Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Introdução. Olá. Somos do Instituto de Ciências Biométricas da Universidade Federal de Faja, no Brasil. Neste vídeo, prepararemos espalhamentos cromossômicos de células-tronco embrionárias humanas para detectar possíveis alterações cromossômicas miraculosas. Embora se tenha demonstrado que as células-tronco embrionárias humanas apresentam um cariótipo estável e mantido, muitos estudos relataram que, dependendo das condições de cultivo, elas tornam-se propensas a adquirir anomalias cromossômicas, como a adição de cromossomos inteiros ou partes de cromossomos.

A caracterização da integridade genética de HASS in vitro é crucial considerando estudos essenciais de embriogênese e testes de fármacos. Além disso, para propostas terapêuticas futuras, alterações cromossômicas são uma preocupação real, pois estão frequentemente associadas à carcinogênese. Então, vamos começar.

Tratando as células com ate Neste procedimento, nós o utilizamos. Oito a nove linhas curadas no F 12 suplementado com 20% de substituição de soro sem contagem e 80 a nove gramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos. Comece removendo o frasco de cultura do incubador e, sob uma capela de fluxo laminar, adicione coit até uma concentração final de 0,1 micrograma por mililitro.

A adição de Coit à mediana induz mitoca, repouso e metáfase. Quando os cromossomos estiverem bem condensados e puderem ser mais facilmente visualizados ao microscópio, certifique-se de usar técnicas estéreis para evitar contaminação. Após ter adicionado Coit, mantenha o frasco e retorne as células ao incubador.

Após o período de incubação, as células ainda não estão prontas para serem fixadas. Não é necessário trabalhar em condição estéril. Comece aspirando o meio e, ao terminar, adicione uma triptase.

O DTA é de 0,05% para o frasco. Certifique-se de adicionar quantidade suficiente de triptase para cobrir a superfície inferior das células. Tampe o frasco e agite suavemente para distribuir uniformemente.

A tripsina permite que as células incubem por cinco minutos à temperatura ambiente. Após os cinco minutos de incubação à temperatura ambiente, as células não deverão mais estar aderidas ao fundo do frasco e você precisará inativar a tripsina adicionando meio de cultura contendo soro ou adicionando suavemente soro às células. Remova cuidadosamente a tampa do frasco e adicione o meio de cultura ou o soro, permitindo que o líquido escorra pelo fundo do frasco sobre as células.

Pipete a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes para dissociar completamente as células. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros, mas antes de fazê-lo, certifique-se de que as células foram bem dissociadas e de que a suspensão não contém nenhum agregado celular visível. Após concluir a transferência, tampe o tubo e centrifugue.

Dobre a suspensão por cinco minutos. Após a centrifugação a 800 RPM, deve haver uma pelota celular no fundo do tubo. Tenha cuidado para não perturbar a pelota celular.

Aspire o sobrenadante utilizando uma pipeta P1000 até que reste apenas aproximadamente 200 microlitros. Este é um volume mediano para o Resus. Suspender o pellet em Resus.

Suspenda o palato. Agite suavemente o tubo com os dedos várias vezes. Certifique-se de que as células foram bem suspensas, verificando se não há agregados de células restantes na solução.

Neste ponto, a solução deve estar turva. Em seguida, você precisa adicionar cinco mililitros de uma solução de cloreto de potássio 75 milimolar pré-aquecida a 37 graus Celsius. A solução hipotônica deve ser adicionada muito lentamente pela parede do tubo enquanto você gira o tubo.

Após ter adicionado os primeiros três mililitros, tampe o tubo firmemente e com cuidado. Homogeneíze a suspensão celular com uma solução hipotônica virando suavemente o tubo na posição horizontal e girando-o lentamente.

Prossiga adicionando lentamente os dois mililitros restantes da mesma maneira que antes. A proposta da solução hipotônica é aumentar o volume celular para permitir que os cromossomos se desemaranhem. Assim, este período de incubação é crucial para obter bons espalhamentos cromossômicos. Quando os cinco mililitros inteiros tiverem sido adicionados, tampe o tubo e incube as células em banho-maria a trinta e sete graus Celsius por 15 minutos.

Quando o período de incubação de 15 minutos for concluído, remova o tubo do banho-maria. Neste momento, você pode trabalhar na câmara de exaustão, pois os vapores produzidos pela solução fixadora são tóxicos. Se você não tiver acesso a uma câmara de exaustão, certifique-se de trabalhar em uma área bem ventilada.

Retire a tampa do tubo e adicione três gotas da solução fixadora. Esta é uma proporção de três para um de metanol e ácido acético e deve ser preparada no dia do uso. Tampe o tubo firmemente e gire suavemente o tubo na posição horizontal, fazendo-o rodar lentamente primeiro no sentido horário e depois no sentido anti-horário.

Centrifugue o tubo por cinco minutos a 800 RPM sem freio. É muito importante que o ciclo de centrifugação pare lentamente para evitar perda de material causada pela desintegração celular após a centrifugação. Este estado cardíaco vive em cerca de 200.

Só para suspender o palato, agite suavemente o tubo com os dedos várias vezes. Certifique-se de que as células foram bem suspensas, verificando se não restam aglomerados de células. Adicione lentamente, pela parede do tubo, a solução fixadora até atingir três mililitros, girando o tubo após ter adicionado os primeiros três mililitros.

Tampe o tubo T firmemente e homogeneíze cuidadosamente a suspensão celular girando suavemente o tubo na posição horizontal e rotacionando-o lentamente. Certifique-se de realizar pelo menos uma rotação completa. Para maximizar esse processo de mistura, adicione mais.

Adicione dois mililitros da solução fixadora junto à parede do tubo para sedimentar as células. Armazene a suspensão celular a quatro graus Celsius durante a noite. As células fixadas podem ser armazenadas na solução fixadora a quatro graus Celsius por meses.

Lave as células no dia seguinte, centrifugando-as por cinco minutos a 800 ×g sem freio. Descarte o sobrenadante e ressuspenda em aproximadamente 200 microlitros. Suspenda o pellet agitando o tubo com os dedos várias vezes.

Certifique-se de que as células tenham sido bem associadas e de que a suspensão não contenha nenhum agregado celular visível. Adicione cinco mililitros de solução fixadora fresca lentamente pela parede do tubo. Tampe o tubo e homogeneíze as células girando suavemente o tubo na posição horizontal enquanto o rotaciona lentamente.

Além de proteger as células, a solução fixadora remove lipídios e depois desnatura proteínas, e como resultado, facilita a espalhamento dos cromossomos. Centrifugue o tubo por cinco minutos a 800 RRP M sem freio. Preparação das lâminas: na etapa de centrifugação, deixe uma quantidade suficiente de solução para homogeneizar o paladar celular.

Essa quantidade de líquido pode depender do número de células. Agite suavemente o tubo com os dedos várias vezes. Certifique-se de que as células estejam bem dissociadas verificando se não há aglomerados celulares visíveis.

Neste momento, a solução deve ser alvo adicionado, de 20 a 30 microlitros de suspensão celular sobre uma lâmina limpa e seca movendo a pipeta paralelamente a esta superfície clara. À medida que a solução fixadora evapora, a superfície clara torna-se imediatamente granulada. Expor esta superfície clara voltada para cima ao vapor de água quente por 30 segundos para fazer as células incharem.

Analisando essas lâminas. Após preparar essas lâminas, analise-as em microscópio de contraste de fase utilizando as objetivas de 10 e as objetivas peludas para verificar se a densidade celular é adequada para análises posteriores. Esta lâmina é um exemplo daquelas que estão muito concentradas.

Observe que os núcleos das células estão muito próximos aos espalhamentos metafásicos. Se você tiver uma lâmina em que a densidade celular for muito alta, então dilua a suspensão celular adicionando mais solução fixadora. Esta lâmina mostra a densidade celular desejada.

Observe que os espalhamentos metafásicos estão bem dispersos e isolados. Uma vez obtido um lâmina com densidade celular ideal, não pode ser corada e analisada. Evite escolher metáfases próximas ao núcleo, pois os cromossomos podem estar escondidos ou bloqueados à vista.

Procure metáfases que estejam arredondadas, mas certifique-se de que nenhum cromossomo esteja alinhado fora da metáfase ao selecionar metáfases arredondadas e bem isoladas. Como no próximo slide, tente evitar relatar falsos IES como ganho de cromossomos gerado por duas extensões adicionais. Misture-os, ou pela perda de cromossomos gerada por cromossomos alinhados.

Esperamos que este vídeo o ajude em seus experimentos futuros. Se tiver alguma dúvida, não hesite em nos contatar. Divirta-se e boa sorte.