Name: Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Aprenda a transfectar DNA plasmidial em músculos esqueléticos de camundongos adultos usando eletroporação in vivo. Este método permite visualizar a expressão proteica por microscopia de fluorescência em fibras musculares.

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Agradecemos ao Dr. T. Otis, Departamento de Neurobiologia, UCLA, para compartilhar as instalações TPLSM conosco, Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiologia, RWTH Aachen, Alemanha, para o tipo de doação o plasmídeo pEYFP-ClC1, eo Sr. . R. Serrano para suporte técnico. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH / NIAMS concede AR047664 e AR54816.

Procedimentos experimentais para a eletroporação in vivo de músculos FDB e IO <ol><li> Antes de iniciar o em protocolos de eletroporação in vivo, plasmídeos de expressão de mamífero deve ser amplificado para produzir concentração na faixa de 2-5 mg para Nota plasmídeo / mL de TE:. Rotineiramente usar kits de amplificação comerciais e seguir os procedimentos do fabricante. Comercial plasmídeos expressão carregando o trabalho promotor CMV muito bem no músculo esquelético em transfections vivo. </li><li> Volume da alíquota necessária (10-20 mL) da solução de plasmídeo e salve-o em dois tubos Eppendorf de 0,5 ml (um para cada pé do mouse). </li><li> Prepare uma solução contendo 2 hialuronidase mg / ml em Tyrode estéril. </li><li> Usando uma caixa de anestesiar, profundamente anestesiar um rato usando 4% de isoflurano em O2 com uma máquina aprovado gás anestésico. Colocar o animal em uma almofada de aquecimento (37 ° C) e manter a anestesia usando uma máscara facial de roedores. Monitorar a profundidade anestésica por reflexo pitada dedo do pé. </li><li> Sob observação com um microscópio de dissecção, injetar 10 mL da solução de hialuronidase sob a footpads de um dos pés do mouse usando um 1 &quot;agulha de calibre 33 longa estéril. Penetrar na pele em um ponto perto do calcanhar do pé e avançar a agulha por via subcutânea para a base dos dedos dos pés para ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Repita o procedimento com o outro pé se assim o desejar. </li><li> Desligue a anestesia e coloque o mouse em uma gaiola. Permita que ele se recuperar totalmente da anestesia. </li><li> Após uma hora, anestesiar o animal para uma segunda vez e coloque-o no bloco de aquecimento. Seguindo o mesmo procedimento descrito para a solução de hialuronidase, injetar um total de 20-50 mg do DNA plasmidial (dependendo do tamanho da construção do plasmídeo). O volume de injeção total deve ser inferior a 20 mL / pé. Nota: quando L μ 15-20 é necessário, é aconselhável fechar a pele no ponto de entrada da agulha com tecido cola. </li><li> Desligue a anestesia e coloque o mouse em uma gaiola. Permita que ele se recuperar totalmente da anestesia e esperar por 10-15 min. </li><li> Anestesiar o animal pela terceira vez e coloque-o no bloco de aquecimento. </li><li> Selecione um pé do animal. Coloque uma agulha de acupuntura banhado a ouro sob a pele do calcanhar, e uma segunda na base dos dedos dos pés. Eletrodos são orientados paralelamente entre si e perpendicular ao eixo longitudinal do pé. </li><li> Ligue a cabeça das agulhas (eletrodos) para o estimulador elétrico que utiliza micro-clip conectores. Electroporate os músculos através da aplicação de 20 pulsos, 20 ms de duração / cada, em 1Hz. Dependendo do espaçamento dos eletrodos, amplitude da tensão dos pulsos é ajustado (através do monitoramento com um osciloscópio) para produzir um campo elétrico de 100 V ~ Nota / cm:. Não contrações em resposta aos estímulos devem ser observados se o nível de A anestesia é adequada. </li><li> Se assim o desejar, repita os procedimentos acima no pé contralateral do animal. </li><li> Devolver o animal para sua gaiola e uma vez totalmente recuperado da anestesia mantê-lo sob observação. Nota: se o procedimento foi normal, o animal deve recuperar a mobilidade total dentro de 30 minutos e depois está pronto para ser enviado de volta para a sala de animais no biotério. As injeções de hialuronidase e DNA no footpads não têm perceptível efeitos adversos sobre os animais. Uma vez recuperado da anestesia, os ratos são capazes de amble normalmente ao redor da gaiola. Como uma precaução adicional, adicionar à água potável do carprofeno animais em 0,0027 mg / ml durante 2 dias como um analgésico. </li><li> Expressão da proteína pode ser analisada 2-8 dias após a transfecção. No entanto, a expressão sustentada de muitas proteínas tem sido observado por vários meses. </li></ol> NOTA: Todos os procedimentos animais foram aprovados pela Research o chanceler UCLA Animal da Comissão, como manda a Lei do Bem-Estar Animal e do PHS Política de Assistência Humanitária e Uso de Animais de Laboratório. Resultados representativos: A correcta aplicação da eletroporação in vivo nos procedimentos descritos acima devem resultar na transfecção de plasmídeos eficaz nos músculos FDB e IO. No entanto, a eficiência de expressão de variantes de proteínas transgénicas dependerá do plasmídeo, o tamanho ea complexidade da proteína, as propriedades funcionais da proteína, e uma série de outras variáveis ​​fora de nosso controle. Como ilustrado na Figura 1 para um músculo FDB electroporated na presença de um comercial de codificação (PMR-mCherry) plasmídeo para a proteína mCherry, a maioria das fibras musculares são transfectadas com nosso protocolo, como ilustrado pelo fato de a maioria deles mostrar fluorescência vermelha. Isso não exclui a possibilidade de que as fibras individuais apresentam diferentes graus de expressão da proteína, ou que não são poucas fibras transfectadas em todos os três. Deve-be observou que a expressão eficiente de grandes quantidades de proteínas fluorescentes como mCherry, EGFP, ECFP, e EYFP, não prejudica a excitabilidade das fibras musculares e propriedades acoplamento excitação-contração. Na verdade, eles são indistinguíveis daqueles nos músculos farsa transfectadas (resultados não mostrados). Abordagens práticas utilizadas para verificar a expressão de proteínas fluorescentes localizadas-marcado em fibras musculares esqueléticas. A localização intracelular do di novo expressaram proteínas transgênicas é regularmente avaliada pelo simultânea aquisição, utilizando a TPLSM, imagens fluorescentes das tags e imagens respectivas de marcadores bem identificados das estruturas celulares. O mais típico destes últimos são: a) geração de segundo harmônico (SHG) imagens, que surgem a partir da anisotropia miosina do sarcômero A bandas (centrado no M-lines) 9,10 e, b) di-8-ANEPPS fluorescência imagens, que podem ser obtidos por rotulagem a superfície e transversal tubular (túbulos T) do sistema de membranas das fibras musculares com este dye11 impermeant potenciométrica. Em imagens de fluorescência de fibras musculares coradas com di-8-ANEPPS, o T-túbulos aparecem como faixas estreitas de fluorescência orientada aproximadamente ortogonal ao eixo longo da fibra. Estas bandas são desigualmente espaçadas umas das outras: elas são separadas por uma longa distância que se estende por todo o M-linhas, e um curta que se estende por todo o 11 Z-line. Expressão e localização de α-actinina-EGFP em fibras musculares esqueléticas. Um exemplo da expressão de uma variante com a tag da proteína muscular estruturais α-actinina é mostrado na Figura 2. Esta proteína é conhecida por ser um dos principais componentes do Z-line e, como tal, é rotineiramente utilizado como um marcador deste structure12. Nós transfectadas músculos FDB e IO com a codificação pEGFPN1-α-actinin1 plasmídeo para consumo humano (músculo não-) α-actinina marcados no terminal C com EGFP. Seis dias após a transfecção, descobrimos que, avaliado pela EGFP distribuição de fluorescência, α-actinina é principalmente expresso em faixas estreitas igualmente espaçados ao longo do eixo da fibra. A única banda por sarcômero é visto (Figuras 2A e 2D). A co-localização dessas bandas com o Z-linhas é demonstrada comparando a distribuição de EGFP fluorescência com o SHG (Figura 2B) e di-8-ANEPPS (Figura 2E) imagens. Como mostrado pela imagem de sobreposição (Figura 2C), α-actinina-EGFP bandas se alternam com as bandas SHG, indicando que eles estão localizados a meio caminho entre dois períodos consecutivos de M-bandas, coincidindo com a localização do Z-lines. Nas fibras musculares transfectadas corados com di-8-ANEPPS, α-actinina-EGFP bandas são vistos centrado entre cada par de túbulos T (Figura 2F) que são conhecidos para flanquear a Z-linhas (ou seja, separadas por uma distância mais curta), indicando assim que transgênicos α-actinina é direcionado para o Z-line. Expressão de DHPRα1s marcados no N-terminal com EGFP A eficiência de transfecção muscular com pEGFPC1.1-DHPR α 1s é verificada em imagens TPLSM (eg Figura 3A), mostrando que a maioria das fibras expressar EGFP-DHPRα1s (uma proteína transmembrana). A característica mais proeminente de fibras transfectadas é o padrão duplo em faixas de EGFP fluorescência (Figuras 3A &amp; 3B), como seria de esperar se esta proteína foi voltado para o T-túbulos. Também pode ser observado na Figura 3 que, embora diferentes fibras mostrar vários níveis de intensidade de fluorescência, o padrão de bandas de fluorescência de uma fibra individual parece ser mantida homogênea ao longo da fibra. Na maior ampliação (Figura 3B), pode ser visto claramente que o espaçamento desigual entre as bandas é semelhante à observada em fibras coradas di-8-ANEPPS (eg Figura 2E). As imagens de sobreposição (Figura 3B e 3E) mostram que as bandas SHG estão localizados dentro do maior espaçamento entre EGFP-DHPRα1s bandas, corroborando que esta proteína está no T-túbulos. Adicionais FRET medições com o ânion não-fluorescentes lipofílico DPA (dados não mostrados) demonstrar ainda mais que a metade está dentro de EGFP alguns nanômetros do folheto interno de membranas túbulos T &#39;. Localização e avaliação funcional da expressão de EYFP-ClC1 Fibras transfectadas com pEYFP-ClC1, que codifica uma construção EYFP-tagged (no N-terminal) do canal de cloreto de músculo esquelético (ClC1), bandas de mostrar EYFP de fluorescência (Figura 4A) com um padrão semelhante ao observado para EGFP-DHPRα1s &#39;expressão (Figura 3A) e correspondentes ao arranjo dos túbulos T, conforme ilustrado com di-8-ANEPPS coloração (Figura 2E). Como esperado, a sobreposição de EYFP-ClC1 (Figura 4A) e imagens de SHG (Figura 4B), como mostrado na overlay (Figura 4C), mostram que as bandas SHG estão centradas na grande espaçamento of entre bandas EYFP fluorescência. , A fim de avaliar se a expressão de EYFP-ClC1 resulta em um aumento significativo na condutância de descanso das fibras musculares, como esperado a partir da superexpressão de canais de cloro funcional, fibras musculares enzimaticamente dissociada do músculo FDB transfectadas e estudou as suas propriedades eletrofisiológicas usando uma configuração de dois microeletrodos experimental descrito anteriormente 6,11,13. Figura 5 mostra os resultados de duas fibras: uma expressando uma grande quantidade de EYFP-ClC1 avaliado a partir de medições globais intensidade de fluorescência em um microscópio de fluorescência padrão (não mostrado), eo outro é um controle não-transfectadas. O registro de tensão na Figura 5A (obtido a partir da fibra muscular expressar EYFP-ClC1) demonstra que, devido ao excesso de condutância em repouso, a fibra é quase não-excitáveis. Pulsos de estímulo de corrente de até 400nA (0,5 ms) necessário para ser usado a fim de obter uma resposta muito pequena ativa (sem overshoot Figura 5A). Após a substituição da solução de Tyrode externo para um contendo 500 mM do bloqueador dos canais de cloreto de sódio 9-ACA, 200 pulsos atuais nA foram suficientes para provocar um potencial de ação (Figura 5B), embora muito mais lento e mais amplo do que os registrados na fibra de controle ( Figura 5C). Como esperado, a adição de 9 ACA teve efeitos mínimos sobre esta fibra controle (Figura 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. Eficiência Transfection do método de eletroporação in vivo. Brightfield (A) e de fluorescência (B) imagens de um músculo FDB transfectadas com pmr mCherry. Dias após o protocolo de eletroporação: 12 dias. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">clique aqui</a> para uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Expressão e direcionamento de α-actinina-EGFP em fibras FDB. Painéis A e B são EGFP fluorescência e imagens SHG, respectivamente, de uma fibra expressando α-actinina-EGFP. Painel C é uma superposição das imagens em A e B. Os painéis D e E são as imagens de fluorescência de outra fibra expressando α-actinina-EGFP e corados com di-8-ANEPPS, respectivamente. Painel F é a superposição de imagens em D e E. Dias após eletroporação protocol: 6 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Expressão e direcionamento de EGFP-DHPRα1s em fibras FDB. Painel A, EGFP imagem da fluorescência de um grupo de fibras expressando EGFP-DHPRα1s. Painel B é uma ampliação da praça no painel A, a fim de mostrar melhor o padrão de bandas da expressão da proteína. Painel C é a imagem SHG correspondente à imagem no painel A. Painel D é a sobreposição das imagens A e C. Painel E é um alargamento da área indicada no painel de D. Dias após o protocolo de eletroporação: 20 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Expressão e direcionamento de EYFP-ClC1 em fibras FDB. Os painéis A e B são EYFP fluorescência e imagens SHG, respectivamente, de fibras expressando EYFP-ClC1. Painel C é a superposição das imagens em painéis A e B. Painel D é um perfil de intensidade medida ao longo da linha branca em destaque na imagem no painel C. Dias após a eletroporação protocolo: 7 dias. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Fibras avaliação eletrofisiológica transgênicos expressando EYFP-ClC1. Painéis A e B são registros de tensão de uma fibra expressar EYFP-ClC1 em resposta a pulsos de corrente antes e após o tratamento com 9-ACA, respectivamente. Painéis C e D são registros de voltagem (potenciais de ação) provocou em resposta a pulsos de corrente em uma fibra não-transfectadas antes e após o tratamento com 9-ACA, respectivamente.

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</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Descrevemos aqui os passos detalhados que devem ser seguidas a fim de atingir transfections eficaz de plasmídeos de DNA em fibras musculares esqueléticas em por eletroporação in vivo. As principais vantagens da nossa abordagem são a simplicidade de implementação, e sua mínima invasividade que resulta em perigo para a saúde negligenciável para os animais. Na realidade, os protocolos acima descritos eletroporação não implicam muito mais do que duas injeções subcutâneas por pé, seguido por um protocolo de...

transfecção de dna de mamíferos usando músculos esqueléticos in vivo eletroporação

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A crescente interesse em biologia celular é a de expressar formas transgenicamente modificado de proteínas essenciais (por exemplo, constrói fluorescente etiquetado e / ou variantes mutantes), a fim de investigar sua distribuição endógenos e relevância funcional. Uma abordagem interessante que foi implementada para cumprir este objectivo em células totalmente diferenciadas é o<em&gt; In vivo</em&gt; Transfecção de plasmídeos por vários métodos em tecidos específicos, tais como o fígado<sup&gt; 1</sup&gt; Muscular, esquelético<sup&gt; 2,3</sup&gt;, E até mesmo o cérebro<sup&gt; 4</sup&gt;. Apresentamos aqui uma descrição detalhada dos passos que devem ser seguidas a fim de transfecção eficiente material genético nas fibras do<em&gt; Flexores dos dedos brevis</em&gt; (FDB) e<em&gt; Interósseos</em&gt; (IO) músculos de camundongos adultos usando um<em&gt; In vivo</em&gt; Abordagem eletroporação. Os parâmetros experimentais foram optimizados de forma a maximizar o número de fibras musculares, minimizando os danos transfectadas tecido que pode prejudicar a qualidade ea quantidade das proteínas expressas em fibras individuais. Temos verificado que a implementação da metodologia descrita neste trabalho resulta em um alto rendimento de proteínas solúveis, ou seja EGFP e ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaína, FKBP12, β2a-DHPR, etc; proteínas estruturais, ou seja minidystrophin e α-actinina e proteínas da membrana, ou seja α1s-DHPR, RYR1, cardíacas Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Trocador, NaV1.4 Na canal, SERCA1, etc, quando aplicada a FDB, IO e outros músculos de camundongos e ratos. A expressão eficiente de algumas dessas proteínas tem sido verificado com bioquímicas<sup&gt; 3</sup&gt; E provas funcionais<sup&gt; 5</sup&gt;. No entanto, de longe, a abordagem mais comum de confirmação utilizados por nós são de microscopia fluorescente padrão e dois fótons de microscopia de varredura a laser (TPLSM), que permitem identificar não apenas a expressão geral, mas também a localização detalhada intracelular, de construções de proteína fluorescente etiquetado. O método poderia ser igualmente utilizado para transfecção de plasmídeos que codificam para a expressão de proteínas de relevância fisiológica (como mostrado aqui), ou por interferência de RNA (siRNA) com o objetivo de suprimir a expressão de proteínas normalmente expressa (não testado por nós até o momento). Note-se que a transfecção de fibras musculares FDB e IO é particularmente relevante para a investigação da fisiologia de mamíferos desde que as fibras musculares enzimaticamente dissociada estes músculos são atualmente um dos modelos mais adequados para investigar os mecanismos básicos de acoplamento excitabilidade e excitação-contração em corrente ou tensão condições clamp<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Descrevemos os procedimentos detalhados para a transfecção eficiente de DNA plasmidial nas fibras dos músculos do pé de ratos ao vivo usando o eletroporação ea visualização posterior de expressão da proteína através de microscopia de fluorescência.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

Um interesse crescente na biologia celular é expressar formas transgenicamente modificadas de proteínas essenciais (por exemplo, constructos marcados com fluorescência e/ou mutantes ...

A eletroporação pode ser realizada in vivo para transfectar DNA, plasmídeos e expressar transgenes em músculos adultos do flexor digitorum brevis (FDB) ou interósseos (IO) de camundongos. O procedimento começa com a anestesia do camundongo. A superfície plantar de uma pata é preparada para a primeira injeção de hialuronidase inserindo-se a agulha no calcanhar e guiando-a subcutaneamente ao longo do pé.Após uma hora, o animal é reanestesiado e o plasma é injetado na mesma região subcutânea do pé onde a hialuronidase foi injetada. Após 10 minutos, agulhas de acupuntura revestidas a ouro são colocadas subcutaneamente conforme mostrado. Os pulsos de eletroporação são aplicados após conectar as agulhas ao estimulador, se necessário.O procedimento pode ser repetido no pé contralateral. Após um período que varia de dois a oito dias, o animal é sacrificado, os músculos são dissecados e a transfeção da proteína desejada é verificada mediante observação da fluorescência ao microscópio. Olá, sou Marino DeFranco do laboratório de Julio Vera, do Departamento de Fisiologia da Escola de Medicina Davy Geffen na UCLA.Hoje vamos mostrar um procedimento para a transfeção in vivo de plasmídeo que expressa proteína transgênica em fibras musculares de camundongos adultos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a expressão e localização de proteínas transgênicas, bem como o efeito da superexpressão da proteína na fisiologia da fibra muscular. Então, vamos começar.Antes de iniciar os protocolos de eletroporação in vivo, os plasmídeos de expressão de mamíferos devem ser amplificados para obter concentrações na faixa de dois a cinco microgramas de plasmídeo por microlitro de tampão TE. Normalmente utilizamos kits de amplificação da Qiagen e seguimos as instruções do fabricante. Sugerimos plasmídeos de expressão comerciais que contenham o promotor CMV, por exemplo, EEG FPC um ou EEG FPN um da In Vitrogen.Como este promotor funciona muito bem no músculo esquelético, em cortes in vivo, demonstraremos o procedimento. Usando o P EEG FPN um, preparamos previamente uma solução contendo dois miligramas por mililitro de hialuronidase em tiros estéril. Esta solução é mantida à temperatura ambiente até ser usada para preparar os animais.Para a transfeção, utilizamos uma caixa de anestesia conectada a um aparelho de anestesia a gás aprovado e anestesiamos profundamente o animal com 4% de isoflurano em oxigênio. Uma vez anestesiado, aplicamos pomada para proteger os olhos do camundongo contra ressecamento durante os procedimentos subsequentes de anestesia. Coloque o animal sobre uma placa aquecida regulada em 37 graus Celsius e mantenha a anestesia utilizando uma máscara facial odontológica.Monitore a profundidade da anestesia verificando o reflexo de preensão do dedo do pé. Quando o animal estiver profundamente anestesiado, use uma agulha estéril de calibre 33 com um centímetro de comprimento para injetar 10 microlitros de solução UR elevada sob a pele da almofada plantar de uma das patas do camundongo, observando ao microscópio estereoscópico; penetre a pele em um ponto próximo ao calcanhar da pata e avance a agulha subcutaneamente em direção à base dos dedos.Por cerca de um quarto de polegada, injete a solução suavemente para evitar um excessivo abaulamento da pele. Repita o procedimento com o outro pé. Se desejado, a enzima injetada amolecerá, ao longo de um período de aproximadamente uma hora, o tecido conjuntivo que envolve as fibras musculares, por meio da hidrólise do ácido hialurônico.Isso facilitará a difusão do plasmídeo de DNA que será injetado posteriormente no espaço intersticial entre as fibras. Após a injeção de hialuronidase, desconecte a anestesia e coloque o camundongo em uma gaiola. O animal recuperará da anestesia em três a quatro minutos.Após uma hora, anestesie o animal pela segunda vez. Colete 10 microlitros da solução de plasmídeo e coloque uma gota na parte posterior de um pequeno barco de soro limpo. Recolha a gota com a seringa de injeção e injete-a no coxim plantar.Após seguir o mesmo procedimento descrito para a solução de hialuronidase para proteínas maiores, pode-se injetar quantidades maiores de plasma. Recomendamos não injetar mais de 20 microlitros quando for necessário mais de 15 microlitros. Recomendamos usar cola tecidual para fechar a pele no ponto de entrada da agulha, a fim de prevenir qualquer risco de vazamento de DNA através do ponto de punção.Desconecte a anestesia e coloque o camundongo em uma gaiola. Deixe-o recuperar completamente da anestesia e aguarde de 10 a 15 minutos para se preparar para a eletroporação. Anestesie o animal como feito anteriormente.Selecione uma pata do animal, coloque uma agulha de acupuntura revestida a ouro ou eletrodo sob a pele no calcanhar e a segunda na base dos dedos dos pés. As agulhas são orientadas paralelamente entre si e perpendicularmente ao eixo longo da pata. As agulhas de acupuntura têm 160 micrômetros de diâmetro e 13 milímetros de comprimento.São vendidos individualmente embalados e estéreis. Dependendo do espaçamento das agulhas, ajuste a amplitude do pulso para aplicar pulsos de tensão. Gerando um campo elétrico de aproximadamente 100 volts por centímetro.Ajuste a duração do pulso para 20 milissegundos e a frequência para um hertz. Conecte a extremidade dos eletrodos ao estimulador elétrico utilizando conectores de microclipe. Estimule os músculos do pé aplicando 20 pulsos elétricos.Monitore a forma de onda da voltagem no osciloscópio. Nenhuma contração significativa é observada em resposta aos estímulos. Se o nível de anestesia for adequado, caso deseje, enquanto ainda estiver sob anestesia.Repita o procedimento de eletroporação descrito acima no outro pé; após a eletroporação, devolva o animal à sua gaiola e mantenha-o sob observação. Até a recuperação completa da anestesia, o animal deve recuperar plena mobilidade dentro de cinco minutos. Caso não tenham ocorrido reações adversas e o procedimento tenha transcorrido normalmente, como precaução adicional, adicione à água de beber do animal carfin a 0,027 miligramas por mililitro por dois dias.A expressão de proteínas analgésicas pode ser analisada de dois a oito dias após a transfeção. No entanto, observou-se expressão sustentada de muitas proteínas por meses. A eficiência de transfeção de um músculo FDB eletroporado com o plasmídeo comercial P EEG FPN, que codifica para a proteína EGFP, pode ser facilmente visualizada com luz UV proveniente de uma lâmpada UV portátil ou de díodos UV de alta intensidade.Observando o pé do camundongo ao microscópio estereoscópico, pode-se notar que a maioria das fibras musculares foi transfectada com nosso protocolo, conforme ilustrado pelo fato de que a maioria delas exibe fluorescência verde. O microscópio estereoscópico mostra o padrão geral de transfeção do músculo. Repetindo esta observação.O uso de um microscópio de fluorescência com iluminação epiluminiscente permite a visualização do padrão de expressão de EGFP em feixes de fibras musculares ou mesmo em fibras individuais. A eficiência da expressão da proteína mCherry em fibras musculares FDB pode ser avaliada comparando-se as imagens de campo claro e de fluorescência do músculo. A localização intracelular das proteínas transgênicas recém-expressas pode ser avaliada por meio de microscopia de varredura a laser de dois fótons para esse fim.Imagens de proteínas marcadas com fluorescência e imagens de marcadores bem identificados de estruturas celulares são adquiridas simultaneamente. Os mais típicos marcadores de estruturas celulares são as imagens de geração de segundo harmônico ou SHG, que surgem da anisotropia da miosina nos sarcômeros. As bandas A centradas nas linhas M e o corante.Imagens de fluorescência de membranas anexas, que podem ser obtidas marcando as membranas do sistema de túbulos superficiais e transversos, ou túbulos T, das fibras musculares com um corante fluorescente impermeante, em imagens de fluorescência de fibras musculares coradas com o corante oito anep. Os túbulos T aparecem como faixas estreitas de fluorescência orientadas aproximadamente ortogonalmente ao eixo longo da fibra. Essas faixas estão separadas entre si por distâncias desiguais.Eles são separados por uma grande distância, que se estende ao longo das linhas M, e por uma curta, que se estende ao longo da linha Z. Um exemplo da expressão de uma variante marcada da proteína estrutural muscular alfa-actinina é mostrado aqui. Esta proteína é um componente principal da linha Z e é rotineiramente utilizada como marcador dessa estrutura.Transfectamos os músculos FDB e IO com o plasmídeo P-E-G-F-P Fpn um alfa actinina, um que codifica para alfa actinina não muscular humana marcada no terminal C com EGFP seis dias após a transfeção. Verificamos que a alfa actinina é expressa principalmente em faixas estreitas igualmente espaçadas ao longo do eixo da fibra. Observa-se uma única faixa por sarcômero.A colocalização dessas bandas com as linhas Z é evidenciada pela comparação da distribuição da fluorescência de EGFP com as imagens de SHG ou de D eight annex, conforme mostrado pela imagem de sobreposição. As bandas de Alpha Actinina e EGFP alternam-se com as bandas de SHG, indicando que estão localizadas a meia distância entre duas bandas M consecutivas, coincidindo com a localização das linhas Z em fibras musculares transfectadas coradas com d an up Alpha Actinin. As bandas de EGFP são observadas centradas entre cada par de túbulos T, que se sabe flanquear as linhas Z. Isso demonstra que a alfa actinina transgênica é direcionada à linha Z.A expressão e o direcionamento da proteína DHPR alfa um s marcada com EGFP no terminal N são mostrados na figura três.EGFP. A fluorescência é observada principalmente como pares de bandas espaçadas com um padrão semelhante ao dos T dois Es.Superpondo as imagens de SHG e de E-G-F-P-D-H-P-R Alfa um s, demonstra-se que existem duas bandas fluorescentes de EGFP entre duas bandas consecutivas de SHG, sugerindo que a DHPR alfa um s foi corretamente direcionada aos T dois ES D oito e abstendo, não mostrado, fornece uma prova definitiva do direcionamento da DHPR Alfa um St. Fibras transfectadas com P-E-Y-F-P CLC um, que codifica uma construção marcada com EYFP no extremo C-terminal do canal de cloreto do músculo esquelético CLC um, exibem fluorescência de EYFP distribuída em faixas que correspondem ao arranjo dos túbulos T, conforme ilustrado com D oito e abstendo.Como esperado. A superposição das imagens de CLC de EYFP e SG, conforme mostrado na sobreposição, ilustra que as bandas SHG estão centralizadas no grande espaçamento entre as bandas de fluorescência de EYFP. A fim de avaliar se a expressão de CLC de EYFP resulta em um aumento significativo na condutância de repouso das fibras musculares, como esperado pela superexpressão de canais de cloreto funcionais, dissociamos enzimaticamente fibras musculares do músculo FDB TRANSFECTADO e estudamos suas propriedades eletrofisiológicas utilizando uma configuração experimental com dois microeletrodos.Esta imagem mostra os resultados de duas fibras. Uma expressa grandes quantidades de clc EYFP. Uma foi avaliada por meio de medições da intensidade de fluorescência global em um microscópio de fluorescência padrão, e a outra é uma controle não transfectado.O registro de voltagem foi obtido a partir da fibra muscular que expressava EY FP CLC um. Um pulso de corrente maior do que aquele necessário para excitar uma fibra controle eliciou apenas uma resposta regenerativa pequena na fibra transfectada quando a solução de Tyro externa foi substituída por uma solução contendo 500 micromolares do bloqueador de canais de cloreto ácido nonanoíco racêmico ou nove A CA. Um pulso menor eliciou um potencial de ação, embora muito mais lento e amplo do que aqueles registrados na fibra controle, como esperado.A adição de nove a CA teve efeitos mínimos na fibra controle. Concluímos que a fibra que expressa EY FP CLC é quase não excitável devido à condutância excessiva de cloreto em repouso. Acabamos de mostrar como transfectar um plasmídeo que expressa proteína transgênica em uma fibra muscular esquelética viva utilizando eletroporação, e também como avaliar a eficiência da transfeção e a localização e função das proteínas transfectadas.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.I.

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