Preparação de pool de plaquetas Lysate Humanos (pHPL) como um suplemento eficiente para animais de soro livre de culturas de células estaminais humanas
30 de outubro de 2009
Lisado de plaquetas humanas é uma fonte rica em fatores de crescimento e um suplemento potente em cultura de células. Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande pool de lisado de plaquetas humanas por a partir de plasma rico em plaquetas, realizando diversos ciclos de congelamento e descongelamento e esgotando os fragmentos de plaquetas.
Este protocolo apresenta o processo de preparação de um grande lote de lisado plaquetário humano, iniciando-se a partir de plasma rico em plaquetas. Ao realizar um ciclo de congelamento e descongelamento, as plaquetas são lisadas. Em seguida, pelo menos 10 unidades de lisado plaquetário humano são agrupadas em um único lote de lisado plaquetário humano pool ou PHPL.
Esse volume de cerca de três litros é dividido em alíquotas e novamente congelado para esgotar os fragmentos plaquetários. Essas alíquotas são descongeladas, transferidas para frascos e centrifugadas. O sobrenadante é o PHPL isento de fragmentos plaquetários, contendo fatores de crescimento derivados de plaquetas utilizados para suplementar culturas celulares.
O pellet restante de fragmentos de plaquetas é descartado. Olá, sou Kadina Sharmo do laboratório do Dr. TRO na unidade de pesquisa de células-tronco da Universidade Médica de Grads. Hoje mostraremos a você um procedimento para o preparo de um pool de isolados plaquetários humanos.
Vamos partir do plasma rico em plaquetas, realizar vários ciclos de congelamento e descongelamento e, em seguida, remover os fragmentos plaquetários. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para obter um suplemento suficiente para culturas celulares como alternativa ao soro bovino fetal. Então, vamos começar.
Este protocolo começa com plasma rico em plaquetas, denominado PRP. Esse plasma pode ter sido preparado por aférese com Cy ou obtido a partir de camadas de buffy. Pessoas de fora da área de medicina transfusional devem adquirir o PRP de um banco de sangue local ou de outro fornecedor autorizado.
Verifique a esterilidade da unidade de PRP transferindo 20 mililitros de cada unidade para um pequeno saco conectado e desconectando o saco utilizando o soldador. Esta alíquota pode ser enviada imediatamente após o preparo a um laboratório de microbiologia para teste de esterilidade. É importante congelar as unidades de PRP a pelo menos menos 20 graus no saco original de armazenamento.
Uma vez que os testes bacterianos sejam negativos, o próximo passo pode ser realizado. Tendo o cuidado de não deixar o lisado de plaquetas humanas, agora chamado HPL, aquecer em excesso, coloque as unidades de HPL em banho-maria a 37 graus até que os coágulos de gelo desapareçam. As plaquetas devem ser lisadas após esta etapa de congelamento e descongelamento para preparar um produto padronizado para cada pool de lisado de plaquetas.
Coletar 10 a 15 unidades de PRP descongeladas. Conectar cada bolsa de HPL consecutiva à bolsa dupla de pooling e, em seguida, transferir o HPL para essas duas bolsas. Desconectar as bolsas vazias de HPL utilizando o soldador.
Misture o conteúdo dos dois sacos para obter um volume final de três a quatro litros de lisado plaquetário humano poolado. Agora denominado PHPL. Conecte um saco pequeno e obtenha uma amostra de 20 mililitros de PHPL para verificar a esterilidade do produto poolado.
Aliquote amostras de PHPL para processamento adicional conectando bolsas pequenas à bolsa dupla de pooling. Transfira volumes de cerca de 250 mililitros para as bolsas pequenas de armazenamento e, em seguida, desconecte as bolsas cheias utilizando a seladora. Realize agora um ciclo adicional de congelamento-descongelamento para aumentar a taxa de fragmentação das plaquetas e a quantidade de fatores de crescimento liberados.
Faça isso congelando as pequenas bolsas com porções de PHBL a menos 20 graus. Em seguida, descongele as bolsas em banho-maria a 37 graus. Na cabine de fluxo laminar.
Use tesouras estéreis para cortar e abrir o tubo de cada bolsa e, em seguida, despeje o PHPL nos frascos de 50 mililitros. Frequentemente, fragmentos de plaquetas tendem a aglomerar e as plaquetas também podem induzir aloimunização. Para evitar essas condições, remova os fragmentos do PHPL por meio de centrifugação a 4.000 ×g por 15 minutos em uma centrífuga refrigerada.
Em seguida, pipete o sobrenadante plasmático nos frascos finais de armazenamento e descarte os pellets de plaquetas para evitar a presença de fragmentos em suas culturas celulares ao congelar. Aliquotar 50 mililitros de PHPL novamente a menos 20 graus até uso posterior. Agora que o PHPL isento de fragmentos de plaquetas foi gerado, as características do lisado podem ser analisadas.
A função e qualidade do lisado plaquetário em pool são testadas em culturas celulares e comprovadas pela estimulação eficiente da proliferação celular, propagação de células estromais mesenquimais ou MSCs e de células formadoras de colônias endoteliais, E CFCs, com sucesso utilizando PHPL isento de fragmentos plaquetários. Consulte nosso protocolo escrito com as receitas do meio aqui. Duas aplicações para lisado plaquetário humano em pool.
Na cultura de células estromais mesenquimais, são mostradas MSCs do doador um cultivadas com PHPL ou com PHPL esgotado de fragmentos de plaquetas. Como indicado, há maior contaminação por fragmentos aqui em comparação com o PHPL esgotado de fragmentos de plaquetas isoladamente. Fragmentos de plaquetas não sustentam adequadamente o crescimento de MSCs.
As três imagens foram obtidas após 13 dias de cultivo. As CMM do doador dois foram cultivadas por nove dias em PHPL com fragmentos de plaquetas esgotados, em vez de plasma rico em plaquetas. Observe que o PRP sem lise plaquetária não suporta adequadamente o crescimento celular das CMM.
Veja também o protocolo da JoVE por Andreas Reish, que descreve o uso de PHPL com fragmentos reduzidos para o isolamento e cultivo de MSCs derivadas de sangue de cordão umbilical humano. Acabamos de mostrar como produzir PHPL para substituir completamente o soro animal em seus cultivos de células-tronco. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de remover os fragmentos plaquetários antes de adicionar heparina e PHPL ao seu meio de cultura.
É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve a preparação de lisado de plaquetas humanas (HPL) a partir de plasma rico em plaquetas (PRP). O processo envolve ciclos de congelamento e descongelamento para lisar as plaquetas e produzir um lisado pobre em fragmentos de plaquetas, rico em fatores de crescimento, destinado à suplementação em cultivos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Cultura celular
- Biologia das plaquetas
- Pesquisa sobre fatores de crescimento
Antecedentes
- O lisado de plaquetas humanas é um suplemento potente no cultivo celular.
- Ele contém diversos fatores de crescimento essenciais para a proliferação e diferenciação celulares.
- O processo de preparação é fundamental para garantir a qualidade e eficácia do lisado.
- O plasma rico em plaquetas serve como material inicial para a preparação de HPL.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o preparo do lisado plaquetário humano.
- Garantir a remoção de fragmentos plaquetários para obter um lisado mais puro.
- Facilitar o uso do LPH em diversas aplicações de cultura celular.
Métodos Utilizados
- Partindo do plasma rico em plaquetas (PRP).
- Realização de ciclos de congelamento-descongelamento para lisar plaquetas.
- Preparação do lisado plaquetário humano poolado (PHPL).
- Centrifugação para esgotar fragmentos plaquetários do sobrenadante.
Resultados Principais
- Preparação bem-sucedida de um grande pool de lisado plaquetário humano.
- Esgotamento de fragmentos plaquetários obtido por meio de centrifugação.
- Rendimento de aproximadamente três litros de fatores de crescimento derivados de plaquetas.
- Preparação adequada para suplementação em culturas celulares.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para o preparo de lisado plaquetário humano.
- O LPH pode melhorar significativamente os resultados do cultivo celular.
- Estudos futuros podem explorar as aplicações do LPH em diversas áreas de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os sistemas de cultivo livres de soro animal são essenciais para o avanço da terapia com células-tronco rumo à translação clínica e à conformidade regulamentar. Este protocolo permite a produção escalonável de lisado plaquetário humano (pHPL) como um suplemento definido e livre de componentes xenógenos, que sustenta a proliferação de células estromais mesenquimais e a propagação de células formadoras de colônias endoteliais. Ao padronizar a lise plaquetária e a remoção de fragmentos, reduz a variabilidade entre lotes e melhora a reprodutibilidade em estudos de descoberta inicial e em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Fornece um suplemento definido e derivado de humanos que apoia estudos mecanicistas das vias de proliferação e diferenciação de células-tronco.
- Valor Operacional: Permite condições de cultivo consistentes entre experimentos, reduzindo a variabilidade em ensaios de validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece um meio padronizado e rico em fatores de crescimento que sustenta leituras confiáveis em ensaios funcionais de células-tronco.
- Valor Operacional: Facilita a padronização de ensaios por meio de lisado isento de fragmentos, minimizando a interferência de agregados plaquetários em plataformas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a expansão de células-tronco relevantes para doenças em condições livres de componentes xenógenos, alinhando-se aos requisitos de biomarcadores translacionais e modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Possibilita a produção em escala a partir de fontes doadoras agrupadas, apoiando a transferência de tecnologia e o desenvolvimento de processos próximos às Boas Práticas de Fabricação (GMP).
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta ao fornecer um suplemento livre de soro para o cultivo de células-tronco, desde a validação inicial do alvo até a expansão pré-clínica, apoiando a identificação de compostos líderes e a redução de riscos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses na proliferação e diferenciação de células-tronco ao fornecer um microambiente consistente e definido.
- Triagem: Permite testes reprodutíveis de compostos ou condições em ensaios baseados em células-tronco por meio de lisado padronizado e isento de fragmentos.
- Análises: Gera resultados quantificáveis, como taxas de proliferação celular e eficiência de unidades formadoras de colônias, possibilitando análises comparativas entre diferentes condições de cultivo.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta científica ao trabalho pré-clínico ao permitir a expansão de células estromais mesenquimais e progenitoras endoteliais em condições clinicamente relevantes e livres de componentes animais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um processo reutilizável e escalável para gerar suplemento de grau clínico a partir de plasma rico em plaquetas de fonte rotineira, reduzindo a dependência de soros animais variáveis.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos resultados do cultivo de células-tronco ao eliminar componentes indefinidos de soro animal e padronizar a entrega de fatores de crescimento.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio do processamento de doadores em pool e etapas padronizadas de congelação-descongelação e centrifugação.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico no desenvolvimento de terapias celulares ao fornecer uma alternativa humana, livre de componentes xenógenos, ao soro fetal bovino.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao permitir a geração consistente de dados pré-clínicos em sistemas de cultivo definidos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas estéreis de cultivo celular, manipulação de plaquetas e protocolos de centrifugação.
- Depende do acesso a plasma rico em plaquetas proveniente de bancos de sangue autorizados ou serviços de transfusão e equipamentos estéreis de soldagem ou selagem para manipulação de bolsas.
- Necessita de testes de esterilidade padronizados do PRP de entrada e do lisado em pool antes e após o processamento, para garantir a segurança do cultivo.
- Requer adaptação dos protocolos de cultivo para levar em conta as concentrações específicas de fatores de crescimento em cada lote, apesar da estratégia de pooling.
- É limitado pela necessidade de múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento e etapas de centrifugação, o que aumenta o tempo de processamento e exige equipamentos especializados.
