Name: Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de invasão tumoral in vitro usando células HT 1080 e NIH 3T3 em membranas com matrigel. Este método fluorescente permite quantificar a migração celular através da barreira de membrana basal.

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Pós-rotulagem e medição utilizando BD calceína AM corante fluorescente Células são rotulados para quantificação depois de terem invadido através do Matrigel BD Matrix e atravessou a membrana FluoroBlok BD. Como resultado, apenas a medição de ponto de extremidade de invasão das células podem ser obtidas. <ol><li> Cultivar células para ~ confluência de 80%. </li><li> Preparar e hidratar o sistema de inserção. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Remover o pacote de armazenamento de -20 ° C e deixe-o voltar à temperatura ambiente. </li><li> Abrir a embalagem de alumínio e adicionar 500 mL quente (37 ° C) de mídia para o interior dos poços de inserção. Permitir que a placa para hidratar por 2 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Nota: Não é necessário para reidratar o não revestido BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Sistema Insert que será usado como um controle de migração celular. </li><li> Após a reidratação, remova cuidadosamente o meio dos poços de inserção sem perturbar a camada de BD Matrigel Matrix na membrana. O sistema está agora pronto para uso. </li></ol></li><li> Preparar suspensões de células por trypsinizing monocamadas de células e ressuspender as células no soro livre de DMEM com 5 x 10 4 células / mL. Nota: Se você estiver usando um tipo de célula diferente que você precisa para determinar a densidade de semeadura ideal. Para determinar a densidade de semeadura ideal para o seu tipo de célula em uma superfície porosa crescimento, use uma gama de densidades de semeadura (células / cm 2) que a densidade de semeadura suportes usados ​​em superfícies não porosas (ou seja, frascos, pratos e placas). Por exemplo, se você semente atualmente em 2,5 x 10 5 células / cm 2, as sementes em concentrações de células diferentes entre 5 x 10 4 e 5 x 10 5 células / cm 2 para determinar a densidade de semeadura ideal inicial. </li><li> Adicionar 500 mL de suspensão de células (2,5 x 10 4 células) para as câmaras apical. </li><li> Adicionar 750 mL de chemoattractant (5% FBS em DMEM) para cada uma das câmaras basal, usando as portas de amostra para o acesso. </li><li> Incubar a BioCoat BD Sistema invasão tumoral e os não revestidos BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Placa Insert para 20-22 horas a 37 ° C, 5% CO 2 atmosfera. </li><li> Após a incubação, remova cuidadosamente médio das câmaras apical. Isso pode ser feito por flicking o conteúdo em um recipiente de resíduos. Não toque na superfície inferior do sistema de inserção. </li><li> Transferir o sistema de inserção em uma placa de 24 poços contendo 500 mL segundo / poço de 4 mcg / ml em HBSS calceína AM. Incubar por 1 hora a 37 ° C, 5% CO 2. A solução calceína AM não é removido da câmara baixa antes da leitura de fluorescência, porque é um corante vital nonfluorescent que é convertido em calceína verde fluorescente por esterases citosólicas. </li><li> Fluorescência das células invadidas é lido em comprimentos de onda de 494/517 nm (Ex / Em) em um leitor de placas de baixo para leitura fluorescente. O ajuste de ganho pode precisar de ser determinada empiricamente, mas um ganho de ponto médio deve ser um ponto suficiente para o arranque. Um ajuste de ganho que é muito alta pode levar a saturação do detector com amostra altamente fluorescentes, o que pode impedir a aquisição de resultados significativos. Uso de autogain (se suportada pelo seu leitor) não é recomendado. Um microscópio invertido de fluorescência pode ser usada para verificar os resultados, é especialmente útil para fazer isso na primeira vez que executar este ensaio. Nota: É de extrema importância que os Sistemas de Inserção são lidos usando o mapa da placa correta. Para obter informações sobre mapas placa de carregamento ver BD Boletim Técnico n º 436 em www.bdbiosciences.com ou BD contato com o Suporte Técnico (labware@bd.com). Orientação placa correta é com o bem A1 no canto superior esquerdo eo logotipo da BD Flacon orientada para a direita como a placa é inserido no leitor. </li></ol> Redução de dados Os dados são expressos como na seguinte equação: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Equação" /> De fundo pode ser subtraído antes do cálculo da invasão celular por cento RFU = relativo unidades fluorescentes.

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

Os autores são funcionários da BD Biosciences que produz reagentes e ferramentas utilizadas neste artigo.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Invasão Tumoral BD BioCoat</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 ou 354166</td><td></td></tr><tr><td>Células HT-1080 e NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio Essencial Modificado de Dulbecco&amp;rsquo;s (DMEM; sem soro)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco&amp;rsquo;s, sem cálcio e magnésio (DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Insertos Multipoços BD Falcon FluoroBlok de 24 poços, para ser usado como controle de migração celular</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 ou 351158</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal a 5% em DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corante Fluorescente BD Calcein AM</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 ou 354217</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Equilibrada de Hanks&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas BD Falcon de 24 poços para marcação pós-invasão celular</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas com fluorescência com capacidade de leitura por baixo</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um in vitro fluoroblok assay invasão tumoral

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

A marca de células metastáticas é a sua capacidade de invadir através da membrana basal e migrar para outras partes do corpo. Células devem ser capazes de secretar proteases tanto que quebram a membrana basal, assim como migrar a fim de ser invasivo. BD BioCoat Sistema de invasão do tumor fornece células com condições que permitam a avaliação de suas propriedades invasivas<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Consiste em um BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços com uma Placa Inserir micron membrana de poros 8,0 PET tamanho que tem sido uniformemente revestida com BD Matrigel Matrix. Esta camada uniforme de BD Matrigel Matrix serve como uma membrana basal reconstituída<em&gt; In vitro</em&gt; Proporcionando uma verdadeira barreira para não-invasivo de células ao apresentar uma estrutura de proteína apropriada para estudar invasão. O processo de revestimento oclui os poros da membrana, o bloqueio não-invasivo de células de migrar através da membrana. Em contraste, as células invasoras são capazes de se separar e migrar através da membrana revestida. Quantificação de invasão celular pode ser alcançado por qualquer rotulagem invasão pré ou pós-célula com um corante fluorescente, como CIID<sub&gt; 12</sub&gt; (3) ou calceína AM, respectivamente, e medir a fluorescência das células invasoras. Desde o BD membrana FluoroBlok efetivamente bloqueia a passagem da luz 490-700 nm em&gt; 99% de eficiência, fluorescente marcado células que não têm invadido não são detectados por um leitor de placa inferior leitura de fluorescência. No entanto, as células que invadiram a parte inferior da membrana não são mais protegidos contra a fonte de luz e são detectados com o leitor de placas respectivas. Este vídeo demonstra um ponto final do ensaio de invasão celular, usando calceína AM para detectar células invadidas.

Este vídeo demonstra como medir a invasão celular por meio de inserções de cultura celular utilizando uma metodologia baseada em fluorescência.

Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral

A característica marcante das células metastáticas é a sua capacidade de invadir a membrana basal e migrar para outras partes do corpo. As células devem ser capazes de...

A invasão celular é uma etapa importante na progressão do câncer e na angiogênese. Ensaios de invasão in vitro geralmente avaliam a capacidade das células de degradar a membrana basal reconstituída, como matriz BD, matriz em gel, e migrar através de insertos de cultura celular. O ensaio de invasão tumoral começa quando as células são adicionadas aos insertos Fluor block revestidos com matri gel.Um quimioatraente de membrana basal reconstituída é adicionado à câmara basal e o sistema é incubado. Durante a noite, as células invasivas serão capazes de degradar a barreira de gel de matriz e atravessar a membrana do bloco de flora, uma membrana especializada que protege o Fluor da luz ambiente. O conteúdo da câmara apical é descartado e o inserto de múltiplas poças é adicionado a uma segunda placa contendo um Fluor.Após a incubação, as células viáveis são coradas e podem ser detectadas visualmente e por meio de um leitor de microplacas. Olá, sou Jeff Partridge da BD Biosciences Discovery LabWare. Hoje vamos mostrar um procedimento para o ensaio de invasão de tumor em bloco de piso.Utilizamos este procedimento para estudar a invasão de células tumorais através de uma membrana basal em direção ao quimioatraente. Vamos começar. Cultive as células para o ensaio de invasão tumoral até cerca de 80% de confluência.Neste experimento, utilizaremos as linhagens celulares HT 10 80 e N NIH três T três. As células HT 10 80 demonstraram ser capazes de migrar e invadir a barreira de matrigel no sistema, servindo assim como bons controles positivos para o ensaio. As células NIH três T três não são invasivas, mas realizam migração, servindo portanto como bons controles negativos para este procedimento.Para começar, reidrate o sistema do ensaio removendo o pacote do sistema de invasão tumoral BD BioCoat do armazenamento a menos 20 graus Celsius e deixe atingir a temperatura ambiente. Como o ensaio exige técnica estéril, deixe o inserto atingir a temperatura ambiente na câmara de cultura tecidual. Uma vez que o pacote esteja à temperatura ambiente, abra-o para reidratar a membrana basal através da qual suas células de interesse podem passar.Adicione 500 microlitros de meio quente ao interior dos poços do inserto e deixe a placa reidratar por duas horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Não é necessário reidratar a placa de inserto multipoço BD Falcon Flora Block 24 não revestida, pois ela será usada como controle de migração celular para preparar as células para o ensaio de invasão. Triesina as monocamadas celulares e ressuspenda as células em DMEM sem soro a cinco vezes 10 à quarta células por mililitro.Se um tipo diferente de célula for utilizado, a densidade ideal de semeadura deverá ser determinada empiricamente. Após a reidratação da placa revestida, remova cuidadosamente o meio dos poços do inserto sem perturbar a camada de gel de MA na membrana. O sistema agora está pronto para ser utilizado.Não permita que a camada de gel MA seque. Para iniciar o ensaio de invasão celular, adicione 500 microlitros de cada suspensão celular às câmaras apicais do sistema de invasão tumoral nas configurações com e sem revestimento de matrigel. Em seguida, utilizando os orifícios de amostragem para acesso, adicione 750 microlitros de quimioatraente às câmaras basais nas placas com e sem revestimento.É extremamente importante não introduzir bolhas ao preencher as câmaras basais. Como controle de migração, adicione cada suspensão celular, bem como o quimioatraente, à placa de inserção BD Falcon Flora Block 24 Multi WA não revestida. Incube o Sistema de Invasão Tumoral e a placa de inserção Falcon Flora Block 24 Multi WA não revestida por 20 a 22 horas a 37 graus Celsius, em atmosfera de 5% de dióxido de carbono, no dia seguinte.Quando a incubação estiver concluída, as células estarão prontas para serem marcadas com um corante fluorescente de cálcio am. Remova cuidadosamente o meio das câmaras apicais descartando o conteúdo em um recipiente de resíduos. Em seguida, transfira imediatamente o sistema de inserto para uma segunda placa de 24 poços contendo 500 microlitros por poço de quatro microgramas por mililitro.O cálcio está na solução salina balanceada de Hank. Repita estes passos com o controle de migração. Incube as placas por uma hora a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono.Não toque na superfície inferior do sistema de inserto. Ao final da incubação de uma hora com cálcio, a fluorescência das células invasoras pode ser medida. É de extrema importância que os sistemas de inserto sejam lidos utilizando o mapa de placa correto.A orientação correta da placa é com o poço A1 no canto superior esquerdo e o logotipo BD Falcon orientado para a direita enquanto a placa é inserida no leitor. A fluorescência é lida em comprimentos de onda de 494 e 517 nanômetros em um leitor de placas fluorescente com leitura pela parte inferior. Você deve verificar seus resultados com um microscópio de fluorescência invertido para garantir que os dados do leitor de placas correspondam aos resultados visuais. Esses são dados típicos de leitor de placas obtidos de uma placa revestida e de uma placa controle não revestida, provenientes de ensaios de invasão celular das duas linhagens celulares HT 10 80 e NIH 3T3.Os dados de poços sem células representam o fundo que pode ser subtraído antes do cálculo da porcentagem de invasão celular. Calcule a porcentagem de invasão utilizando a seguinte equação. A porcentagem de invasão equivale à média das unidades relativas de fluorescência ou rfu das células que atravessaram a membrana revestida com matrigel em direção ao quimioatraente.Isso é dividido pelo valor médio de RFU das células que migraram através da membrana do bloco VD não revestida em direção ao quimioatraente. Esse valor é então multiplicado por 100. Este gráfico mostra a comparação da porcentagem de invasão celular entre as células HT 10 80 e NIH 3T3, e, como é possível observar, as células HT 10 80 são invasivas, enquanto as células NIH 3T3 não são.Quando as células são analisadas em um microscópio fluorescente invertido, os resultados são consistentes com aqueles obtidos no leitor de microplacas. As células invasivas HT 10 80 invadiram através do matrigel, bem como migraram através da membrana não revestida. Em contraste, as células não invasivas NIH three T three não invadiram através do matrigel, mas migraram através da membrana não revestida.Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de invasão tumoral em bloco floral. Ao realizar este procedimento, é importante manter as placas na posição horizontal e minimizar a formação de bolhas. Isso pode afetar seus resultados.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

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Biologia

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