Name: Visualizar o coração batendo no Drosophila /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda técnicas de visualização do coração batendo em Drosophila larval e adulta. Este método utiliza dissecação e cola histo acral para imobilização, permitindo estudar fisiologia cardíaca em diferentes estágios de vida.

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KO é apoiado por uma bolsa da American Heart Association.

Antes de começar a Coração do adulto <ol><li> Recém preparar hemolinfa artificial (AH) solução contendo 108mm Na +, 5mM K +, 2mM de Ca 2 + 8mm, MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, sacarose 10mM, trealose 5mM, HEPES 5mM (pH 7.1, todos os reagentes de Chemicals Sigma). A sacarose e trealose deve ser adicionado ao AH a partir de soluções estoque refrigerado imediatamente antes do uso, a fim de evitar a contaminação bacteriana. </li><li> AH trazer à temperatura ambiente e oxigenar a solução por via aérea borbulhando por pelo menos 15 min. </li><li> Puxe vários capilares finos (por exemplo, capilares de vidro, 100ul, VWR) necessário para a remoção de gorduras. </li></ol> Corações larval <ol><li> Sylgard revestido lamínulas: usando um palito de transferência, de cerca de 50-70μl de solução Sylgard em uma lamela 22x22mm. Deixe o endurecem Sylgard a 65 ° C durante a noite. </li><li> Prepare o Broadie e buffer de Bate (135mm NaCl, KCl 5mM, 4mm MgCl 2, CaCl 2 2mM, TES 5mM, Sacarose 36mm;. PH 7,15 Veja Broadie e Bate, 1993). </li><li> Prepare as ferramentas necessárias para aplicar a cola Histoacryl. Primeiro, puxe vários capilares finos (por exemplo, Ciência Produtos GB100T8P). Conecte uma ponta de pipeta de 1,5 ml com um pequeno tubo de plástico (Tygon, 1 / 32 &quot;), inserindo a extremidade menor para dentro do tubo. Inserir um capilar com a sua ampla abertura para o outro lado. Carregar o capilar com cola Histoacryl por imersão do capilar em uma gota de cola e uma sucção suave na ponta de plástico. Ao trabalhar com a cola deve ter um segundo copo capilar em mãos para remover a cola excessiva da ponta da cola capilar. A cola é líquido até que ele entra em contato com solução salina, onde ele irá endurecer em poucos segundos. No entanto, ele geralmente permanece plástica por tempo suficiente para ser removido da ponta cola capilar ou, aplicando-o ao modelo. </li></ol> Semi-intactas Coração Drosophila da mosca adulta <ol><li> Moscas Drosophila são anestesiados com Nap Fly (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. É preciso ter cuidado para não deixar as moscas no Nap Fly para exposições mais longas. Exposição a curto prazo ao frio também pode ser usado para anestesiar as moscas, mas CO 2 não é recomendado, pois tem mais efeitos duradouros sobre a freqüência cardíaca e ritmo. </li><li> Anestesiados moscas são colocadas, lado dorsal para baixo, em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica nas asas e no corpo reversivelmente &quot;pau&quot; para a geléia, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Isso se torna especialmente importante durante as manipulações subsequentes. </li><li> Um corte inicial é feita usando um par de tesouras curvas mola (Roboz # 5611). As lâminas de tesoura são colocados sob as pernas e anguladas para baixo em direção a superfície dorsal do tórax perto do pescoço. A cabeça, cordão nervoso ventral, e as pernas são removidos com um único corte. A preparação é então imerso em um hemolinfa, oxigenado artificial (AH) solução. </li><li> Usando a tesoura primavera a ponta posterior do abdômen (composto por segmentos abdominais 7 e 8) é removido com um único corte. Isso fornece acesso para fazer cortes laterais ao longo de ambas bordas do abdome e serve para cortar a ligação entre o intestino posterior e da cutícula abdominal. O retalho livre de cutícula abdominal ventral é então removido. </li><li> Nos passos 3 e 4 as conexões anterior e posterior do intestino são cortados para os órgãos abdominais são agora mantidos no lugar apenas por tracheols. O intestino e outros órgãos abdominais geralmente pode ser removida como uma única massa com a pinça joalheiro (Roboz, # 55) e suave puxando. Remover os órgãos internos revela o tubo coração batendo ainda ligado à cutícula dorsal cercado por corpos de gordura. </li><li> Os corpos de gordura são bastante opacos no microscópio de luz, consequentemente, muitas vezes é necessário remover algumas dessa gordura, a fim de ver o tubo cardíaco claramente. Isto é realizado por uma técnica de lipoaspiração usando finamente desenhadas capilares de vidro. Capilares são feitas usando um padrão pipeta extrator (Eg Sutter P-97 Pipetar Puller) e depois são inseridos em tubos de plástico (Tygon, 1 / 16 &quot;) ligado a uma fonte de vácuo. Este sistema é usado para sugar o excesso de gordura ao redor do tubo de coração. Força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponta para pipetas com pontas maiores que 40 mícrons de diâmetro não deve ser usado. Extremo cuidado deve ser tomado para evitar tocar o próprio coração e porque a parte posterior do coração é muito frágil naquela região deve ser evitada. </li><li> O tubo de coração adulto Drosophila está agora exposta e deve ser de bater. Se necessário, o coração cutícula e anexado pode ser reposicionada, delicadamente levantar a cutícula fora da vaselina e cuidadosamente tamping-lo de volta para baixo, novamente evitando qualquer contato com o tecido do coração. Em tseu ponto de vista a solução que banha a preparação deve ser substituído por AHL fresco. Esta preparação deve ser autorizada a estabilizar durante 20-30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação. Se a preparação deve ser mantida por mais de 60 minutos deve ser perfundido com AHL fresco. </li></ol> Imobilizando larvas Drosophila para gravação óptica <ol><li> Coloque uma gota de cola Histoacryl perto de cada canto do lamínulas Sylgard. Adicionar 50μl de tampão B &amp; B para as gotas de cola que vai endurecer instantaneamente. Preencher o espaço entre os pontos colados com B &amp; B - a cola vai manter o buffer no slide. </li><li> Dê uma vagando larva L3 e colocá-lo em um pedaço de lenço de papel molhado em gelo por 2 min. Isto irá desacelerar seu movimento. Em seguida, transferir a larva no buffer e orientá-la com o lado dorsal para cima (este é o lado da larva que não tem os cintos dentículo). Aplicar rapidamente um pouco de cola entre a região da cabeça e do Sylgard. A cola vai endurecer muito rapidamente e impedir que a cabeça da larva de se mover. </li><li> Utilizando uma pinça cuidadosamente agarrar o animal pela espiráculos posterior e gentilmente esticá-lo. Fixar a larva nesta posição, aplicando a cola ao longo de ambos os lados da larva na metade posterior. Para reduzir ainda mais o movimento da cutícula pelos músculos da parede do corpo, adicione mais cola para os flancos do animal. A larva é agora fixa nesta posição. A lamela pode ser colocado em uma placa de Petri pequena cheia de AHL ou PBS. Batimentos cardíacos podem ser gravados sem a interferência de movimentos parede do corpo. </li></ol> Resultados representativos: A semi-intactas adulto coração vai bater ritmicamente Drosophila por horas após a dissecação, quando mantidos em fresco, AH oxigenado (ver Dados Suplementar, Ocorr, et al., 2007). Um exemplo representativo é mostrado no filme 1. Corações de 3 º instar larva e moscas jovens (1-3 semanas após a eclosão) geralmente apresentam um batimento cardíaco regular em taxas entre 1-3 Hz. Voa com mais de três semanas, geralmente são mais arrítmicos, no entanto, esses corações ainda são capazes de bater espontaneamente por horas em AHL oxigenado. Corações em moscas adultas que estão danificados, como resultado do procedimento de dissecção normalmente apresentam regiões localizadas de constrição extremas que são incapazes de relaxar. Taxas de batimento cardíaco mais lento do que 1 Hz são raramente observadas em moscas com menos de 3 semanas de idade, conseqüentemente tais preparações são consideradas danificadas e são descartados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">Clique aqui para baixar Filme 1.</a> - A uma semana fly tipo selvagem de idade adulta (w cepa de laboratório 1118) mostrando o tubo de coração exposto abdominal (anterior à esquerda). Nota regular, contrações rítmicas. Regiões opacas no canto superior direito estão os restantes órgãos de gordura abdominal; células redondas de cada lado do coração são as células do pericárdio.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

O modelo de Drosophila provou ser uma poderosa ferramenta genética que tem sido utilizado para tratar uma variedade de questões científicas que vão desde desenvolvimento embrionário para a aprendizagem e memória. Recentemente, este organismo modelo versátil, tem sido usado para investigar a genética da função cardíaca na mosca. Uma série de tentativas para quantificar a fisiologia do coração em adultos Drosophila têm contado com observações feitas em moscas intacta através da cutícula abdominal. A maioria dessas abordag...

<table><tbody><tr><td>Tesoura cirúrgica de mola microdissecção (curva)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>Indicada para cortes gerais (Etapa 3)</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica de mola microdissecção (reta)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro, 100ul</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro, finos</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>Funcionam tanto pipetadores horizontais quanto verticais</td></tr><tr><td>Tubo plástico</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; de diâmetro interno</td><td>para capilares de 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>Tubo plástico</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; de diâmetro interno</td><td>para capilares pequenos</td></tr><tr><td>Adesivo tecidual Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizar o coração batendo no drosophila</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

O<em&gt; Drosophila</emCardíaca&gt; surgiu recentemente como um sistema bom modelo para examinar os mecanismos genéticos, celulares e moleculares subjacentes à função em corações miogênica. Um passo fundamental na análise da função cardíaca na mosca é encontrar uma maneira de acessar o coração de uma forma que preserva a sua função miogênica enquanto ainda permitindo que o órgão coração batendo a serem observados e registrados. Dois métodos diferentes para observar e registrar o coração batendo em ambos larva e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; São descritos aqui. Nossa preparação semi-intactas usando moscas adultas permite a visualização clara do coração abdominal, sem interferência da cutícula pigmentadas e sobrejacente corpos gordos. Para gravar coração bate larval é necessário imobilizar a larva, o que minimiza os movimentos do corpo, reduzindo assim os movimentos da parede do coração que não estão associados com as contrações do miocárdio. Nossas metodologias produzir adulto estável e preparações de coração larval que pode bater por horas a taxas de Hz 1-3.

Técnica necessária para visualizar o coração batendo em larvas e adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; São apresentados. Cada fase da vida exige uma metodologia diferente.

Visualizar o coração batendo no Drosophila</em

O coração de Drosophila emergiu recentemente como um bom sistema modelo para examinar os mecanismos genéticos, celulares e moleculares subjacentes à função em ...

Duas técnicas serão apresentadas aqui para a visualização de um coração pulsante em Drosophila para a dissecação do coração adulto. Primeiro, a cabeça e o tórax são removidos por um único corte ao longo da linha indicada. Em seguida, as genitálias são removidas e a cavidade corporal abdominal é aberta usando pinças; o intestino, e no caso de uma mosca fêmea, os ovários, são removidos.O corpo adiposo abdominal nos segmentos abdominais três e quatro é cuidadosamente aspirado para expor o coração adulto e permitir a imobilização do coração larval. Uma única larva colocada em solução tampão é fixada aplicando-se primeiro cola histo acral ao redor da região da cabeça da larva. A larva é levemente esticada e mais cola é aplicada na extremidade posterior e depois nas laterais da parede corporal da larva.Olá, sou GI Fler. Olá, sou Karen er. Ambos somos membros do programa de Desenvolvimento e Envelhecimento do Instituto Burnham de Pesquisa Médica.Hoje vamos mostrar os procedimentos que desenvolvemos para visualizar o coração pulsante de drosófilas larvais e adultas. Utilizamos ambos esses preparos como forma de visualizar, examinar e quantificar parâmetros cardíacos na mosca-das-frutas, Drosophila. Antes de começar, preparamos inicialmente uma solução artificial de hemolinfa.Esta solução contém a entrada de sacarose, helo, que deve ser adicionada ao hemolinfa artificial a partir de soluções estoque refrigeradas imediatamente antes do uso. Para prevenir contaminação bacteriana, aqueça o hemolinfa artificial até a temperatura ambiente e oxigene a solução por borbulhamento de ar por pelo menos 15 minutos. Em seguida, puxe vários capilares finos utilizando um puxador de pipetas padrão, que serão necessários para a remoção dos corpos gordurosos na mosca.Uma vez que tudo tenha sido preparado, as moscas adultas devem ser anestesiadas. Isso pode ser feito mediante exposição breve ao fly nap por dois a cinco minutos, mas tome cuidado para não deixar as moscas no fly nap por mais de cinco minutos. A exposição de curta duração ao frio também pode ser utilizada para anestesiar as moscas, mas o dióxido de carbono não é recomendado, pois possui efeitos prolongados na frequência cardíaca e na ity.Em seguida, as moscas anestesiadas são colocadas com a face dorsal voltada para baixo em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica das asas e do corpo deve aderir reversivelmente à vaselina, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Um corte inicial é feito usando uma tesoura curva de mola.Isso é feito colocando as lâminas da tesoura sob as pernas da mosca e inclinadas para baixo, em direção à superfície dorsal, próximo ao pescoço. O cordão nervoso ventral da cabeça e as pernas são removidos com um único corte. Em seguida, o preparo é submerso na solução artificial de hemolinfa oxigenada usando tesouras de aço flexível.A ponta posterior do abdômen, composta pelos segmentos abdominais sete e oito, é removida com um único corte. Isso permite o acesso para realizar cortes laterais ao longo das duas bordas do abdômen e serve para seccionar a conexão entre o intestino posterior e o cutículo abdominal. Insira as lâminas da tesoura na pequena abertura na ponta do abdômen e corte o cutículo lateralmente.Isso libera uma borda da cutícula ventral. Segure a aba com pinça e faça um corte semelhante ao longo da borda lateral oposta do abdome. A aba solta da cutícula abdominal ventral pode agora ser removida.Os intestinos e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como um único conjunto usando pinças de ourives e puxando suavemente. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco pulsante, que ainda está preso à cutícula dorsal por pequenos músculos arteriais e é rodeado por corpos adiposos. Os capilares puxados são inseridos em tubos plásticos de um dezesseis avos de polegada, conectados a uma fonte de vácuo.A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponteira; portanto, pipetas com ponteiras maiores que 40 microns de diâmetro não devem ser utilizadas após o preparo. Este sistema de sucção é usado para remover o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. Também pode ser empregado para eliminar bolhas de ar que se acumulam ao redor da cutícula e quaisquer detritos.Deve-se ter extrema cautela para evitar tocar o próprio coração, e como a porção posterior do coração é muito frágil, essa região também deve ser evitada. O tubo cardíaco de drosófila adulta agora está exposto e deve estar batendo, se necessário. A cutícula e o coração nela aderido podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula do gel de petróleo e acomodando-a cuidadosamente novamente. Evitando qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste momento, a solução que banha o preparo deve ser substituída por hemolinfa artificial fresca. Esse preparo deve ser deixado equilibrar por 20 a 30 minutos com oxigenação antes de quaisquer manipulações.Se o preparo precisar ser mantido por mais de 60 minutos, deve ser reperfundido com hemolinfa artificial fresca. Este preparo está agora pronto para ser usado em gravações ópticas e também pode ser utilizado em gravações eletrofisiológ游戏副本s ou em manipulações histológicas. Uma técnica diferente é necessária para visualizar o coração pulsante intra-larval.Primeiro, prepare as lamínulas no dia anterior ao procedimento. Isso é feito usando um palito para transferir cerca de 50 a 70 microlitros da solução Sard para uma lamínula de 22 por 22 milímetros. Deixe o selante syl curar a 65 graus celsius durante a noite.Em seguida, prepare o tampão de Brody e Bates; uma vez preparado, alíquotas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius e descongeladas conforme necessário. Por fim, prepare as ferramentas necessárias para aplicar a cola histo acral. Primeiro, puxe vários capilares finos.Em seguida, conecte uma ponteira de pipeta de 1,5 mililitro a um pequeno tubo plástico com cerca de um trinta e dois avos de polegada de diâmetro. Inserindo a extremidade menor no tubo, conecte uma capilar com sua abertura larga à outra extremidade. Após a montagem, carregue a capilar com cola histológica mergulhando a capilar em uma gota de cola e fazendo uma leve sucção através da ponteira plástica.Ao trabalhar com a cola, deve-se ter um segundo capilar de vidro à mão para remover o excesso de cola da ponta do capilar de cola. A cola permanece líquida até entrar em contato com solução salina tamponada, quando então endurecerá em alguns segundos. No entanto, geralmente permanece plástica por tempo suficiente para ser removida da ponta do capilar de cola ou durante sua aplicação ao espécime.Agora, para iniciar a imobilização das larvas, coloque uma gota de cola histo acral próximo a cada canto do syl guard. Adicione lâminas de cobertura e 50 microlitros de tampão B e B nas gotas de cola, que endurecerão instantaneamente; preencha o espaço entre os pontos colados com B e B. A cola manterá o tampão sobre a lâmina.Pegue uma larva L3 vagante e coloque-a sobre um pedaço de papel-toalha úmido sobre gelo por dois minutos. Isso diminuirá seu movimento. Em seguida, transfira a larva para o tampão e posicione-a com o lado dorsal voltado para cima.Este é o lado das larvas que não possui os cintos idênticos. Aplique rapidamente um pouco de cola entre a região da cabeça e o protetor de soleira. A cola endurecerá muito rapidamente e impedirá que a cabeça das larvas se mova.Usando pin&ccedil;as, segure cuidadosamente o animal pelos espinhos posteriores e estique-o suavemente. Fixe as larvas nesta posi&ccedil;&atilde;o aplicando cola ao longo dos dois lados da larva na metade posterior. Para reduzir movimentos adicionais da cut&iacute;cula pelos m&uacute;sculos da parede corporal, adicione mais cola nas laterais do animal.A larva está agora fixada nesta posição. A lamínula pode ser colocada em um pequeno recipiente de Petri contendo hemolinfa artificial ou PBS, e as pulsações cardíacas podem ser registradas sem interferência dos movimentos da parede corporal. O coração de *Drosophila* semi-intacto baterá ritmicamente por horas após a dissecação, desde que mantido em hemolinfa artificial fresca e oxigenada.Um exemplo representativo é mostrado aqui e no filme suplementar um, corações de larvas de terceiro estágio em estrela mostrados aqui e moscas jovens, de uma a três semanas após a eclosão, geralmente exibem uma frequência cardíaca regular entre um e três hertz. Moscas com mais de três semanas geralmente são mais arrítmicas. No entanto, esses corações ainda são capazes de pulsar espontaneamente por horas em hemolinfa artificial oxigenada. Corações e moscas adultas danificados como resultado do procedimento de dissecação tipicamente apresentam regiões localizadas de constrição extrema que são incapazes de relaxar e muitas vezes se contraem de forma descontrolada. Frequências cardíacas mais lentas que um hertz raramente são observadas em moscas com menos de três semanas de idade.Consequentemente, essas preparações são consideradas danificadas e são descartadas. Acabamos de demonstrar como preparar corações de moscas-das-frutas adultas em nível adequado para imagem óptica. Lembre-se, ao fazer a preparação semiconectada, nunca toque diretamente no coração.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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