Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae

A fosforilação é um mecanismo chave de sinalização celular que rege os processos desde a localização da proteína até a transcrição do DNA e o estudo do fosfato sozinho por espectrometria de massa é um novo avanço empolgante no estudo da sinalização e da proteômica. As células marcadas diferencialmente são encontradas por lise em um moedor de moinho de bolas, depois reduzidas alquiladas misturadas e digeridas. Os peptídeos digeridos são fracionados por cromatografia de interação hidrofílica e peptídeos fosfofílicos enriquecidos a partir de frações por enriquecimento de iMac.

As frações enriquecidas com peptídeos fosfóricos são então identificadas por msm. Sra. Olá, sou Ramsey Celine, do grupo E do Instituto de Biologia da Persistência. Hoje vamos mostrar um procedimento para a extração de peptídeos fosfofólicos marcados metabolicamente.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar quantitativamente o proteoma da fossa. Então vamos começar. Este procedimento começa com o crescimento isotopicamente de células de levedura leves e pesadas.

Primeiro inocule 100 mililitros de meio rico com uma única colônia de células de levedura. Cultive essa cultura da noite para o dia para um OD 600 de 1.0. Em seguida, use-o para semear duas culturas de um litro de meio mínimo contendo um complemento completo de aminoácidos e suplementado com 20 miligramas por litro de isotopicamente.

A arginina e a lisina normais ou isotopicamente pesadas crescem ambas as culturas de um litro por 18 horas para um OD 600 de 1,8. É fundamental que as células passem por pelo menos nove gerações para alcançar a incorporação total dos isótopos marcados. Quando as células incorporaram totalmente os isótopos marcados centrifugam, as células que foram cultivadas no meio com isotopicamente, arginina e lisina normais.

Para obter um pellet celular, lave o pellet com sede de água estéril em um meio contendo oleato com isotopicamente, arginina e lisina normais e estimule por 85 minutos. Isso produz uma amostra estimulada por oleato isotopicamente leve. A outra cultura cultivada em meio com arginina e lisina isotopicamente pesadas não é estimulada com oleato e servirá como uma amostra de referência cultivada com glicose isotopicamente pesada.

Para coletar um litro, a cultura é distribuída entre quatro frascos de centrífuga de 250 mililitros. Após a centrifugação, as células são coletadas em um tubo, removendo ou apenas 100 mililitros do meio Resus, suspendendo as células e transferindo para o próximo tubo. No final, um pellet grande é coletado em uma única centrífuga de tubo por três minutos a 4.000 RPM.

Após a remoção do meio, o peso do frasco de centrífuga e do pellet é comparado a um frasco de centrífuga vazio. Após a centrifugação, remova o meio e aspire o excesso de líquido das garrafas, pese os pellets e um rendimento típico é entre um a dois gramas. Em seguida, congelamento instantâneo Os pellets em nitrogênio líquido adicionam tampão de moagem que contém inibidores de protease e fosfatase aos pellets.

O volume de tampão de moagem adicionado deve ser equivalente ao peso do pellet. Congele o recipiente de moagem em nitrogênio líquido. Quando o nitrogênio líquido parar de ferver.

Use uma escápula para lascar o pellet e transferi-lo para o recipiente de moagem que contém rolamentos de esferas congelados. Moer os pellets a 600 RPM com um 22º ciclo de um minuto com uma inversão de direção por três minutos. Congele novamente o recipiente de moagem em nitrogênio líquido.

Repita a moagem mais quatro vezes por um total de 15 minutos. Tempo de moagem quando a moagem está completa para ambas as amostras. Colete a tâmara de moagem congelada em tubos de falcão de 50 mililitros e mantenha congelada em nitrogênio líquido ou em gelo seco.

Armazene a data de moagem em 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para uso. O isolamento e o fracionamento dos peptídeos começam com sua alquilação. O primeiro passo é solubilizar sua amostra na solução de ureia.

Transforme cada data de moagem em solução adicionando três volumes de tampão de ureia a um volume de data de moagem congelada. Por exemplo, três mililitros de tampão RIA são adicionados a um pellet de um grama. Com um mililitro de tampão PBS.

Sonicar imediatamente a mistura com a sonda. Dica sonicate. Mantenha a ponta perto do fundo do tubo para evitar a formação de espuma da solução.

A data de moagem deve entrar imediatamente em solução. Limpar os lisados por centrifugação a 6 000 rpm durante cinco minutos. A quatro graus Celsius, transfira o SUPINATE para tubos novos.

Para iniciar a reação de redução, adicione tris 0,5 molar recém-preparado, dois carboxila LITAL FOSFINA ou TCEP a cada amostra em uma diluição de um a 100. Para atingir uma concentração final de TCEP de cinco milimolares, incube as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação de 37 graus Celsius, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente.

Em seguida, adicionar um molar de acetamida de io recém-preparado a uma concentração final de 20 milimolares incubar no escuro durante uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora de incubação, extinguir a iota acetamida com 20 millimolares de TDT. Deixe em temperatura ambiente por uma hora.

Os lisados reduzidos e alquilados estão agora prontos para a digestão de tripsina. Neste ponto, as amostras dos lisados podem ser usadas para quantificação de proteínas, análise de página SDS para verificar a lise celular e análise de espectrometria de massa para validar a incorporação dos isótopos pesados. Para iniciar a digestão de tripsin, misture quantidades equivalentes de amostras isotopicamente pesadas e leves.

Diluir a amostra uma em cada quatro com 20% de metanol e adicionar tripsina em uma diluição de uma em 200. Incubar a amostra durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Depois de verificar a digestão completa por página SDS e coloração kumasi, seque a amostra em um aspirador rápido quando a amostra estiver seca.

A 200 microlitros de água destilada filtrada e vórtice até que o pellet entre em solução. Seque a amostra em um aspirador rápido e ressuspenda-a novamente com água destilada Depois de secar a amostra, mais uma vez, ressuspenda novamente o pellet em ácido acético Tri Fluor 0,1% ou TFA, verifique se o pH está em torno de três usando tiras de pH, se necessário. Acidifique com 10% de pellet de TFA qualquer precipitado.

A amostra digerida em tentina será agora dessalinizada usando uma coluna VAC 500 miligramas C 18 da embalagem de água. Para começar, hidrate a coluna com cinco mililitros, centrífuga de aceto nitrilo 100% a cerca de 200 vezes G ou a velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna. Em seguida, equilibre a coluna com cinco mililitros, 0,1% TFA carregue a amostra.

Tenha cuidado para não sobrecarregar a coluna e, se necessário, divida a amostra entre várias colunas. Recolha o fluxo em um recipiente de resíduos e carregue a coluna novamente, se necessário, lave com cinco mililitros, 0,1% TFA. Repita esta elução de lavagem com dois mililitros de 60% de aceto nitrilo 0,1% TFA EEU deve ser coletado por centrifugação.

Seque a amostra em um aspirador de velocidade, ressuspenda a amostra seca em 200 microlitros de solvente B. A amostra ressuspensa está agora pronta para fracionamento de peptídeos. Fracionar os peptídeos em uma coluna analítica TSK gel AMIDE 80 com uma coluna de proteção. Leve o seu tempo com um passo.

Execute a coluna por duas horas a 90% de solvente A e, em seguida, execute dois gradientes em branco antes de carregar sua amostra. Normalmente não carregamos mais de cinco miligramas por corrida em uma coluna desse tamanho, cromatografia líquida moderna e até não tão moderna. As máquinas permitirão o fluxo automatizado de coleta de fração de injeção de amostra, controle de taxa e misturas de gradiente.

Eles são definidos no início da execução, conforme descrito. Carregue 90%A em 20 minutos, 90%A a 85%A em cinco minutos, 85%A a 60%A em 40 minutos, 60%A a 0%a em cinco minutos e 0%A a 90%a em cinco minutos. Defina a taxa de fluxo em um mililitro por minuto e colete frações em intervalos de dois minutos.

Começando com as frações combinadas de gradiente de 85% A a 60% A para reduzir o número de frações para 10 frações aumentadas, provavelmente produzirá maior cobertura do proteoma fosfo. Os peptídeos fosfométricos são enriquecidos por cromatografia de metal imobilizado. Usamos o gel de afinidade de ferro phos select como resina iMac.

Primeiro Resus suspende pellets em 500 microlitros de solução de carga. Em seguida, adicione 15 microlitros de uma pasta de 50% a cada fração e incube as amostras por 30 minutos com rotação de ponta a ponta. Mantenha o fluxo para análise.

Lave a amostra três vezes com solução de carga e uma vez com 500 microlitros de água destilada filtrada após as lavagens, elua os peptídeos por dois a três minutos com 400 microlitros de 50 milimolares de tampão fosfato de sódio. Transfira os peptídeos eluídos para um frasco de vidro. Adicione cinco microlitros, ácido fórmico 100% aos peptídeos para acidificar a pH três ressuspender peptídeos fosfofos em 200 microlitros de 0,1% TFA e dessalinizar novamente com uma coluna C 18 conforme descrito anteriormente, secar as amostras aludidas em um aspirador rápido.

Finalmente, ressuspenda os peptídeos fosfofóricos em 20 microlitros de ácido fórmico a 0,1%. As amostras estão agora prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massa. Um traço gráfico cromático do fracionamento de peptídeos celulares totais usando cromatografia HILC é mostrado aqui.

Pode-se observar neste traço que, embora os peptídeos fosfofóricos sejam encontrados em todo o perfil eluciano, a maior parte dos resíduos fosforilados é retida até perto do final do perfil eluciano. Acabamos de mostrar como triturar células, digerir proteínas, peptídeos fracionados e enriquecer peptídeos fosfofóricos usando cromatografia de afinidade de metal imobilizado. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de preservar a fosforilação e verificar as soluções de pH da cerveja.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.