Uso do Kit de Detecção de Protease Fluorescente para determinar a atividade de protease

Este protocolo começa com a adição de tampão de incubação, solução de caseína FXI e amostra contendo a protease de interesse a um tubo de microcentrífuga, seguida de mistura suave e incubação a 37 graus Celsius por 60 minutos no escuro. Para interromper a reação proteolítica ao final do período de incubação, adicione a solução de TCA, misture suavemente e incube novamente a 37 graus Celsius por 30 minutos, também no escuro. Esta etapa fará com que o substrato não reativo precipite.

Centrifugue a amostra por 10 minutos. A 10.000 Gs, remova o sobrenadante, que contém os fragmentos marcados solúveis em ácido do FXI. Transfira o sobrenadante para uma placa de poços ou múltiplos poços, dilua com tampão do ensaio e leia a amostra em um fluorímetro.

Olá, sou Carrie Cup Vineyard e sou cientista na nossa instalação da Sigma Aldridge DeKalb em St. Louis, Missouri. Hoje vou mostrar um procedimento para a determinação da atividade de protease por fluorometria. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório de controle de qualidade para determinar baixa atividade de protease.

Então vamos começar. Para este procedimento, o tampão de incubação, o tampão do ensaio e a solução de ácido tricloroacético 0,6 normal ou TCA são fornecidos como soluções prontas para uso. Aliquote a solução de Cain marcado com fite em volumes menores e armazene a menos 20 graus Celsius, certificando-se de proteger da luz utilizando frascos âmbar ou envolvendo tubos transparentes com papel alumínio.

Citar o substrato fite Cain minimiza a necessidade de ciclos repetidos de congelamento e descongelamento; ciclos repetidos de congelamento e descongelamento ou agitação vigorosa ou mistura do fite Cain podem levar à separação do fite do Cain, resultando em fundo mais elevado. Caso esteja calibrando o fluorímetro ou determinando a faixa linear para o sinal do fit e, prepare a solução controle do fit. Prepare a solução recentemente, reconstituindo-a no tampão do ensaio na concentração apropriada.

Uma vez pronto, proteja a solução da luz. Por fim, prepare o controle da protease tripsina adicionando 100 microlitros de ácido clorídrico de um milimolar ao frasco com tripsina liofilizada e misture brevemente para garantir que a tripsina esteja dissolvida. O armazenamento da tripsina em condições ácidas aumenta sua estabilidade.

Observe que a solução controle de tripsina é sensível à temperatura e não é estável em baixas concentrações. Em seguida, inicie o preparo de todas as amostras do ensaio, que incluem amostras de teste, controle e branco ao longo do ensaio. Mantenha as amostras protegidas da luz para cada amostra de teste.

Combine em um tubo de microcentrífuga, 20 microlitros de tampão de incubação, 20 microlitros do substrato fitc-casena e 10 microlitros da amostra-teste. Pode-se usar um tubo de microcentrífuga transparente, desde que a amostra seja incubada no escuro. Observe também que amostras-teste com alta atividade proteolítica precisarão ser diluídas.

A amostra controle de tripsina é usada como controle positivo para verificar se o ensaio está funcionando corretamente, a fim de determinar o limite de detecção ou para criar uma curva padrão geral. Para preparar o controle de tripsina, combine uma parte de tripsina acidificada com nove partes de tampão de incubação ou com o tampão utilizado para as amostras de teste e misture bem. A concentração final de trabalho de tripsina é de 20 microgramas por mililitro. Se estiver usando uma protease específica diferente, prepare a solução controle com essa protease específica e um tampão apropriado.

Continue a preparação da amostra controle combinando 20 microlitros de tampão de incubação, 20 microlitros de substrato fz cain e 10 microlitros do controle de tripsina em um tubo de microcentrífuga. Recomenda-se executar pelo menos uma amostra controle contendo cinco nanogramas de tripsina em cada ensaio ou utilizar diluição seriada. A última amostra é o branco, preparado pela combinação de 20 microlitros de tampão de incubação, 20 microlitros do substrato Fitz Caine e 10 microlitros de água ultrapura em um tubo de microcentrífuga.

Com os três tipos de amostras prontos, misture suavemente cada tubo e incube a 37 graus Celsius no escuro por 60 minutos. Tenha cuidado para não misturar com muita força, pois uma turbulência excessiva pode causar um fundo de fluorescência elevado e reduzir a sensibilidade do ensaio. Pode-se incubar por até 24 horas para aumentar a sensibilidade, mas incubações mais longas não são recomendadas, pois a caseína FXI pode começar a se degradar.

Novamente, para evitar um alto fundo de fluorescência ao final da incubação, utilize equipamento de proteção adequado para adicionar 150 microlitros da solução de TCA a cada tubo de microcentrífuga. Após a incubação com TCA, deve-se observar uma névoa branca presente no tubo, que corresponde à precipitação da mistura de cain não digerida e insolúvel; misture suavemente e incube a 37 graus Celsius no escuro por 30 minutos. Ao final da incubação com a solução de TCA, centrifugue os tubos por 10 minutos a 10.000 Gs em temperatura ambiente.

O sobrenadante contém os fragmentos de Cain marcados solúveis em ácido utilizados para a medição de fluorescência; pipete cuidadosamente a partir da parte superior do tubo para que nenhum do precipitado do pellet seja aspirado na ponta da pipeta, o que causaria um resultado falso positivo durante a detecção fluorescente subsequente para medir a atividade da protease. Utilizando um fluorímetro, combine 10 microlitros do sobrenadante de TCA com um mililitro do tampão de ensaio em um tubo e misture suavemente. Além disso, dilua o padrão de FE para análise adicionando 10 microlitros de FE a um mililitro de tampão de ensaio. O controle de FE e o padrão de tripsina fornecem um nível de fluorescência que a amostra não deve ultrapassar. A solução do sobrenadante de TCA e tampão de ensaio pode ser armazenada no escuro a dois a oito graus Celsius por até 24 horas antes da medição da fluorescência.

Se a medição for feita usando um vete, transfira um mililitro da solução para um vete apropriado; se um grande número de amostras for analisado, uma placa de 96 poços e um leitor de placas fluorescente podem ser utilizados para adquirir dados fluorométricos. Neste ensaio, a isotiocianato de fluoresceína é fornecida como controle para possível calibração do instrumento. É mostrado aqui um intervalo representativo de linearidade do sinal FS e após o procedimento descrito.

Utilizando este kit com um tempo de incubação de 30 minutos na primeira etapa de incubação, obtém-se esta curva padrão típica para amostras de tripsina e controle variando de 1,5 nanogramas a 25 nanogramas. As medições de fluorescência foram realizadas em uma placa de múltiplos poços. O limite de detecção do ensaio é a quantidade de protease que produz uma leitura de fluorescência significativa acima do valor obtido com a amostra em branco.

Hoje mostramos a você como usar o kit de determinação de protease Sigma Aldridge para detectar atividade proteolítica fluorométrica em uma amostra biológica. Embora este kit esteja otimizado para seu uso, é importante lembrar que, para suas proteases específicas, podem ser necessárias pequenas modificações. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.