Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity
28 de janeiro de 2010
A cavidade peritoneal em mamíferos contém diferentes populações de células imunes crucial para a resposta imune inata. Um método eficiente de isolamento é necessário para análises bioquímicas e funcionais dessas células. Aqui nós fornecemos um método abrangente para o isolamento de células na cavidade peritoneal do rato.
O isolamento de células da cavidade peritoneal começa com a fixação de um camundongo eutanasiado sobre as costas. A pele externa do peritônio é cortada e levemente puxada para trás para expor a pele interna. PBS com 3% de FBS é injetado na cavidade peritoneal, e o peritônio é massageado suavemente. O fluido contendo células peritoneais é coletado e colocado em um tubo de 15 mililitros sobre gelo.
As células são lavadas uma vez e contadas em um hemocitômetro. Olá, sou Oji do laboratório do Dr. Bon, do Instituto de Pesquisa Sanguínea do Centro de Sangue do Wisconsin. Hoje vamos mostrar um procedimento para isolar células da cavidade peritoneal de um camundongo.
Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para obter células para diversos ensaios fenotípicos, bioquímicos e imunológicos. Principalmente, estamos interessados em populações de células B peritoneais. Então, vamos começar.
Antes de começar a isolar células imunes da cavidade peritoneal, prepare todos os materiais necessários. Comece reunindo um balde de gelo, uma seringa de cinco mililitros com agulha de 27 graus, uma seringa de cinco mililitros com agulha de 25 graus, um bloco de isopor e alfinetes para fixar o camundongo. Uma bandeja para segurar o bloco de fixação, tesoura, pinça e tubos de coleta antes da dissecação.
Pré-resfrie PBS contendo 3% de soro bovino fetal. Mantenha estes e os tubos de coleta em gelo durante todo o experimento após a administração do anestésico e da eutanásia apropriada, pulverize o camundongo com etanol 70% e posicione-o sobre as costas em cima de um bloco de isopor ou almofada de dissecação. Usando pinça e tesoura, corte a pele externa do peritônio.
Puxe suavemente a pele para trás para expor a camada interna que reveste a cavidade peritoneal. Tendo cuidado para não perfurar nenhum órgão, insira lentamente uma agulha de 27 gauge no peritônio. Injete cinco mililitros de PBS gelado na cavidade peritoneal.
Agora, massage suavemente o peritônio para estimular as células a se desprenderem da parede peritoneal e caírem na solução de PBS. Em seguida, acople uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de 25 graus com o bisel voltado para cima neste ponto, insira a agulha no peritônio. Colete o máximo de fluido possível para aumentar o rendimento celular.
Enquanto faz isso, mova suavemente a ponta para evitar que tecido adiposo ou outros órgãos obstruam a agulha. Remova a agulha e transfira a suspensão celular para tubos de coleta de polipropileno. Colete o fluido remanescente da cavidade fazendo uma incisão na pele interna do peritônio.
Use uma pinça para segurar a pele afastada enquanto utiliza uma pipeta plástica posterior para coletar qualquer fluido remanescente. Por fim, centrifugue a suspensão celular por oito minutos a 1500 RPM, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em cinco mililitros de PBS. Contagem das células em um hemocitômetro.
A utilização da exclusão com azul de tripano permitirá a determinação do número de células. Tipicamente, podem ser isoladas de cinco a dez milhões de células da cavidade peritoneal de um camundongo não manipulado. De 50 a 60% da população total de células serão células B.
Cerca de 40% serão macrófagos e granulócitos, e de cinco a 10% serão células T. Acabamos de mostrar como isolar células da cavidade peritoneal de um camundongo. Ao utilizar este procedimento, é importante limitar a quantidade de sangue na população de células da cavidade peritoneal, eutanasiando os camundongos cuidadosamente e sem perfurar nenhum órgão na cavidade peritoneal.
Certifique-se de descartar todas as amostras que forem contaminadas com sangue. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método detalhado para o isolamento de células da cavidade peritoneal de camundongos, essencial para o estudo de respostas imunes. O procedimento foi desenvolvido para garantir a integridade das populações celulares para análises subsequentes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Bioquímica
Antecedentes
- A cavidade peritoneal abriga diversos tipos de células imunes.
- Essas células desempenham um papel fundamental nas respostas imunes inatas.
- Os métodos de isolamento são cruciais para estudos funcionais e bioquímicos.
- Compreender essas células pode auxiliar na pesquisa imunológica.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para o isolamento de células da cavidade peritoneal.
- Facilitar o estudo das populações de células imunes em camundongos.
- Aprimorar a precisão de ensaios imunológicos subsequentes.
Métodos Utilizados
- Eutanasiar o camundongo e preparar para a dissecação.
- Injetar PBS com 3% de FBS na cavidade peritoneal.
- Coletar o fluido contendo células peritoneais.
- Centrifugar e contar as células isoladas.
Resultados Principais
- Isolou com sucesso 5 a 10 milhões de células da cavidade peritoneal.
- Identificou que 50-60% das células são linfócitos B.
- Aproximadamente 40% são macrófagos e granulócitos.
- 5 a 10% das células são linfócitos T.
Conclusões
- O método é eficaz para o isolamento de células imunes da cavidade peritoneal.
- A eutanásia cuidadosa e a dissecação são cruciais para evitar contaminação sanguínea.
- Este procedimento pode ser aplicado a diversos estudos imunológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de células imunes da cavidade peritoneal permite a validação precoce de alvos ao fornecer acesso a subpopulações fenotipicamente definidas de linfócitos B e macrófagos. Isso contribui para a redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta, fornecendo entradas reprodutíveis de células primárias para ensaios funcionais. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes por meio da recuperação padronizada de populações imunes relevantes para triagem de fármacos imunomoduladores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação dos subconjuntos de células B1a e B1b para testes de hipóteses terapêuticas em modelos de autoimunidade e infecção.
- Valor Científico: Fornece macrófagos teciduais naïve para esclarecimento de vias em estudos de resposta imune inata.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio do isolamento consistente de populações de células imunes para triagem de engajamento de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para análise fenotípica por citometria de fluxo e ensaios bioquímicos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio do controle do rendimento celular (5–10 milhões de células por camundongo).
- Valor Operacional: Permite avaliação confiável de compostos por meio da recuperação quantitativa de linfócitos B (50–60%), macrófagos (40%) e linfócitos T (5–10%).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças mediante o isolamento de células B1 autoreativas e subconjuntos reguladores produtores de IL-10.
- Valor Operacional: Facilita o alinhamento translacional de biomarcadores por meio do isolamento de células B1 produtoras de IgM natural.
- Valor Operacional: Permite continuidade pré-clínica ao fornecer células imunes primárias para acompanhamento mecanicista em modelos de doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer células imunes primárias para validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e estudos mecanicistas pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio do isolamento de subpopulações definidas de linfócitos B e macrófagos.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios mediante isolamento padronizado e recuperação de populações imunes viáveis.
- Análises: Permite a comparação quantitativa de subpopulações celulares utilizando contagem em hemocitômetro e métodos de exclusão de viabilidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio do isolamento de células B1 associadas à imunidade natural e à regulação.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de obtenção de células imunes em programas de descoberta em imunologia e oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio do acesso a subconjuntos imunes fenotipicamente caracterizados.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de rendimento celular definido e distribuição de subconjuntos.
- Valor Estratégico: Decisões aprimoradas de avançar/não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista na triagem de imunomoduladores.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de insumos confiáveis de células primárias para painéis de ensaios funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de camundongos e técnica asséptica para evitar perfuração de órgãos e contaminação sanguínea.
- Depende de instrumentação, incluindo seringas, agulhas, centrífuga e hemocitômetro, para processamento e contagem celular.
- Necessita padronização entre equipes no preparo de PBS/FBS e no manejo da cadeia fria para garantir consistência.
- Envolve considerações de adaptação ao ser aplicado a modelos de doenças que alteram a celularidade da cavidade peritoneal.
- Limitado pela necessidade de eutanásia e dissecação cuidadosas para evitar contaminação sanguínea, o que compromete a integridade da amostra.
