelmente à geleia, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Um corte inicial é feito usando uma tesoura de mola curva.

Isso é feito colocando as lâminas da tesoura sob as pernas da mosca e inclinadas para baixo em direção à superfície dorsal do pescoço. A cabeça, o cordão nervoso ventral e as pernas são removidos com um único corte, uma vez cortados. A preparação é então submersa na solução de hemolinfa artificial oxigenada usando uma tesoura de mola.

A ponta posterior do abdome, que é composta pelos segmentos abdominal sete e oito, é removida com um único corte. Isso fornece acesso para fazer cortes laterais ao longo de ambas as bordas do abdômen e serve para cortar a conexão entre o intestino posterior e a cutícula abdominal. Insira as lâminas da tesoura na pequena abertura na ponta do abdômen e corte a cutícula lateralmente.

Isso libera uma borda da cutícula ventral. Segure o retalho com uma pinça e faça um corte semelhante ao longo da borda lateral oposta do abdômen. O retalho liberado da cutícula abdominal ventral agora pode ser removido.

O intestino e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como uma única massa usando pinças de joalheiro e puxões suaves. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco batendo, que ainda está preso à cutícula dorsal por pequenos músculos aéreos e é cercado por corpos gordurosos. Os capilares puxados são inseridos em plástico, um tubo de 16 polegadas conectado a uma fonte de vácuo.

A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponteira, portanto, pipetas com ponteiras maiores que 40 mícrons de diâmetro não devem ser usadas depois de configuradas. Este sistema de sucção é usado para sugar o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. Também pode ser usado para remover bolhas de ar que se acumulam ao redor da cutícula e quaisquer detritos.

Deve-se tomar extremo cuidado para evitar tocar no próprio coração e, como a porção posterior do coração é muito frágil, essa região deve ser evitada em conjunto. O tubo cardíaco da drosófila adulta está agora exposto e deve estar batendo, se necessário. A cutícula e o coração anexado podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula da vaselina e cuidadosamente compactando-a novamente.

Evitar qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste ponto, a solução que banha a preparação deve ser substituída por hemolinfa artificial fresca. Esta preparação deve ser deixada em equilíbrio por 20 a 30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação.

Se a preparação for mantida por mais de 60 minutos, ela deve ser reperfundida com hemolinfa artificial fresca. Esta preparação está agora pronta para ser usada para registro óptico e também pode ser usada para registro eletrofisiológico ou para manipulações histológicas. Uma técnica diferente é necessária para visualizar as intralarvas do coração batendo.

Primeiro, prepare as lamínulas no dia anterior ao procedimento. Isso é feito usando um palito de dente para transferir cerca de 50 a 70 microlitros de solução de Sard para uma lamínula de 22 por 22 milímetros. Deixe a proteção endurecer a 65 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, faça o buffer de Brody e Bates uma vez preparado, as alíquotas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius e descongeladas quando necessário. Finalmente, prepare as ferramentas necessárias para aplicar a cola histoacral. Primeiro, puxe vários capilares finos.

Em seguida, conecte uma ponta de pipeta de 1.5 mililitro com um pequeno tubo de plástico com cerca de 32 polegadas de diâmetro. Ao inserir a extremidade menor no tubo, insira um capilar com sua ampla abertura para a outra extremidade. Uma vez configurado, carregue o capilar com cola histo mergulhando o capilar em uma gota de cola e sucção suave na ponta de plástico.

Ao trabalhar com a cola, deve-se ter um segundo capilar de vidro à mão para remover o excesso de cola da ponta do capilar de cola. A cola é líquida até entrar em contato com solução salina tamponada, onde endurecerá em alguns segundos. No entanto, geralmente permanece plástico por tempo suficiente para ser removido da ponta capilar da cola ou durante a aplicação na amostra.

Agora, para iniciar a imobilização das larvas, coloque uma gota de cola histoacral perto de cada canto da proteção do syl. As lamínulas adicionam 50 microlitros de tampão B e B às gotas de cola, que endurecem instantaneamente e preenchem o espaço entre os pontos colados com b e b. A cola manterá o amortecedor no slide.

Pegue uma larva L três errante e coloque-a em um pedaço de papel de seda úmido no gelo por dois minutos. Isso diminuirá seu movimento. Em seguida, transfira as larvas para o tampão e oriente-o com o lado dorsal para cima.

Este é o lado das larvas que não possui cintos idênticos. Aplique rapidamente um pouco de cola entre a região da cabeça e a proteção da soleira. A cola endurece muito rapidamente e impede que a cabeça das larvas se mova.

Usando uma pinça, segure cuidadosamente o animal pelos brilhos posteriores e estique-o suavemente. Fixe as larvas nesta posição aplicando a cola ao longo de ambos os lados das larvas na metade posterior. Para reduzir o movimento adicional da cutícula pelos músculos da parede do corpo, adicione mais cola aos flancos do animal.

A larva agora está fixada nesta posição. A lamínula pode ser colocada em uma pequena placa de Petri cheia de hemolinfa artificial ou os batimentos cardíacos PBS agora podem ser registrados sem interferência dos movimentos da parede corporal. O coração de drosófila adulta semi-intacta baterá ritmicamente por horas após a dissecção, quando mantido em hemolinfa artificial oxigenada fresca.

Um exemplo representativo é mostrado aqui e no filme suplementar um coração do terceiro em larvas de estrelas mostrado aqui, e as moscas jovens de uma a três semanas após o elo geralmente exibem um batimento cardíaco regular a taxas entre um a três hertz, as moscas com mais de três semanas geralmente são mais arrítmicas. No entanto, esses corações ainda são capazes de bater espontaneamente por horas em corações de hemolinfa artificial oxigenada e moscas adultas que são danificadas como resultado do procedimento de dissecção geralmente mostram regiões localizadas de extrema constrição que são incapazes de relaxar e muitas vezes são incontroláveis. Taxas de batimentos cardíacos mais lentas do que um Hertz raramente são observadas em moscas com menos de três semanas de idade.

Consequentemente, essas preparações são consideradas danificadas e rejeitadas. Acabamos de demonstrar como preparar corações de moscas da fruta nivelados e adultos para imagens ópticas. Lembre-se, ao fazer a preparação semi-intacta, nunca toque no próprio coração.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.