Name: Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a preparar lisado de plaquetas humanas a partir de plasma rico em plaquetas usando ciclos de congelamento e descongelamento. Este método fornece um suplemento eficiente e livre de soro animal para culturas de células-tronco.

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Este trabalho tem sido apoiada pelo austríaco Research Foundation (FWF, conceder N211-NAN para DS) ea Agência de Promoção Austrian Research (FFG, conceder N200 para DS). Os autores agradecem a Claudia Url para assistência técnica excelente e Farrell Monica para a edição de linguística.

1. Material de partida Comece com plaquetas plasma rico (PRP) unidades preparadas por Citaferese ou derivados de buffy casacos. 2. Verificar a esterilidade Para verificar a esterilidade tirar uma amostra de 20 mL de cada unidade PRP, transferindo o volume para uma bolsa pequena conectado (Baxter). Desconecte este saco com solda. 3. Congelamento de unidades PRP Imediatamente após a preparação, congelar as unidades PRP até pelo menos -20 ° C no saco de armazenamento original, sem manipulação posterior. 4. Descongelamento das unidades HPL Quando os testes bacteriana são negativos, descongele humana unidades lisado de plaquetas, agora chamados de unidades HPL a 37 ° C (banho de água) até que os coágulos de gelo desaparecer. Não aqueça o HPL. 5. Agrupamento de unidades de HPL Tome pelo menos 10-15 descongelado unidades HPL para um pool de plaquetas lisado para preparar um produto padronizado. Conectar os sacos HPL consecutivamente para o saco de pooling de casal (MacoPharma) e transferir o HPL nesses dois sacos. Desligue o sacos vazios HPL por soldadura. Obter um volume final de 3 a 4 L de pooled lisado de plaquetas humanas (pHPL), misturando o conteúdo dos dois sacos. Conectar um pequeno saco (Baxter) e tirar uma amostra de 20 mL para pHPL verificar a esterilidade do produto em pool. Desconecte este saco com solda. 6. Porcionamento do pHPL PHPL a parte para obter alíquotas adequadas para processamento posterior. Conectar pequenos sacos (Baxter) para o saco de pooling de casal (Macopharma) e transferência de volumes de até 250 mL para os sacos de armazenamento pequeno (Baxter). Desconecte os sacos cheios de soldagem. 7. Re-congelamento das alíquotas pHPL Aumentar a taxa de fragmentação de plaquetas e da quantidade de fatores de crescimento liberados por uma etapa de congelamento / descongelamento mais. Congelar os pequenos sacos de pHPL porções de novo, pelo menos, -20 ° C. 8. Re-descongelamento e porcionamento das alíquotas pHPL Descongelar os sacos pHPL a 37 ° C (banho de água). Transferir o conteúdo em frascos de 50 ml (Falcons BD), cortando o tubo do saco com uma tesoura esterilizada e derramar o pHPL para os frascos. Realizar esta etapa em um banco de fluxo laminar para evitar a contaminação bacteriana ou fúngica. 9. Remoção de fragmentos de plaquetas Como fragmentos de plaquetas tendem a se agregar e pode induzir a aloimunização, removê-los do pHPL. Centrifugue os tubos pHPL, portanto, a 4.000 g (15 minutos, 4 ° C). Em uma pipeta bancada de fluxo laminar o plasma sobrenadante para os frascos de armazenamento final (Falcons BD) e descartar as pelotas de plaquetas para evitar fragmentos em cultura de células. 10. Armazenamento de pHPL Congelar alíquotas de 50 mL pHPL novamente em menos 20 ° C e armazená-los para uso experimental. 11. Uso de pHPL em cultura de células Inicialmente adicionar heparina sem conservantes para o meio para evitar a formação de gel. Descongelar uma alíquota pHPL a 37 ° C e completar o meio de cultura pela adição de 8-10%. Médiuns MSC Médio: Use 500 mL de uma MEM, adicione 56 ml de pHPL descongelados (ver também referência 1 para mais detalhes) e 2 UI / mL (= 224 ml de solução-estoque) de heparina sem conservantes (evita a coagulação do meio através do acúmulo de o fibrinogênio no plasma) para alcançar uma concentração final de pHPL 10%. Além disso adicionar penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100μg/mL) e solução de 2mM de L-glutamina (ambos Sigma). Filtrar o meio através do filtro a vácuo a 20 mM de poros tamanho (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo). ECFC-Medium: Use uma garrafa (500 ml) de EBM, adicionar as alíquotas de citocinas, 56 mL de pHPL, 10 UI / ml (= 1120μl da solução de reserva) de conservante livre de Heparina, Penicilina (100U/ml) / estreptomicina (100 g / mL de solução) e 2mM de L-glutamina ao meio basal e com um filtro de 20 l de poros tamanho vácuo filtro (Millipore). Rótulo do frasco adequadamente (data, conteúdo). <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Preparação de plasma rico em plaquetas a partir de uma doação de sangue total de um banco de sangue local ou qualquer outro fornecedor autorizado. Após a centrifugação do sangue pode ser separado em plasma, buffy coat e células vermelhas do sangue. Quatro unidades de buffy coat, o grupo sanguíneo O e um grupo sanguíneo AB plasma podem ser combinadas antes da centrifugação para separar o plasma rico em plaquetas. A regularidade de qualidade unidade de plasma rico em plaquetas de aproximadamente 300mL deve conter 1x10 9 plaquetas por ml ou 11 3x10 plateletotal de ts. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="Figura 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="Figura 3" />

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Em algumas regiões de plaquetas plasma rico (PRP) podem ser obtidas buffy-coats de outra forma de ser um produto embalado resíduos de produção de glóbulos vermelhos a partir de doações de sangue testadas (Figura 1). Idealmente, PRP é usado imediatamente para melhor preparação de pHPL, como em plaquetas desatualizado concentra a disponibilidade de fatores de crescimento pode ser reduzido devido a lesões de armazenamento de plaquetas e degradação 20. Recomenda-se ainda para produzir PRP combinando as plaquetas ...

<table><tbody><tr><td>Saco duplo (2 x 3,5 L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>originalmente para punção de ascite</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 mL</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes de 50 mL</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de plasma (600 mL)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>Soldador de tubos estéreis</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento de soldagem</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesouras estéreis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de pool de plaquetas lysate humanos (phpl) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Fatores de crescimento plaquetário derivados têm sido mostrados para estimular a proliferação celular de forma eficiente<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 1,2</sup&gt; E<em&gt; In vitro</em&gt;. Este efeito tem sido relatada para células mesenquimais estromais (MSCs), fibroblastos e endoteliais formadoras de colônias de células com plaquetas ativadas por trombina<sup&gt; 05/03</sup&gt; Ou lisadas por congelamento / descongelamento<sup&gt; 14/06</sup&gt; Antes do releasate plaquetas é adicionado ao meio de cultura celular. O efeito trófico de fatores de crescimento plaquetário derivados já foi testada em vários ensaios para a engenharia de tecidos e terapia regenerativa.<sup&gt; 1,15-17</sup&gt; Eficiência Variar é considerada pelo menos em parte devido às concentrações individualmente divergentes de fatores de crescimento<sup&gt; 18,19</sup&gt; E um actual falta de protocolos padronizados para a preparação de plaquetas.<sup&gt; 15,16</sup&gt; Este protocolo apresenta um procedimento viável para gerar um pool de lisado de plaquetas humanas (pHPL) derivados do plasma produzido rotineiramente rico em plaquetas (PRP) de 40-50 doações de sangue única. Por vários congelamento / descongelamento das membranas de plaquetas estão danificados e fatores de crescimento são eficientemente liberado no plasma. Finalmente, os fragmentos de plaquetas são removidos por centrifugação, para evitar a formação de agregados extensa e destroem antígenos em potencial. A implementação de protocolos em pHPL cultura padrão representa uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de terapêuticas de células propagadas em um animal livre de proteína do sistema.

Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

Foi demonstrado que os fatores de crescimento derivados de plaquetas estimulam a proliferação celular de forma eficiente in vivo1,2 e in vitro. Esse efeito foi relatado para ...

Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande lote de lisado plaquetário humano, partindo do plasma rico em plaquetas. Ao realizar um ciclo de congelamento e descongelamento, as plaquetas são lisadas. Em seguida, pelo menos 10 unidades de lisado plaquetário humano são agrupadas em um único lote de lisado plaquetário humano pool ou PHPL.Esse volume de cerca de três litros é dividido em alíquotas e novamente congelado para esgotar os fragmentos plaquetários. Essas alíquotas são descongeladas, transferidas para frascos e centrifugadas. O sobrenadante é o PHPL com fragmentos plaquetários esgotados, contendo fatores de crescimento derivados de plaquetas utilizados para suplementar culturas celulares.O pellet restante de fragmentos de plaquetas é descartado. Olá, sou Kadina Sharmo do laboratório do Dr. TRO na unidade de pesquisa de células-tronco da Universidade Médica de Grads. Hoje mostraremos a você um procedimento para o preparo de um pool de isolados plaquetários humanos.Vamos partir do plasma rico em plaquetas, realizar vários ciclos de congelamento e descongelamento, e então remover os fragmentos plaquetários. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para obter um suplemento suficiente para culturas celulares como alternativa ao soro bovino fetal. Então, vamos começar.Este protocolo começa com plasma rico em plaquetas, que é chamado de PRP. Esse plasma pode ter sido preparado por aférese com Cy ou obtido a partir de capas leucocitárias. Pessoas fora da área de medicina transfusional devem adquirir o PRP junto a um banco de sangue local ou outro fornecedor autorizado.Verifique a esterilidade da unidade de PRP transferindo 20 mililitros de cada unidade para uma bolsa pequena conectada e desconectando a bolsa usando a soldadora. Esta alíquota pode ser enviada imediatamente após o preparo a um laboratório de microbiologia para teste de esterilidade. É importante congelar as unidades de PRP a pelo menos menos 20 graus na bolsa original de armazenamento.Uma vez que os testes bacterianos sejam negativos, o próximo passo pode ser realizado. Tendo cuidado para não deixar o lisado de plaquetas humanas, agora chamado HPL, aquecer em excesso, coloque as unidades de HPL em banho-maria a 37 graus até que os coágulos de gelo desapareçam. As plaquetas devem ser lisadas após esta etapa de congelamento e descongelamento para preparar um produto padronizado para cada pool de lisado de plaquetas.Colete 10 a 15 unidades de PRP descongeladas. Conecte cada bolsa de HPL consecutivamente à bolsa dupla de pooling e, em seguida, transfira o HPL para essas duas bolsas. Desconecte as bolsas vazias de HPL utilizando a seladora.Misture o conteúdo dos dois sacos para obter um volume final de três a quatro litros de lisado plaquetário humano poolado, agora denominado PHPL. Conecte um saco pequeno e obtenha uma amostra de 20 mililitros de PHPL para verificar a esterilidade do produto poolado.Aliquote amostras de PHPL para processamento adicional conectando bolsas pequenas à bolsa dupla de pooling. Transfira volumes de cerca de 250 mililitros para as bolsas pequenas de armazenamento e, em seguida, desconecte as bolsas cheias usando a seladora. Realize agora um ciclo adicional de congelamento-descongelamento para aumentar a taxa de fragmentação das plaquetas e a quantidade de fatores de crescimento liberados.Faça isso congelando as pequenas bolsas com porções de PHBL a menos 20 graus. Em seguida, descongele as bolsas em banho-maria a 37 graus. Na cabine de fluxo laminar.Use tesouras estéreis para cortar e abrir o tubo de cada bolsa e, em seguida, despeje o PHPL nos frascos de 50 mililitros. Frequentemente, fragmentos de plaquetas tendem a aglomerar e as plaquetas também podem induzir aloimunização. Para evitar essas condições, remova os fragmentos do PHPL por meio de centrifugação a 4.000 ×g por 15 minutos em uma centrífuga refrigerada.Em seguida, pipete o sobrenadante plasmático nos frascos finais de armazenamento e descarte os pellets de plaquetas para evitar a presença de fragmentos em suas culturas celulares congeladas. Aliquotar 50 mililitros de PHPL novamente a menos 20 graus até uso posterior. Agora que o PHPL isento de fragmentos plaquetários foi gerado, as características do lisado podem ser analisadas.A função e a qualidade do lisado plaquetário em pool são testadas em culturas celulares e comprovadas pela estimulação eficiente da proliferação celular, propagação de células estromais mesenquimais ou MSCs e de células formadoras de colônias endoteliais, E CFCs, sendo bem-sucedida com PHPL esgotado de fragmentos plaquetários. Consulte nosso protocolo escrito com as receitas do meio aqui. Duas aplicações para lisado plaquetário humano em pool.Na cultura de células estromais mesenquimais, são mostradas MSCs do doador um cultivadas com PHPL ou com PHPL esgotado de fragmentos plaquetários. Como indicado, há maior contaminação por fragmentos aqui quando comparado ao PHPL esgotado de fragmentos isoladamente. Os fragmentos plaquetários não sustentam adequadamente o crescimento das MSCs.As três imagens foram obtidas após 13 dias de cultivo. As CMM do doador dois foram cultivadas por nove dias em PHPL com fragmentos de plaquetas esgotados, em vez de plasma rico em plaquetas. Observe que o PRP sem lise plaquetária não sustenta adequadamente o crescimento celular das CMM.Veja também o protocolo da JoVE de Andreas Reish, que descreve o uso de PHPL com fragmentos esgotados para o isolamento e cultivo de MSCs derivadas de sangue de cordão umbilical humano. Acabamos de mostrar como produzir PHPL para substituir completamente o soro animal em seus cultivos de células-tronco. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de remover os fragmentos plaquetários antes de adicionar heparina e PHPL ao seu meio de cultura.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Os protocolos descritos permitem que os laboratórios realizem cultura de células-tronco escaláveis e aderentes em alto rendimento com mão de obra, experiência e custo mínimo de investimento em equipamentos usando um robô programável de manuseio de líquidos e placas de 96 poços.  As iPSCs passadas mais de 20 vezes neste sistema mantiveram a pluripotência, cariótipos normais e se diferenciaram em cardiomiócitos.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

Este protocolo apresenta um dispositivo que produz PRP para impulsionar a expansão in vitro de células em um sistema de cultura de fibroblastos 100% autólogo.

Produção de Plasma Autólogo Rico em Plaquetas para Impulsionar a Expansão In Vitro de Fibroblastos Humanos

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.

Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano com um método inovador livre de xenogênicos para terapia humana

Avanços técnicos recentes possibilitaram a produção em escala de uma plataforma in vitro para aplicações em metabolismo e toxicidade de fármacos. Um sistema hepático 2D+ totalmente humano (TV2D+) fornece resultados fisiologicamente relevantes usando métodos tradicionais de cultura bidimensional. Esse protocolo dará suporte aos usuários finais na configuração, manutenção e aplicação do sistema.

Um Sistema de Cultura Hepática Totalmente Humano para Aplicações no Desenvolvimento de Fármacos

Aprenda a preparar lisado de plaquetas humanas a partir de plasma rico em plaquetas usando ciclos de congelamento e descongelamento. Este método fornece um suplemento eficiente e livre de soro animal para culturas de células-tronco.

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas

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