Name: Produção lentivírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a produzir lentivírus em células 293T humanas por transfecção, concentração por ultracentrifugação e titulação por fluorescência. Este método eficiente permite obter partículas virais para aplicações em terapia gênica e pesquisa.

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Sandler Asma Básico Research Center (SABRE) Sandler Foundation

Parte 1: Transfecção de HEK 293 células para produzir Lentivirus * 24 horas antes de transfecção, placa de 2,5 X 10 6 células em um prato de 10 centímetros de uma confluência de 50-70% no dia seguinte. <ol><li> Iniciar este protocolo, preparando o DNA com o qual se vai depois de uma transfecção as células para fazer vírus. Primeiro, diluir FuGENE 6 Transfection reagente Roche, um reagente de lipídios que fazem as células ocupam DNA. Em um tubo de 1,5 ml, pipetar 30μl FuGENE 6 em meio isento de soro 600ul (SFDMEM). Tenha cuidado para não deixar FuGENE toque no lado do tubo quando é entregue ao meio. Deixe esta FuGENE e SFDMEM misturar e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Na tampa do tubo, misturar 4 mg lentiviral plasmídeo com 4 mg a cada 3 ª geração de vetores virais embalagem (pMDL, PRSV e pVSV-G). O plasmídeo lentiviral contém o DNA do vírus irá inserir no genoma de cada célula que infecta, enquanto os vetores de embalagens contêm genes para todas as outras proteínas necessárias para fazer um lentivírus. </li><li> Feche a tampa e misturar invertendo o tubo várias vezes. </li><li> Incubar 15-20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Pipeta conteúdo inteiro do tubo em 293 placa. Misture delicadamente a placa de inclinação para trás e para frente. </li><li> As células voltem para a incubadora e permitir que a produção viral continuar por 48-96 horas antes da colheita. </li><li> Durante a incubação, a 293 células transcrever o DNA de interesse do plasmídeo lentiviral, criando uma cópia de RNA da construção lentiviral. Eles também transcrever e traduzir os genes nos vetores de embalagens em proteínas virais. Estas proteínas continuar a fazer vírus contendo a versão do seu RNA construir lentiviral, que o vírus irá reverter transcrever e inserir no genoma de todas as células que infecta. </li></ol> Parte 2: Harvest Lentivirus <ol><li> Após período de incubação, retirar células fora da incubadora e use uma seringa descartável de 10ml, para remover o sobrenadante, que agora contém o vírus. Haverá cerca de 10ml do sobrenadante. </li><li> Coloque um filtro de seringa de 0,45 para a ponta e filtrar o vírus em um tubo de ultracentrífuga Beckman. O filtro permite que apenas os vírus, e não as células a passar. </li><li> Antes de deitar fora, incubar todas as células produtoras de vírus, placas de cultura, seringas e filtros em água sanitária 10% por 45 minutos. </li></ol> Parte 3: Concentração Lentivirus via Ultracentrifugação <ol><li> De carga em tubos de centrífuga SW-41Ti ou SW-28 baldes de rotor. </li><li> Use soro livre de DMEM para equilibrar todos os vírus contendo tubos para dentro de 0.2g. </li><li> Seal fecha baldes rotor e conectá-los em rotor antes de colocar dentro do rotor ultracentrífuga </li><li> Girar o vírus por 90 minutos em uma ultracentrífuga a 4 ° C a 25.000 rpm em um rotor SW-41Ti ou 24.000 rpm em um rotor SW-28. </li><li> Em uma capa de cultura de tecidos, inverter os tubos de cabeça para baixo para derramar sobrenadante em um recipiente contendo água sanitária a 10%. </li><li> Use uma Kimwipe para absorver o excesso de líquido ao redor do pellet e inverter o tubo em um rack conveniente para não mais que cinco minutos. </li><li> Para voltar a suspender o pellet viral, use uma ponta de filtro para adicionar 100 mL de PBS estéril ao tubo, então pipeta cima e para baixo cerca de 20 vezes. </li><li> Deixe o vírus a 4 ° C durante a noite para completar re-suspensão. Pode-se armazenar preps viral a 4 graus por cerca de uma semana e à temperatura de -80 graus por até um ano. Lembre-se de tratar todos os tubos vazios com água sanitária a 10% antes de descartar. </li><li> Se alguém pretende usar a preparação viral por mais tempo do que a semana 1, fazer alíquotas mínima de 5-20μl para futuros experimentos e uma alíquota de 3 a 5μl para a titulação. Congelar e armazenar as alíquotas de 80 de menos. </li></ol> Parte 4: Titulação Lentivirus por citometria de fluxo <ol><li> O próximo passo é determinar o título viral por citometria de fluxo. Este método só funciona nos casos em que o plasmídeo lentiviral contém um gene repórter fluorescente. A idéia é que quando o vírus infecta uma célula, ele introduz o DNA lentiviral plasmídeo no genoma dessa célula. Da célula infectada, então, transcrever e traduzir os genes que você incluiu no plasmídeo lentiviral, e se você incluiu um gene repórter fluorescente, as células infectadas ficam fluorescentes. O nível de fluorescência representa a potência, ou título, do vírus. </li><li> Para cada ação viral para ser tituladas, diluir 3 mL do vírus concentrado em 1,5 ml de meio completo (DMEM, pen-strep, glutamina, FBS). </li><li> Em poços de 1-6 em uma única linha de uma placa de 96 poços, execute as seguintes diluições em série: a todos os seis poços adicionar 100 ml de DMEM completo de mídia. Para o primeiro poço adicionar 100μl dos meios de comunicação, sem vírus (este é o seu controle sem mácula), para o segundo poço adicionar 100 ml do vírus diluído (que é para 1 ml equivalente do vírus diluído), para o terceiro também adicionar 100 ulda mistura a partir do segundo poço, para o quarto poço adicionar 100 ml do terceiro poço, para o quinto também adicionar 100μl do poço 4, e para o sexto bem adicionar 100 ul da quinta também. Finalmente assumir 100ul do poço 6 e descartar em lixívia. A diluição em série foi realizada em cada poço tem metade do volume de vírus em comparação com o anterior. </li><li> Trazer o volume total em todos os poços de 200μl. Note que estes são diluições apenas sugerido, que deve funcionar bem para titulação vírus mais concentrado. Se o vírus é baixa no título, ou não concentrada pode-se necessário ajustar as diluições. </li><li> Tratar qualquer vírus não utilizado diluído em água sanitária 10% por 45 minutos antes de descartar em um recipiente de resíduos de risco biológico. </li><li> Adicionar ~ 15000 saudável, dividindo ativamente 293 células para cada um dos 6 poços. A única placa de 96 poços pode ser usado para título 16 preps viral. </li><li> Retorno células a 37 graus incubadora com 5% de CO 2 e permitir a infecção para prosseguir durante pelo menos 48 horas. </li><li> Após a incubação, as células são analisadas para expressão repórter (no nosso caso de fluorescência), com um citômetro de fluxo. Partículas virais são quantificada pela porcentagem de células fluorescentes por poço. </li></ol> Calcule o número de unidades infecciosas por ml com a seguinte fórmula: <div style="text-align:center;"> (# De células por poço no dia de células infecção repórter X positivo) X 1000 ______________________________________________________ ml do vetor adicionado ao bem </div> Parte 5: Resultados Representante: Depois de 48 horas de transfecção pós período de incubação, a placa de 293 células deve ser em torno de 90% fluorescentes. A elevada percentagem de células fluorescentes é uma indicação de uma alta porcentagem de células produtoras de vírus. Após a centrifugação, o pellet viral é pouco visível quando ressuspensão. Isso é normal como o pellet é clara e muito pequenas. Ao interpretar os resultados citômetro de fluxo nota, que só se pode alcançar cálculos título precisos quando infectados (fluorescente), as células não receberam mais do que uma integração viral por célula. , A fim de garantir que este for o caso, use com células &lt;taxa de infecção de 15% para os cálculos. Células com maiores taxas de infecção provável recebeu vários integrantes viral por célula. As diluições sugerido no passo 2 deve render várias amostras dentro desta faixa de infecção. Idealmente, use várias amostras para gerar um gráfico de titulação (linha linear) a partir do qual você pode calcular o título final, mas você pode calcular título usando uma única amostra, se necessário. Pode-se esperar título de 1,0 x 10 7 TU / ml para un concentrado de vírus e 1,0 x 10 8 TU ml / para o vírus concentrado.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM células HEK 293T Penicilina-estreptomicina Glutamina Solução salina tamponada com fosfato FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfeção FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água sanitária</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular de 10 cm Placas de cultura celular de 96 poços </td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta com filtro</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml Seringa Filtro de seringa (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos para ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de tecidos a 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produção lentivírus

Lentivirus Production

Interferência de RNA (RNAi) é um sistema de silenciamento de genes em células vivas. Em RNAi, genes homólogos em seqüência de curto RNAs de interferência (siRNA) são silenciadas no estado pós-transcricional. RNAs hairpin curto, precursores de siRNA, podem ser expressas utilizando lentivírus, permitindo a RNAi em uma variedade de tipos de células. Lentivírus, como o Vírus da Imunodeficiência Humana, são capazes de infectar tanto divisão e não divisão das células. Vamos descrever um procedimento que a lentivírus pacote. Embalagem refere-se à preparação de vírus competentes de vetores de DNA. Sistemas de produção Lentivirus vector são baseados em um &#39;split&#39; do sistema, onde o genoma viral naturais foi dividida em construções auxiliares individuais plasmídeo. Essa divisão dos diferentes elementos viral em quatro vetores separados diminui o risco de criar um vírus de replicação com capacidade de recombinação do genoma acidental lentiviral. Aqui, um vetor contendo os shRNA de interesse e de três vetores de embalagem (p-VSVG, PRSV, pMDL) são transitoriamente transfectadas em células humanas 293. Depois de pelo menos um período de incubação de 48 horas, o sobrenadante contendo o vírus é colhido e concentrada. Finalmente, título de vírus é determinado pelo repórter (fluorescente) expressão com um citômetro de fluxo.

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

A interferência de RNA (RNAi) é um sistema de silenciamento gênico em células vivas. Na RNAi, genes com sequências homólogas a RNAs interferentes curtos (siRNA) são...

Este procedimento começa com a transdução de células 293T com lentivírus, plasmídeo e vetores de empacotamento viral; o sobrenadante viral é coletado após um período de incubação de pelo menos 48 horas. O sobrenadante é filtrado e concentrado por ultracentrifugação. O pellet viral é ressuspenso em PBS para obtenção do título viral: primeiramente, dilua o vírus concentrado em meio completo e, em seguida, realize diluições seriadas para infectar as células com lentivírus.Olá, sou Shein Wong do laboratório de Michael McManus no Centro de Diabetes da Universidade da Califórnia em São Francisco. Sou Michael McManus. Hoje vamos mostrar um procedimento para a produção de lentivírus.Utilizamos este procedimento no laboratório para produzir lentivírus para interferência de RNA. Vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare o DNA que será usado para transfectar as células 2 9 3 T.Primeiro, dilua o reagente de transfeção FU gene seis em um tubo de 1,5 mililitro misturando 30 microlitros de Fuji seis com 600 microlitros de meio sem soro. Tenha cuidado para não deixar o Fuji tocar nas paredes do tubo ao adicioná-lo ao meio e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, na tampa do tubo, misture quatro microgramas do plasmídeo lentiviral com 1,33 microgramas.Cada vetor de empacotamento viral de terceira geração. O plasmídeo lentiviral contém o DNA. O vírus será inserido no genoma de todas as células que infectar, enquanto os vetores de empacotamento contêm os genes para todas as outras proteínas necessárias para produzir um vírus lentiviral; feche a tampa e misture invertendo o tubo algumas vezes.Incube o DNA e o reagente de transfeção por 15 a 20 minutos à temperatura ambiente. Agora é a hora de transfectar as células 2 9 3 com o DNA que você preparou: use células que foram semeadas 24 horas antes e que atingiram 50 a 70% de confluência. Na capela de cultura de tecidos, pipete todo o DNA preparado sobre a placa de células 2 9 3 e misture suavemente inclinando a placa para frente e para trás. Retorne as células ao incubador e permita que a produção viral prossiga por 48 a 96 horas antes da colheita. Durante a incubação, as células 2 9 3 produzem lentivírus cujos genomas contêm uma cópia de RNA do seu DNA de interesse.Agora é a hora de coletar o vírus. Retire suas células do incubador. Tenha prontos na capela de cultura de tecidos um filtro de seringa de 0,4 ou cinco mícrons, uma seringa descartável de 10 mililitros e um tubo de centrífuga UltraClear Beckman.Use a seringa descartável para remover o sobrenatante, que agora contém o vírus. Acople um filtro de seringa de 0,45 mícron à ponta e filtre o vírus para dentro de um tubo de centrífuga UltraClear Beckman. O filtro permite a passagem apenas de vírus, não de células, e antes de descartar, incube todas as células produtoras de vírus.Coloque placas de cultura, seringas e filtros em água sanitária a 10% por 45 minutos. Agora que você coletou e filtrou o vírus, é hora de concentrá-lo por ultracentrifugação. Use DMEM sem soro para equilibrar todos os tubos contendo vírus, deixando-os com diferença máxima de 0,2 gramas entre si.Em seguida, carregue os tubos de centrífuga balanceados nos baldes do rotor SW 41 TI ou SW 28. Feche hermeticamente os baldes do rotor e prenda-os ao rotor. Em seguida, coloque o rotor dentro da ultracentrífuga.Centrifugue o vírus por cerca de 90 minutos a quatro graus Celsius a 25.000 RPM em um rotor SW 41 TI, ou a 24.000 RPM em um rotor SW 28. Após a centrifugação, retorne à capela de cultura de tecidos e inverta o tubo para derramar o SNAT em um recipiente contendo água sanitária a 10%. Use uma toalha de papel Kim para absorver o líquido em excesso ao redor do pellet e inverta o tubo em um suporte conveniente por não mais de cinco minutos, até que você esteja pronto para ressuspender o pellet.Para ressuspender o pellet viral, use uma ponteira de filtro para adicionar 100 microlitros de PBS estéril pré-filtrado ao seu tubo. Em seguida, pipete para cima e para baixo cerca de 20 vezes. Deixe o vírus a quatro graus durante a noite para completar a ressuspensão.Você pode armazenar preparações virais a quatro graus por cerca de uma semana e a menos 80 graus por até um ano. Lembre-se de tratar todos os tubos vazios com água sanitária a 10% antes de descartá-los. Se você pretende usar a preparação viral por mais de uma semana, ela pode ser mantida na geladeira.Prepare alíquotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros e uma alíquota de três a cinco microlitros para a titulação, congele e armazene as alíquotas a aproximadamente menos 80. O próximo passo é determinar o título viral. Se você incluiu um gene repórter fluorescente no seu plasmídeo lentiviral, as células infectadas fluorescerão e você poderá determinar o título viral utilizando citometria de fluxo.Para começar, dilua três microlitros de vírus concentrado em 1,5 mililitro de meio completo em poços de um a seis, em uma única fileira de uma placa de 96 poços. Realize as seguintes diluições seriadas em todos os seis poços com 100 microlitros de DM completo. Ao primeiro poço, adicione 100 microlitros de meio sem vírus.Este é o seu controle não corado. Ao segundo poço, adicione 100 microlitros do vírus diluído ao terceiro. Adicione 100 microlitros da mistura do segundo poço ao quarto.Adicionaremos 100 microlitros do terceiro poço ao quinto. Adicionaremos 100 microlitros do quarto poço ao sexto. Adicionaremos 100 microlitros do quinto.Por fim, retire 100 microlitros do sexto poço e descarte, depois adicione solução de hipoclorito para ajustar o volume total em todos os poços a 200 microlitros com DMEM. A cada diluição, a concentração viral diminui pela metade. Observe que essas são apenas diluições sugeridas, que devem funcionar bem para a titulação da maioria dos vírus concentrados.Se o seu vírus tiver título baixo ou estiver não concentrado, você poderá precisar ajustar suas diluições. Trate qualquer vírus diluído não utilizado com água sanitária a 10% durante 45 minutos antes de descartá-lo em um recipiente para resíduos biológicos. Adicione cerca de 15.000 células 293T saudáveis e em divisão ativa a cada um dos seis poços.Você pode usar uma única placa de 96 poços para titular 16 preparações virais, completar os poços até 200 microlitros, retornar as células ao incubador e permitir que a infecção prossiga por pelo menos 48 horas. Após a incubação, analise a fluorescência celular utilizando um citômetro de fluxo. Você pode usar a porcentagem de células fluorescentes por poço para determinar a titulação ou o número de partículas virais infecciosas por mililitro de vírus adicionado.Calcule o número de unidades infecciosas por mililitro com a seguinte fórmula ao interpretar os resultados do citômetro de fluxo. Observe que é possível obter cálculos precisos de título apenas quando as células infectadas receberam não mais do que uma integração viral por célula.Para garantir que esse seja o caso, utilize células com taxa de infecção inferior a 15% para os cálculos. Células com taxas de infecção mais altas provavelmente terão recebido múltiplas integrações virais por célula. A diluição sugerida na etapa dois deve produzir várias amostras dentro dessa faixa de infecção.Use idealmente várias amostras para gerar um gráfico de titulação a partir do qual é possível calcular o título final. A fórmula calculada a partir da reta linear ajustada pode ser utilizada para determinar o título viral, mas é possível calcular o título usando uma única amostra, se necessário. Pode-se esperar um título de um vezes 10 à sétima unidades transdutoras por mililitro para vírus não concentrado, e um vezes 10 à oitava unidades transdutoras por mililitro para vírus concentrado.Acabamos de mostrar como produzir lentivírus ao realizar este procedimento. É importante seguir todas as regulamentações de biossegurança e descartar os resíduos adequadamente. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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