Produção lentivírus

Este procedimento começa com a transecção de 2 9 3 células T com lentivírus, plasmídeo e vetores de empacotamento viral, o sobrenadante viral é colhido após pelo menos um período de incubação de 48 horas. O snat é filtrado para ser concentrado com uma ultracentrífuga após a ultracentrifugação. O pellet viral é ressuspenso com PBS para obter o título do vírus, primeiro diluir o vírus concentrado em meio completo e, em seguida, realizar a diluição em série para infectar as células com lentivírus.

Olá, sou Shein Wong, do laboratório de Michael McManus no Centro de Diabetes da Universidade da Califórnia em São Francisco. Eu sou Michael McManus. Hoje vamos mostrar um procedimento para a produção de lentivírus.

Usamos esse procedimento em laboratório para fazer lentivírus para interferência de RNA. Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare o DNA com o qual transfectar as 2 9 3 células T.

Primeiro dilua o reagente de transfecção do gene FU seis em um tubo de 1,5 mililitro, misturando 30 microlitros Fuji seis com 600 microlitros de meio livre de soro. Tenha cuidado para não deixar o Fuji tocar na lateral do tubo ao entregá-lo na temperatura ambiente de incubação média por cinco minutos. Em seguida, na tampa do tubo, misture quatro microgramas de plasmídeo lentiviral com 1,33 microgramas.

Cada terceira geração de vetores de embalagens virais. O plasmídeo lentiviral contém o DNA. O vírus se insere no genoma de cada célula infectada, enquanto os vetores de embalagem contêm genes para todas as outras proteínas necessárias para fazer um vírus de lentilha fechar a tampa e se misturar invertendo o tubo algumas vezes.

Incube o DNA e o reagente de transfecção por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente. Agora é hora de transfectar 2 9 3 células com o DNA que você preparou, use células que você plaqueou com 24 horas de antecedência e que atingiram 50 a 70% de fluência na capa de cultura de tecidos, pipetar todo o DNA preparado na placa 2 9 3 misturada suavemente, inclinando a placa para frente e para trás, retorne as células para a incubadora e permita que a produção viral continue por 48 a 96 horas antes da colheita. Durante a incubação, as células 2 9 3 produzem lentivírus cujos genomas contêm uma cópia de RNA do seu DNA de interesse.

Agora é hora de coletar o vírus. Retire suas células da incubadora. Tenha pronto na capa de cultura de tecidos, um filtro de seringa de 0,4 ou cinco mícrons, uma seringa descartável de 10 mililitros e um tubo de centrífuga UltraClear Beckman.

Use a seringa descartável para remover o sobrenadante, que agora contém o vírus. Conecte um filtro de seringa de 0,45 mícron à ponta e filtre o vírus em um tubo de centrífuga UltraClear Beckman. O filtro permite que apenas vírus e não células passem antes de descartar, incubar todas as células produtoras de vírus.

Placas de cultura, seringas e filtros em alvejante a 10% por 45 minutos. Agora que você coletou e filtrou o vírus, é hora de concentrar o vírus por ultracentrifugação primeiro. Use DMEM livre de soro para equilibrar todos os tubos contendo vírus com uma distância de 0,2 gramas um do outro.

Em seguida, carregue os tubos de centrífuga balanceados em caçambas de rotor SW 41 TI ou SW 28. Feche os baldes do rotor e prenda-os no rotor. Em seguida, coloque o rotor dentro da ultracentrífuga.

Gire o vírus por cerca de 90 minutos a quatro graus Celsius a 25.000 RPM em um rotor SW 41 TI, ou 24.000 RPM em um rotor SW 28. Após a centrifugação, volte para a capa de cultura de tecidos e inverta o tubo para despejar o SNAT em um recipiente contendo 10% de alvejante. Use um lenço Kim para absorver o excesso de líquido ao redor do pellet e inverta o tubo em um rack conveniente por não mais de cinco minutos até que esteja pronto para ressuspender o pellet.

Para ressuspender o pellet viral, use uma ponta de filtro para adicionar 100 microlitros de PBS pré-filtrado estéril ao seu tubo. Em seguida, pipete para cima e para baixo cerca de 20 vezes. Deixe o vírus a quatro graus durante a noite para completar a ressuspensão.

Você pode armazenar preparações virais a quatro graus por cerca de uma semana e a 80 graus negativos por até um ano. Lembre-se de tratar todos os tubos vazios com 10% de alvejante antes de descartá-los. Se você pretende usar a preparação viral por mais de uma semana, ela será mantida na geladeira.

Faça alíquotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros e uma alíquota de três a cinco microlitros para o congelamento da titulação e armazene as alíquotas em aproximadamente menos 80. O próximo passo é determinar o título viral. Se você incluiu um gene repórter fluorescente em seu plasmídeo lentiviral, as células infectadas irão fluorescer e você poderá determinar o título viral usando citometria de fluxo.

Para começar, dilua três microlitros de vírus concentrado em 1,5 mililitros de meio completo em poços, de um a seis. Em uma única linha de uma placa de 96 poços. Realize as seguintes diluições em série em todos os seis poços a 100 microlitros de DM.To o primeiro poço adicione 100 microlitros de meio sem vírus.

Este é o seu controle imaculado. Para o segundo, adicione 100 microlitros do vírus diluído ao terceiro. Bem, adicione 100 microlitros da mistura do segundo poço ao quarto.

Bem, adicione 100 microlitros do terceiro poço ao quinto. Bem, adicione 100 microlitros do quarto poço e do sexto. Bem, adicione 100 microlitros do quinto.

Bem, finalmente, retire 100 microlitros do sexto poço e descarte e alvejante, traga o volume total em todos os poços para 200 microlitros com DMEM. A cada diluição, a concentração viral diminui pela metade. Observe que essas são apenas diluições sugeridas, que devem funcionar bem para titular a maioria dos vírus concentrados.

Se o seu vírus estiver com baixo título ou não concentrado, pode ser necessário ajustar suas diluições. Trate qualquer vírus diluído não utilizado com alvejante a 10% por 45 minutos antes de descartá-lo em um recipiente de resíduos de risco biológico. Adicione cerca de 15.000 células T saudáveis dividindo ativamente 2 9 3 células T a cada um dos seis poços.

Você pode usar uma única placa de 96 poços para titular 16 preparações virais, completar os poços para 200 microlitros, devolver as células à incubadora e permitir que a infecção prossiga por pelo menos 48 horas. Após a incubação, analisar a fluorescência celular utilizando um citómetro de fluxo. Você pode usar a porcentagem de células fluorescentes por poço para determinar o título ou o número de partículas virais infecciosas por mililitro de vírus adicionado.

Calcule o número de unidades infecciosas por mililitro com a seguinte fórmula ao interpretar o fluxo. Resultados do citômetro. Observe que só é possível obter cálculos precisos de títulos quando as células infectadas não receberam mais do que uma integração viral por célula.

Para garantir que esse seja o caso, use células com menos de 15% de taxa de infecção para os cálculos. As células com taxas de infecção mais altas provavelmente terão recebido vários integres virais por célula. A diluição sugerida na etapa dois deve produzir várias amostras dentro dessa faixa de infecção.

O ideal é usar várias amostras para gerar um gráfico de titulação a partir do qual você pode calcular o título final. A fórmula calculada a partir da linha linear ajustada pode ser usada para calcular o título viral, mas você pode calcular o título usando uma única amostra, se necessário. Pode-se esperar um título de uma vez 10 elevado à sétima unidade de transdução por mililitro para vírus não concentrado e um vezes 10 elevado à oitava unidade de transdução por mililitro para vírus concentrado.

Acabamos de mostrar como produzir lentivírus ao fazer este procedimento. É importante cumprir todos os regulamentos de biossegurança e descartar os resíduos adequadamente. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.