Name: Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprenda a isolar células da cavidade peritoneal de camundongos para estudos imunológicos. Este método permite obter populações de células B, macrófagos e linfócitos T com alta pureza para análises funcionais.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder AI069358 ea Fundação de Pesquisas BloodCenter.

<ol><li> Antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados: <ul><li> Gelo </li><li> Seringa de 5 ml com agulha 27g </li><li> Seringa de 5 ml com agulha 25g </li><li> Bloco de isopor e pinos para a montagem do rato </li><li> Bandeja em que o bloco de montagem pode ser colocado </li><li> Tesouras e pinças </li><li> Tubos de coleta </li><li> Etanol 70% </li><li> PBS com 3% de soro fetal bovino (FCS) (Pré-refrigerado e mantido em gelo) </li></ul></li><li> Euthanize o mouse, pulverizá-lo com etanol 70% e montá-la no bloco de isopor em sua parte traseira. </li><li> Usando uma tesoura e uma pinça cortar a pele externa do peritônio e puxe-o de volta para expor a pele interna que reveste a cavidade peritoneal. </li><li> Injectar 5 ml de PBS gelado (com FCS 3%) na cavidade peritoneal, utilizando uma agulha 27G. Empurre a agulha devagar no peritônio tomando cuidado para não perfurar nenhum órgão. </li><li> Após a injeção, massagear suavemente o peritônio para desalojar quaisquer células anexado na solução PBS. </li><li> Inserir uma agulha de 25 g de bisel, para cima, ligada a uma seringa de 5 ml no peritônio e recolher o líquido enquanto se move a ponta da agulha com cuidado para evitar o entupimento pelo tecido adiposo ou outros órgãos. Recolher o líquido tanto quanto possível, e depositar a suspensão de células coletadas em tubos mantidos em gelo depois de retirar a agulha da seringa. Opcional: Repita o passo 4-6 </li><li> Faça uma incisão na pele interna do peritônio e, mantendo a pele com uma pinça use um plástico Pasteur pipeta para coletar o líquido restante da cavidade. </li><li> Se no passo 6 ou 7 de contaminação por sangue visível é detectada em seguida, a amostra contaminada deve ser descartada. </li><li> Gire a suspensão de células coletadas em 1500 RPM por 8 minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meios de comunicação desejado ou PBS para contagem. </li></ol> Protocolo alternativo para a obtenção tioglicolato provocou macrófagos: Este método é usado para obter um maior rendimento dos macrófagos. <ol><li> Injectar 5 ml de 3% (w / v) Brewer tioglicolato médio (7) na cavidade peritoneal de cada rato. </li><li> Aguarde 3-5 dias, e avance para o passo 1 acima para a recolha das células. </li></ol> Comparação com a abordagem nonelicited, aproximadamente 10 vezes mais macrófagos podem ser coletados. A única preocupação é que os macrófagos obtidos por este procedimento diferem em algumas de suas propriedades fisiológicas. Resultados representativos: De um mouse não-manipulado, 5-10 milhões de células da cavidade peritoneal pode ser obtida com um protocolo de um bom isolamento. Entre todas as células vivas, 50-60% são células B, macrófagos ~ 30% e 5-10% são células T (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fenótipo de células isoladas da cavidade peritoneal. Após o isolamento de células cavidade peritoneal foram corados com anti-rato TCRβ-FITC, B220-PE-Texas vermelho, azul-Pacífico CD11b, CD23-PE-Cy7 e CD5-APC. Parcelas fluxo representante citometria mostram porcentagens de células B e T (a), macrófagos (b), B1 e B2 células (c) e células B1a e B1b (d).

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
<li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li>
<li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li>
<li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li>
<li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1%2B+%28CD5%29+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline%3A+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li>
<li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly-1+B+%28B-1%29+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+colony-stimulating+factor%2C+CSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li>
<li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li>
<li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li>
<li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li>
</ol>

Isolamento de células da cavidade peritoneal é uma técnica importante para o estudo das diferentes células do sistema imunológico, principalmente macrófagos e subpopulações de células B específicas. Embora este seja um processo simples, existem alguns passos críticos envolvidos. Presença de contaminação de sangue na amostra coletada deve ser evitada para obter uma população de células pura peritoneal da cavidade. Eutanásia por deslocamento cervical deve ser feito com cuidado para evitar a contaminação de sangue na cavidade peritoneal. Alternativamente CO 2 pode ser usado. Além disso, durante o procedimento adequado de cuidados devem ser tomados para evitar a perfuração da bexiga ou quaisquer outros órgãos na cavidade peritoneal. Recuperar a maior parte do fluido injetado é também importante para o rendimento das células. Este procedimento é amplamente utilizado para estudar a biologia dos macrófagos desde números moderados de residentes, macrófagos unstimulated pode ser facilmente obtida a partir da cavidade peritoneal, em contraste com a laboriosa tarefa de diferenciar as células progenitoras mielóides em macrófagos maduros in vitro, usando fator estimulador de colônias de macrófagos (8 , 9). O rendimento de macrófagos da cavidade peritoneal pode ser melhorada usando o método de elicitação de tioglicolato, embora o uso tioglicolato pode alterar as propriedades fisiológicas dos macrófagos (7). Células B são uma parte importante do nosso sistema imunológico jogar um papel crucial em ambos os imunidade inata e adaptativa. Em subpopulações de células diferentes B, células B1 compõem um único subconjunto de células B envolvidos na imunidade inata, auto-imunidade e regulação imune. Células B1 estão localizados principalmente na cavidade peritoneal e estão reabastecendo self. Eles são uma das principais produtoras de IgM natural que fornece a primeira linha de defesa contra uma série de vírus e bactérias (10-12). Células B1 também são uma importante fonte de IL-10 (6), que é uma importante citocina envolvida na regulação imune. Embora vários estudos tenham sido prosseguida com as células B1, ainda há espaço para uma avaliação mais aprofundada das suas funções contrastantes, especialmente o seu papel regulador. Peritoneal cavidade método de isolamento de células proporciona a oportunidade única de estudar as funções das células B1.

<table><tbody><tr><td>Meio Tioglicolato, Modificado por Brewer</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células de camundongo peritoneal cavity

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

A cavidade peritoneal é uma cavidade ligada à membrana e cheias de líquido abdominal dos mamíferos, que contém o fígado, baço, a maior parte do trato gastro-intestinal e outras vísceras. Abriga uma série de células do sistema imunológico, incluindo macrófagos, células B e células T. A presença de um elevado número de macrófagos naïve na cavidade peritoneal torna um local preferido para a coleção de macrófagos teciduais naïve residente (1). A cavidade peritoneal também é importante para o estudo das células B por causa da presença de um único subconjunto de células da cavidade peritoneal residente B conhecidas como células B1, além de células B2 convencionais. Células B1 são subdivididas em B1a e B1b células, que podem ser distinguidas pela expressão de superfície de CD11b e CD5. Células B1 são uma importante fonte de IgM natural, proporcionando proteção precoce de uma variedade de patógenos (2-4). Estas células são auto-reativos na natureza (5), mas como eles são controlados para evitar a auto-imunidade ainda não é totalmente entendido. Pelo contrário, CD5<sup&gt; +</supCélulas&gt; B1a possuem algumas propriedades reguladoras em virtude de sua capacidade de produção de IL-10 (6). Portanto, as células B1 peritoneal da cavidade são uma população de células interessante estudar por causa de sua função diversa e muitas perguntas sem resposta associada com o seu desenvolvimento e regulação. O isolamento da cavidade peritoneal residente células do sistema imunológico é complicado por causa da falta de uma estrutura definida no interior da cavidade peritoneal. Nosso protocolo vai descrever um procedimento viável para a obtenção de células do sistema imunológico a partir da cavidade peritoneal de camundongos, que então pode ser usado para a análise fenotípica por citometria de fluxo e para diferentes ensaios bioquímicos e imunológicos.

A cavidade peritoneal em mamíferos contém diferentes populações de células imunes crucial para a resposta imune inata. Um método eficiente de isolamento é necessário para análises bioquímicas e funcionais dessas células. Aqui nós fornecemos um método abrangente para o isolamento de células na cavidade peritoneal do rato.

Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

A cavidade peritoneal é uma cavidade abdominal de mamíferos, delimitada por membranas e preenchida por líquido, que contém o fígado, o baço, a maior parte do trato gastrointestinal...

O isolamento de células da cavidade peritoneal começa com a fixação de um camundongo eutanasiado sobre as costas. A pele externa do peritônio é cortada e levemente puxada para trás para expor a pele interna. PBS com 3% de FBS é injetado na cavidade peritoneal, e o peritônio é massageado suavemente. O fluido contendo células peritoneais é coletado e colocado em um tubo de 15 mililitros sobre gelo.As células são lavadas uma vez e contadas em um hemocitômetro. Olá, sou Oji do laboratório do Dr. Bon, do Instituto de Pesquisa Sanguínea do Centro de Sangue do Wisconsin. Hoje vamos mostrar um procedimento para isolar células da cavidade peritoneal de um camundongo.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para obter células para diversos ensaios fenotípicos, bioquímicos e imunológicos. Principalmente, estamos interessados em populações de células B peritoneais. Então, vamos começar.Antes de começar a isolar células imunes da cavidade peritoneal, prepare todos os materiais necessários. Comece reunindo um balde de gelo, uma seringa de cinco mililitros com agulha de 27 graus, uma seringa de cinco mililitros com agulha de 25 graus, um bloco de isopor e alfinetes para fixar o camundongo. Uma bandeja para segurar o bloco de fixação, tesoura, pinça e tubos de coleta antes da dissecação.Pré-resfrie PBS contendo 3% de soro bovino fetal. Mantenha estes e os tubos de coleta em gelo durante todo o experimento após a administração do anestésico e da eutanásia apropriada, pulverize o camundongo com etanol 70% e posicione-o sobre as costas em cima de um bloco de isopor ou almofada de dissecação. Usando pinça e tesoura, corte a pele externa do peritônio.Puxe suavemente a pele para trás para expor a camada interna que reveste a cavidade peritoneal. Tendo cuidado para não perfurar nenhum órgão, insira lentamente uma agulha de 27 gauge no peritônio. Injete cinco mililitros de PBS gelado na cavidade peritoneal.Agora, massage suavemente o peritônio para estimular as células a se desprenderem da parede peritoneal e caírem na solução de PBS. Em seguida, acople uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de 25 graus com o bisel voltado para cima neste ponto, insira a agulha no peritônio. Colete o máximo de fluido possível para aumentar o rendimento celular.Enquanto faz isso, mova suavemente a ponta para evitar que tecido adiposo ou outros órgãos obstruam a agulha. Remova a agulha e transfira a suspensão celular para tubos de coleta de polipropileno. Colete o fluido remanescente da cavidade fazendo uma incisão na pele interna do peritônio.Use uma pinça para segurar a pele afastada enquanto utiliza uma pipeta plástica posterior para coletar qualquer fluido remanescente. Por fim, centrifugue a suspensão celular por oito minutos a 1500 RPM, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS. Contagem das células em um hemocitômetro.A utilização da exclusão com azul de tripano permitirá a determinação do número de células. Tipicamente, podem ser isoladas de cinco a dez milhões de células da cavidade peritoneal de um camundongo não manipulado. De 50 a 60% da população total de células serão células B.Cerca de 40% serão macrófagos e granulócitos, e de cinco a 10% serão células T. Acabamos de mostrar como isolar células da cavidade peritoneal de um camundongo. Ao utilizar este procedimento, é importante limitar a quantidade de sangue na população de células da cavidade peritoneal, eutanasiando os camundongos cuidadosamente e sem perfurar nenhum órgão na cavidade peritoneal.Certifique-se de descartar todas as amostras que forem contaminadas com sangue. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

isolation-of-mouse-peritoneal-cavity-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo colhido. Os linfócitos isolados podem ser usados para análise posterior.

Isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo

Este vídeo demonstra um método de lavagem peritoneal para isolar mastócitos maduros do tipo tecido conjuntivo da cavidade peritoneal de camundongos adultos. Ao isolar uma mistura de células imunes primárias da cavidade peritoneal, a proliferação seletiva de mastócitos é realizada em condições de cultura apropriadas.

Uma técnica para isolar mastócitos primários de uma cavidade peritoneal murina

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Células enterocromafins (CE) compõem um pequeno subconjunto de células epiteliais gastrointestinais. Células de CE são eletricamente excitáveis e liberam serotonina, ainda dificuldades no cultivo e identificação de células CE limitados estudos fisiológicos. O método apresentado aqui estabelece um modelo de cultura primária favorável ao exame de células únicas CE por eletrofisiologia.

Eletrofisiologia celular de células enterocromafins murino culta primário

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar células da cavidade peritoneal de camundongos para estudos imunológicos. Este método permite obter populações de células B, macrófagos e linfócitos T com alta pureza para análises funcionais.

Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

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