Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

A depleção do complemento é um método rápido, eficaz e econômico para purificar populações de células imunes. A depleção do complemento começa quando anticorpos monoclonais IgM ou IgG são adicionados a uma população celular, os quais direcionam um tipo celular específico. Neste exemplo, vamos direcionar as células T para depleção.

O sistema complemento é então adicionado, iniciando uma cascata proteolítica, que resulta na morte das células T. A população celular é então lavada por centrifugação e filtrada para eliminar células mortas e debris. Esse método de esgotamento por complemento geralmente resulta na eliminação de 95 a 100% da população celular alvo.

Olá, sou Bonnie Dittle. Sou pesquisadora no Blood Research Institute do Blood Center of Wisconsin, localizado em Milwaukee. Hoje vou mostrar a vocês a técnica de esgotamento por complemento, um método rápido e de baixo custo para a remoção de populações celulares específicas.

Utilizamos esta técnica em meu laboratório para enriquecer altamente populações de células imunes, as quais utilizamos em diversos bioensaios, incluindo aqueles que envolvem ativação celular e análise de expressão proteica. Vamos então começar. Antes de iniciar o experimento, prepare alíquotas de 0,5 ou um mililitro de complemento de coelho e armazene em um congelador a menos 20 ou menos 80 graus Celsius.

Certifique-se de titular o complemento em uma diluição ideal entre 1:10 e 1:20. Uma excelente fonte comercial de complemento que usamos rotineiramente é a Pereze Biologicals. Para este procedimento, anticorpos monoclonais de camundongo e de coelho são geralmente eficazes na ativação do complemento, mas nem todos os anticorpos serão adequados. Os anticorpos IgM são geralmente os mais eficientes para a lise celular induzida pelo complemento.

Os anticorpos IgG são os segundos mais eficientes e são tipicamente utilizados porque a maioria dos anticorpos monoclonais é IgG; titule cada anticorpo para uso ideal em uma densidade celular de 10 elevado à sétima células por mililitro, o que é determinado empiricamente. A maioria dos anticorpos é usada na faixa de 0,1 a 10 microgramas por mililitro. Para a depleção de linfócitos T esplênicos, utilizamos um anticorpo monoclonal específico para TH um.

Para iniciar a depleção de complemento, dilua as células em meio de cultura celular contendo 5% de soro bovino fetal inativado pelo calor, de modo que a população celular inicial seja de duas vezes 10 à sétima células por mililitro. Por exemplo, cinco vezes 10 à sétima células devem ser diluídas em 2,5 mililitros de meio. Esse volume de células corresponde à metade do volume final e, portanto, representa o dobro da concentração celular utilizada durante a depleção, que será de uma vez 10 à sétima células por mililitro.

Neste momento, congele até um vezes 10 à sexta potência de células para que o esgotamento possa ser quantificado ao final do experimento. Além disso, descongele a quantidade necessária de complemento à temperatura ambiente. Descobrimos que uma diluição de um para 15 é apropriada ao usar complemento de coelho da Pereze Biologicals para cinco vezes 10 à sétima potência de células; 1,5 mililitro de Eloqua congelado é suficiente.

Agora, adicione a quantidade apropriada de anticorpo à suspensão celular e misture. Para esterilizar o complemento, utilize um filtro de ponta de seringa com baixa ligação a proteínas. Encha a seringa com um a dois mililitros de meio.

Antes de adicionar o complemento para cinco vezes 10 à sétima células, precisaremos de 340 mililitros de complemento para uma diluição de um para 15. Em seguida, filtre o complemento diretamente no tubo contendo as células e o anticorpo. Agora, ajuste o volume final no tubo para que as células fiquem numa concentração de uma vez 10 à sétima células por mililitro.

Em seguida, deixe as células incubarem a 37 graus Celsius em banho-maria por uma hora. Lembre-se de misturar as células a cada 15 minutos por inversão suave. Após a incubação, centrifugue as células a uma velocidade que não afete a viabilidade.

Em seguida, de volta à câmara de fluxo laminar, descarte o sobrenadante. A seguir, lave as células duas vezes com 10 mililitros de meio. Observe como os detritos celulares se acumulam, com alguns aderindo às paredes dos tubos de poliestireno.

Após a última lavagem, filtre as células através de um drenador de células de náilon estéril de 70 mícrons. Por fim, verifique a pureza das células, comparando a população celular de interesse antes e depois do fluxo de esgotamento.

A citometria e a imunohistoquímica são métodos preferenciais utilizados para determinar a pureza celular antes da experimentação. Ao usar um anticorpo monoclonal altamente eficiente na ativação do complemento, a primeira rodada de esgotamento por complemento reduzirá as células em mais de 95%. Como exemplo, ao utilizar citometria de fluxo para medir a porcentagem de células T alfa beta em uma preparação de células do líquido peritoneal de camundongo, observamos que continham 32,2% de células T alfa beta após o esgotamento por complemento com anti-CD51, que é expresso por todos os linfócitos T, mas não por outros leucócitos. A população de TCR beta foi reduzida em 95%, atingindo uma concentração final de 1,56%.

Acabo de mostrar a você um método rápido e eficaz de esgotar populações celulares específicas utilizando anticorpos específicos para antígenos no esgotamento por complemento. Ao realizar este procedimento, lembre-se de testar cada anticorpo quanto à eficácia e de titular seu complemento em um experimento piloto antes de iniciar. É isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.