Name: Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Aprenda fosfoproteômica quantitativa em Saccharomyces cerevisiae usando cromatografia HILIC e enriquecimento IMAC. Este método robusto permite analisar fosfopeptídeos marcados metabolicamente por espectrometria de massas.

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Gostaríamos de agradecer a Dr. Rich Rogers de assistência técnica com análises de espectrometria de massa e discussões úteis, e as Dras. Rob Moritz, Jeff Ranish, e Hamid Mirzai para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelo NIH Centros de Excelência.

Crescimento celular e media <ol><li> Uma única colônia de células BY4742Δarg4Δlys1 overnight em 100 mL de rich media para um OD 600 de 1,0 sementes, em seguida, em duas culturas 1 litro de um meio de levedura mínimo (0,17% Base de Dados de nitrogênio fermento sem sulfato de amônio ou Aminoácidos, sulfato de amônio 0,5%), contendo uma conjunto completo de aminoácidos, suplementado com L / 20mg de arginina isotopicamente normal ou pesado (13 C 6 15 N 4; Isotec) e lisina (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> As células foram cultivadas por 18 horas, para um OD 600 de 1.8. É fundamental que as células passam por pelo menos 9 gerações para alcançar a plena incorporação dos isótopos rotulados. A amostra foi peletizada luz, lavados com água estéril, reseeded em um meio contendo oleato (arginina isotopicamente normal e lisina, oleato de 0,2% (Sigma Chemicals) e 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) e estimulado por outros 85 minutos. Isso gera uma isotopicamente leve, com respeito a arginina e lisina, oleato estimulada amostra e uma amostra de referência isotopicamente pesada glucose-grown. </li></ol> Lise celular, Isolamento e fracionamento de Peptídeos <ol start="3"><li> Pesar garrafa centrífuga. Colheita de amostras por centrifugação por 3 minutos. Remova a mídia e aspirar o excesso de líquido. Pesar pellet e garrafa (normalmente rendimento entre 1-2 gramas), em seguida, congelar flash em nitrogênio líquido. Adicionar um volume equivalente a pelota peso de &#39;moer&#39; buffer para as pelotas congelados em nitrogênio líquido (Phosphate Buffered Saline (PBS, Gibco), 10% glicerol, inibidores da protease (Comprimidos Inibidor da Protease SigmaFAST, Sigma) e HALT inibidores de fosfatase (Thermo Scientific )). </li><li> Congelar o navio de moagem em nitrogênio líquido. Aguarde até que o nitrogênio líquido deixa ferver. Transferir a pelota para o navio de moagem, com rolamentos de esferas congelada. </li><li> Moagem de 600 rpm com um ciclo de 1 min 20 sec com uma inversão direção por 3 minutos. Recongelar o navio de moagem em nitrogênio líquido. Repita 4 vezes mais por 15 minutos tempo de moagem total. </li><li> Recolher o grindate congelados em um tubo de 50ml de gelo lugar Falcon seco. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Fazer uma solução de 10ml de 8M uréia, bicarbonato de amônio 0,1 M, 0,1 M Tris pH 8.6. Adicionar 3 volumes do buffer de uréia para 1 volume do grindate congelados (por exemplo 3mls do buffer de uréia adicionados a um 1 grama pellet com 1 ml de tampão PBS). Sonicate imediatamente a mistura com um sonicador ponta da sonda (2 - 10 pulsos segundo). Manter a ponta na parte inferior do tubo para evitar a formação de espuma da solução. O grindate deve imediatamente entrar em solução. </li><li> Limpar o lisado por centrifugação por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Transfira o sobrenadante para tubos fresco. </li><li> Faça uma nova porção de Tris 0,5 M [2-carboxietil] fosfina (TCEP). Adicionar ao da amostra em 1:100 para uma concentração 5mM final. Incubar a 37 ° C por 1 h. </li><li> Alquilação de cisteínas reduzidas. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. Faça uma nova porção da iodoacetamida 1M. Manter no escuro (que envolva o tubo em papel alumínio). Adicionar a uma concentração final de 20mM. Incubar no escuro por 1 h em temperatura ambiente. </li><li> Saciar a iodoacetamida com DTT 20mM de um estoque 1M em temperatura ambiente por 1 h. </li><li> Quantificar a proteína com um padrão ou Bradford ensaio BCA (não descritos). Tomar uma amostra para análise por SDS-PAGE abaixo. </li><li> Para validar a incorporação dos isótopos pesados, use 100 ml do lisado reduzidos e alquilados. Diluir 1:4 com dH 2 O, sonicate e adicione tripsina em 50:1 proteína para tripsina. Digest para um mínimo de 4 horas, amostra seca para baixo em uma velocidade vac e depois desalt com colunas Ultramicrospin C18 (Grupo A Nest). <ol><li> Coluna hidratado com 100 ml de Acetonitrila </li><li> Equilibrar com 200 mL TFA 0,1%. </li><li> Ressuspender amostra seca em 200 mL TFA 0,1%. Carga para coluna. Centrifugar a 200 xg ~ ou a velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna. </li><li> Lavar duas vezes com 200 mL TFA 0,1%. </li><li> Eluir com duas vezes com 50 mL Acetonitrila 60%, TFA 0,1%. </li><li> Amostra seca em uma velocidade vac. </li><li> Amostra ressuspender em 20 mL de ácido fórmico 0,1%. Executar 2 l em um espectrômetro de massa. Verifique incorporação de arginina e lisina isotopicamente pesado por uma mudança Dalton 10 e 8 no espectro m / z respectivos. A incorporação de cada aminoácido deve estar entre 96-98%. </li></ol></li><li> Misture quantidades equivalentes (mg de proteínas) das amostras isotopicamente leves e pesados. </li><li> Diluir a amostra 1:4 com metanol 20%. </li><li> Adicionar tripsina 1:200. Incubar durante a 37 ° C. </li><li> Verificar que a digestão tem ido até a conclusão por PAGE SDS. Executar 2 e 4 mL da amostra predigestion e 8 umd mL 16 da tripsina pós digerir. Visualize por coloração Coomassie que a digestão é completa. Se ele não estiver completo, sonicate a amostra com um breve sonicador ponta da sonda e digerir novamente com tripsina. </li><li> Secar a amostra para baixo em uma velocidade vac. Ao adicionar a seco de 200 mL filtrado dH 2 O e vortex até o pellet entra em solução. Amostra seca para baixo em uma velocidade vac. Ressuspender novamente com dH 2 O. Seco da amostra novamente. </li><li> Ressuspender pellet em 0,1% Ácido Trifluoracetic (TFA; Sigma). Verifique se o pH é de cerca de 3 usando tiras de pH. Se necessário acidificar o meio com TFA 10%. </li><li> Pellet qualquer precipitado. </li><li> Dessalinizar as amostras em um Waters Sep-Pak Vac coluna C18 de 500 mg. Não sobrecarregue as colunas. A quantidade máxima é de 5 mg, mas é melhor carregar um pouco menos. Dividir a amostra entre várias colunas se necessário. <ol><li> Coluna o hidrato com 5 ml de acetonitrila 100%. Centrifugar a 200 xg ~ ou a velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna. </li><li> Equilibrar coluna com TFA 0,1% 5ml. Carga da amostra. Colete de fluxo e de carga novamente. </li><li> Lavar com 5 ml TFA 0,1%. Repetir. </li><li> Eluir com 2ml Acetonitrila 60%, TFA 0,1%. </li><li> Amostra seca para baixo em uma velocidade vac. </li></ol></li></ol> Fracionamento e Isolamento de peptídeo Fosfopeptídeos <ol><li> Peptídeos são fracionado em uma coluna HILIC. Nós usamos um TOSOH TSK Gel-amida-80 4,6 milímetros x 25 cm coluna analítica com uma coluna de guarda. Leve o seu tempo com este passo, execute a coluna por 2 horas a 90% A em seguida, executar dois gradientes em branco antes de colocar a sua amostra. A carga máxima em uma coluna deste tamanho é pensado para ser em torno de XX, que normalmente não carregar mais de 5 mg por corrida. </li><li> Um solvente - 98% ACN/0.1% TFA Solvente B - 2% ACN/0.1% TFA Carga em 90% A mais de 20 &#39;, 90% A 85% A mais de 5&#39;, 85% A 60% A mais de 40 &#39;, 60% A para 0% A mais de 5&#39;, 0% A% a 90 A mais 5 &#39;. </li><li> A taxa de fluxo é 1mL/min e frações foram coletadas em intervalos de 2 minutos, começando às 85% a 60% A um gradiente. </li><li> Combine frações para reduzir o número de fracções a 10. Frações aumentou, provavelmente, maior rendimento de cobertura do phosphoproteome. </li></ol> Enriquecimento de fosfopeptídeos <ol><li> Fosfopeptídeos são enriquecidos com PHOS-Select Gel de Afinidade de Ferro. Nós alíquota nossa resina IMAC para evitar congelar repetido descongelamento. Fazer 50 mls de um ácido acético 250 mM, a solução de carga de 30% ACN. Trazer o pH para 2,7 com HCl. Ressuspender pellets em 500 ml de solução de carga. Verificar o pH, ajuste com HCl ou NaOH, conforme necessário. </li><li> ML de pré-lavagem de 200 contas IMAC em uma coluna apropriada. Usamos colunas giram Molbiotec. Adicionar 15 mL de uma suspensão de 50% (gel para carregar solução) a cada fração, e incubar as amostras de 30 &#39;com final mais rotação final. Manter o fluxo para análise. </li><li> Lavar as amostras 3 vezes com solução de carga e uma vez com 500 mL filtrado dH 2 O. </li><li> Peptídeos eluir com 2 - 3 min com 400 mL de 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffer. Transferir para um frasco de vidro. </li><li> Acidificar a pH 3 com 5 mL de ácido fórmico 100%, congelamento de flash em nitrogênio líquido, e amostra seca para baixo em uma velocidade vac. </li><li> Fosfopeptídeos ressuspender em 200 mL de TFA 0,1% e C18 limpo como descrito acima. Seco para baixo amostras eluídas em uma velocidade vac. </li><li> Ressuspender peptídeos em 20 l de 0,1% de ácido fórmico. Use 2 mL por análise de espectrometria de massa ou conforme necessário. </li></ol> Notas Durante boa parte deste protocolo que você estará trabalhando &quot;cega&quot;. A lise celular pode ser monitorada por Western Blotting e ensaios Bradford ou BCA, ea digestão com tripsina também pode ser facilmente avaliada. A coluna vai HILIC deu um traço semelhante a esta, ou como pode ser visto por outros [1, 2] dependendo da máquina de cromatografia líquida que é usado. Amostras são monitorados por espectrometria de massa, teste a sua amostras em máquinas de baixo custo, tais como LCQs ou MALDIs antes de ir para as análises de custo alto de uma massa de alta precisão, máquina de alta resolução. Finalmente, se você uma secagem para baixo uma amostra com ácido nele, use vidro.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Este método irá produzir um enriquecimento da fosfopeptídeos que podem ser analisadas quantitativamente. Um número de parâmetros podem ser alterados neste protocolo, mas o aspecto mais importante a lembrar é o de preservar a sua fosforilação. Preparação de células para a quantificação pode ser alcançado em um número de diferentes maneiras, por exemplo, se você não pode rotular suas células in vivo, tags, tais como ICAT [3] ou ITRAC [4] pode ser usado extração post para diferencialmente etiqueta de duas culturas...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginina-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lisina-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) 7,4 (10X) líquida</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos SigmaFAST de Inibidor de Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail de Inibidor de Fosfatase Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de Bolas Retsch PM100</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Pote de Moagem de Aço Inoxidável Retsch 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Coluna Ultramicrospin C18</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>Coluna analítica TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Esta é a coluna cromatográfica HILIC.</td></tr><tr><td>Coluna de proteção 4,6 mm de diâmetro interno x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Recomendamos esta coluna de proteção para prolongar a vida útil da sua coluna HILIC.</td></tr><tr><td>Gel de Afinidade por Ferro PHOS-Select&amp;#8482;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Esta é a resina IMAC. Aliquotar e armazenar.</td></tr></tbody></table>

phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo descreve o crescimento e estímulo, com o oleato de ácidos graxos, de células de Saccharomyces isotopicamente leves e pesados ​​S.. Células são solo usando um procedimento cryolysis em um moedor de moinho de bolas e os grindate resultando colocada em solução de solubilização da uréia. Este procedimento permite a lise das células em um estado metabolicamente inativas, preservando fosforilação e evitando reorientação da phosphoproteome durante a lise celular. Após a redução, alquilação, digestão com tripsina das proteínas, as amostras são dessalinizada em colunas C18 e da complexidade amostra reduzida por fracionamento através de cromatografia de interação hidrofílica (HILIC). Colunas HILIC preferencialmente reter moléculas hidrofílicas que é bem adequado para phosphoproteomics. Peptídeos fosforilados tendem a eluir mais tarde no perfil cromatográfico do que as contrapartes não fosforilado. Após o fracionamento, fosfopeptídeos são enriquecidos por cromatografia em fase de metal imobilizado, que conta com carga baseada em afinidades de enriquecimento fosfopeptídeos. No final deste procedimento as amostras estão prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massa.

Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo descreve o crescimento e a estimulação, com o ácido graxo oleato, de células de S. cerevisiae isotopicamente pesadas e leves. As células são trituradas...

A fosforilação é um mecanismo-chave de sinalização celular que regula processos desde a localização proteica até a transcrição do DNA, e o estudo exclusivo do fosfoproteoma por espectrometria de massas é um avanço empolgante no estudo da sinalização e da proteômica. Células com marcação diferencial são lisadas por meio de lise em um moinho de bolas, seguida por redução, alquilação, mistura e digestão. Os peptídeos digeridos são fracionados por cromatografia de interação hidrofílica e os peptídeos fosforilados são enriquecidos a partir das frações por enriquecimento com iMac.As frações enriquecidas em peptídeos fosforilados são então identificadas por msm. Olá, eu sou Ramsey Celine do grupo E do Instituto de Biologia da Persistência. Hoje vamos mostrar um procedimento para a extração de peptídeos fosforilados metabolicamente marcados.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar quantitativamente o proteoma da fossa. Então, vamos começar. Este procedimento inicia-se com o cultivo de células de levedura isotopicamente leves e pesadas.Primeiro, inocular 100 mililitros de meio rico com uma única colônia de células de levedura. Crescer essa cultura durante a noite até uma DO 600 de 1,0. Em seguida, utilizá-la para semear duas culturas de um litro de meio mínimo contendo um complemento completo de aminoácidos e suplementado com 20 miligramas por litro de isótopos.Cultive em paralelo um litro de culturas com arginina e lisina normais ou com isótopos pesados por 18 horas até uma OD 600 de 1,8. É fundamental que as células passem por pelo menos nove gerações para garantir a incorporação completa dos isótopos marcados. Quando as células tiverem incorporado completamente os isótopos marcados, centrifugue as células cultivadas no meio contendo arginina e lisina com isótopos normais.Para obter um pellet celular, lave o pellet com água estéril e ressuspenda em um meio contendo oleato com arginina e lisina isotopicamente normais e estimule por 85 minutos. Isso produz uma amostra estimulada com oleato isotopicamente leve. A outra cultura cultivada em meio com arginina e lisina isotopicamente pesadas não é estimulada com oleato e servirá como amostra de referência cultivada em glicose isotopicamente pesada.Para coletar um litro, o cultivo é distribuído entre quatro tubos de centrífuga de 250 mililitros. Após a centrifugação, as células são reunidas em um único tubo removendo ou deixando apenas 100 mililitros do meio de ressuspensão celular e transferindo para o próximo tubo. Ao final, um grande pellet é coletado em um único tubo de centrífuga por três minutos a 4.000 RPM.Após a remoção do meio, o peso do frasco de centrífuga e do pellet é comparado ao de um frasco de centrífuga vazio. Após a centrifugação, remova o meio e aspire o líquido excedente dos frascos, pese os pellets e um rendimento típico está entre um e dois gramas. Em seguida, congele rapidamente os pellets em nitrogênio líquido e adicione tampão de homogeneização que contém inibidores de protease e fosfatase aos pellets.O volume do tampão de moagem adicionado deve ser equivalente ao peso do pellet. Congele o recipiente de moagem em nitrogênio líquido. Quando a ebulição do nitrogênio líquido cessar.Use uma espátula para quebrar o pellet e transfira-o para o recipiente de moagem que contém esferas de aço congeladas. Moa os pellets a 600 RPM com um ciclo de um minuto e 22 segundos com inversão de direção por três minutos. Recongele o recipiente de moagem em nitrogênio líquido.Repita a moagem mais quatro vezes, perfazendo um total de 15 minutos. Tempo de moagem quando a moagem estiver concluída para ambas as amostras. Colete a data da moagem congelada em tubos falcon de 50 mililitros e mantenha congelada, seja em nitrogênio líquido ou em gelo seco.Armazene a data da moagem a menos 80 graus Celsius até o momento do uso. O isolamento e a fracionamento dos peptídeos iniciam-se com sua alquilação. O primeiro passo é solubilizar sua amostra na solução de ureia.Coloque cada data de moagem em solução adicionando três volumes de tampão de ureia a um volume da data de moagem congelada. Por exemplo, adicionam-se três mililitros de tampão RIA a um pellet de um grama. Com um mililitro de tampão PBS.Sonicar imediatamente a mistura com a sonda. Utilizar a ponta da sonda. Manter a ponta próxima ao fundo do tubo para evitar a formação de espuma na solução.A data de moagem deve ir imediatamente para a solução. Clarifique os lisados por centrifugação a 6.000 RPM durante cinco minutos. A quatro graus Celsius, transfira o SUPINATE para tubos frescos.Para iniciar a reação de redução, adicione tris recém-preparado 0,5 molar, dois carboxil LITAL PHOSPHINE ou TCEP a cada amostra em uma diluição de um para 100. Para obter uma concentração final de TCEP de cinco milimolar, incube as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação a 37 graus Celsius, deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente.Em seguida, adicione iodoacetamida recém-preparada 1 M para obter uma concentração final de 20 milimolares, incube no escuro durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação de uma hora, interrompa a reação com iodoacetamida usando DTT 20 milimolar. Deixe à temperatura ambiente por uma hora.Os lisados reduzidos e alquilados estão agora prontos para a digestão com tripsina. Neste ponto, amostras dos lisados podem ser usadas para quantificação proteica, análise em gel de SDS-PAGE para verificar a lise celular e análise por espectrometria de massas para validar a incorporação dos isótopos pesados. Para iniciar a digestão com tripsina, misture quantidades equivalentes das amostras isotopicamente pesadas e leves.Dilua a amostra em uma proporção de um para quatro com metanol 20% e adicione tripsina em uma diluição de um para 200. Incube a amostra durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Após verificar a digestão completa por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e coloração com comassie, seque a amostra em um evaporador à vácuo quando estiver seca.Adicione 200 microlitros de água destilada filtrada e vortex até que o precipitado entre em solução. Seque a amostra em um evaporador à vácuo e reconstitua novamente com água destilada. Após secar a amostra novamente, reconstitua o precipitado em ácido trifluoroacético 0,1% ou TFA, verificando se o pH está em torno de três, utilizando tiras de pH, se necessário. Acidifique com TFA 10% e precipite qualquer resíduo.A amostra digerida com tripsina será agora dessalinizada utilizando uma coluna VAC C18 de 500 miligramas. Para começar, hidrate a coluna com cinco mililitros de acetonitrila a 100%, centrifugando a aproximadamente 200 × g ou na velocidade mínima necessária para o fluxo através da coluna. Em seguida, equilibre a coluna com cinco mililitros de TFA 0,1% e aplique a amostra.Tenha cuidado para não sobrecarregar a coluna e, se necessário, divida a amostra entre múltiplas colunas. Colete o fluxo em um recipiente de resíduos e carregue a coluna novamente, se necessário, lavando com cinco mililitros de TFA 0,1%. Repita essa lavagem e elua com dois mililitros de acetonitrila 60% contendo TFA 0,1%. A EEU deve ser coletada por centrifugação.Seque a amostra em um evaporador a vácuo e reconstitua a amostra seca em 200 microlitros do solvente B. A amostra reconstituída está agora pronta para a fracionamento de peptídeos. Fracione os peptídeos em uma coluna analítica TSK gel AMIDE 80 com coluna de proteção. Tenha cuidado durante este passo.Execute a coluna por duas horas com 90% do solvente A, depois realize dois gradientes em branco antes de carregar sua amostra. Normalmente, não carregamos mais de cinco miligramas por corrida em uma coluna deste tamanho, seja em cromatografia líquida moderna ou menos moderna. As máquinas permitem injeção automatizada de amostras, coleta de frações, controle de fluxo e misturas em gradiente.Esses gradientes são definidos no início do processo, conforme descrito. Carregue com 90%A por 20 minutos, 90%A para 85%A em cinco minutos, 85%A para 60%A em 40 minutos, 60%A para 0%A em cinco minutos e 0%A para 90%A em cinco minutos. Ajuste a vazão para um mililitro por minuto e colete as frações em intervalos de dois minutos.Com base no gradiente de 85% A a 60% A, combine as frações para reduzir o número de frações a 10; frações aumentadas provavelmente proporcionarão maior cobertura do fosfoproteoma. Os peptídeos fosforilados são enriquecidos por cromatografia com metal imobilizado. Utilizamos o gel de afinidade para fósforo com ferro como resina iMac.Primeiro, ressuspender os pellets em 500 microlitros de solução de carga. Em seguida, adicionar 15 microlitros de uma suspensão a 50% a cada fração e incubar as amostras por 30 minutos com rotação de ponta a ponta. Manter o fluxo para análise.Lave a amostra três vezes com solução de carga e uma vez com 500 microlitros de água destilada filtrada; após as lavagens, elua os peptídeos por dois a três minutos com 400 microlitros de tampão de fosfato de sódio 50 milimolar. Transfira os peptídeos eluídos para um frasco de vidro. Adicione cinco microlitros de ácido fórmico a 100% aos peptídeos para acidificar até pH 3, reconstitua os peptídeos fosforilados em 200 microlitros de TFA 0,1% e dessalte novamente com uma coluna C18 conforme descrito anteriormente; seque as amostras eluídas em um speed vac.Por fim, ressuspenda os peptídeos fosforilados em 20 microlitros de ácido fórmico 0,1%. As amostras estão agora prontas para serem analisadas quantitativamente por espectrometria de massas. Um traçado gráfico cromático da fracionamento de peptídeos celulares totais utilizando cromatografia H-I-L-I-C é mostrado aqui.Pode-se observar neste traçado que, embora os peptídeos fosforilados estejam presentes em todo o perfil de eluição, a maior parte dos resíduos fosforilados é retida até próximo ao final do perfil de eluição. Acabamos de mostrar como homogeneizar células, digerir proteínas, fracionar peptídeos e enriquecer peptídeos fosforilados utilizando cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preservar a fosforilação e verificar o pH das soluções Beer.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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