Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

O cordão umbilical humano é uma fonte facilmente acessível de células progenitoras. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento e subsequente expansão de progenitores endoteliais e CFCs, uma subpopulação de células dentro da parede do vaso e células progenitoras mesenquimais. MSCs derivadas de um único cordão umbilical humano.

Primeiro usando uma tesoura longitudinalmente, corte ao longo da veia umbilical humana e raspe as células da superfície interna do vaso. Transfira as células do raspador para um frasco e aguarde o crescimento da colônia. Algumas das células raspadas exibirão um fenótipo progenitor e proliferarão fortemente para formar grandes colônias.

Uma vez que essas células tenham proliferado, os CFCs e podem ser expandidos em novos frascos. Para análise posterior, uma população de células mesenquimais também pode ser isolada do cordão umbilical humano. Corte partes do cordão em pedaços pequenos e transfira-os para uma placa de cultura estéril.

Após alguns dias, o crescimento das células estromais será visível ao redor dos pedaços de tecido do cordão intervascular. Transfira essas células para novos frascos e expanda-os para análise posterior. Este protocolo permite obter dois tipos de linhagens de células progenitoras a partir de um único cordão de material de partida dentro de três a quatro semanas.

Olá, sou Andreas Danish do laboratório do Dr.T Strong em uma unidade de pesquisa de células-tronco na Universidade Médica de Grads, na Áustria. Hoje mostraremos um procedimento para o isolamento, expansão e análise de células do canal mesenquimal e endotelial humano a partir de um código umbilical. Apenas uma nota sobre terminologia.

Nossas células são chamadas de células estromais mesenquimais multipotentes, ou MSEs e células pro formadoras de cólon endotelial ou e CSCs. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a função e a biologia das células progenitoras não hemáticas. Então vamos começar.

Antes das etapas de isolamento celular, limpe a capa de cultura de tecidos de fluxo laminar com inadina e reúna as placas de cultura de células estéreis. Frascos de cultura de células, instrumentos cirúrgicos esterilizados PBS, raspadores de células, um suporte de tubo, tiras de 25 mililitros e uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha romba. Lembre-se de pré-aquecer o meio de cultura de duas células alfa MEM e EGM em banho-maria de 37 graus.

Agora transfira o cordão umbilical para o fluxo laminar e lave-o duas vezes em PBS. Para remover o sangue contaminante, use uma seringa estéril de cinco mililitros para canular a veia do cordão umbilical de um lado. Agora enxágue a veia umbilical com PBS até que o fluido saia.

A outra extremidade do cabo torna-se completamente transparente, sem tonalidade vermelha. Comece o isolamento das células progenitoras formadoras de colônias endoteliais enchendo um frasco de 75 centímetros quadrados com 15 a 20 mililitros de EGM dois meios pré-aquecidos. Coloque o cordão em uma nova placa cheia de PBS estéril e use uma tesoura cirúrgica para cortar o cordão em dois pedaços, cada um com cerca de cinco centímetros de comprimento.

Agora insira uma lâmina da tesoura cirúrgica e corte a veia longitudinalmente. Neste ponto, um assistente pode usar uma pinça para segurar a veia enquanto outros cortes são feitos. Coloque o cordão com a veia aberta em uma nova placa.

Sem PBS, use um raspador de células para esfregar a superfície interna da veia em uma área de pelo menos um centímetro. Lave o raspador no meio EGM dois para liberar as células do vaso esfregadas no frasco. Este procedimento precisará ser repetido até 10 vezes.

Feche o frasco e coloque-o em uma incubadora ajustada a 37 graus, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Agora que os CFCs foram isolados, vamos passar para os MSCs. Agora que a camada endotelial foi raspada, use um bisturi estéril para cortar o cordão em pedaços muito pequenos.

Um a dois milímetros. Máximo use pinças estéreis para transferir essas peças para uma placa de cultura pré-rotulada. Deixe o prato aberto por pelo menos cinco minutos antes de enchê-lo com meio para permitir que as peças adiram à superfície do plástico.

Usando a velocidade mais baixa possível, adicione suavemente 30 a 35 mililitros de MEM modificado alfa pré-aquecido. Feche a placa e coloque-a em uma incubadora ajustada a 37 graus com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. O crescimento de células estromais mesenquimais dos pedaços do cordão levará de três a sete dias, após os quais as células podem ser expandidas.

Enquanto isso, o ECFC pode ser expandido, o que mostrará na próxima etapa. No dia seguinte, use um microscópio invertido para examinar as células. Se o procedimento de raspagem foi feito corretamente, os primeiros aglomerados de células em proliferação serão visíveis completamente.

Substitua o meio E GM dois para remover todas as células e partículas não anexadas. Continue expandindo as células e trocando um terço do meio duas vezes por semana. Após 10 a 12 dias, colônias endoteliais muito grandes serão observadas regularmente.

Agora, remova o meio e lave com PBS para se livrar do uso de proteínas restantes. 0,05% de tripsina 0,7 milimolar EDTA para separar as células. Ao transferir células para novos vasos de cultura, certifique-se de escolher frascos de tamanho apropriado para obter uma baixa densidade de semeadura.

Isso ajudará na expansão. Nosso laboratório geralmente recua a progênie de mais de 20 grandes colônias em quatro, duzentos e vinte e cinco frascos de centímetros quadrados. Não se esqueça de substituir um terço do meio duas vezes por semana.

Um protocolo semelhante é usado para expansão do MSC na próxima seção. Depois de três a sete dias, use um microscópio invertido para verificar o aparecimento de células fusiformes perto do tecido anexado. Quando há crescimento celular suficiente, as peças tendem a se prender à medida que perdem o contato com o plástico.

Após 10 a 12 dias, remova os pedaços de tecido. Separar as MSCs do plástico usando uma solução de tripsina EDTA e transferir as células para novos frascos de cultura pré-cheios de meio que sejam do tamanho e número apropriados para garantir baixa densidade de semeadura durante a expansão celular. Será necessário trocar um terço do meio duas vezes por semana, uma vez que ambos os tipos de células tenham sido expandidos.

A coloração seguida de citometria de fluxo pode ser realizada para detectar a expressão de marcadores de superfície celular indicativos de fenótipos progenitores e determinar que não há contaminação com células hematopoiéticas. Semeie os CFCs e colhidos puros com densidade de plaqueamento muito baixa de três ou 10 células por centímetro quadrado em placas de cultura de células para garantir o crescimento de uma única colônia Troque um terço do meio duas vezes por semana após 14 dias. O fim da cultura.

Remova o meio. Lave duas vezes com PBS e fixe as colônias com solução de fixação gelada Por 15 minutos na geladeira, descarte a solução de fixação e deixe as placas abertas para secar por 10 minutos. Reidrate as células com água destilada por 10 minutos.

Adicione a solução de Hematina Harris e core as colônias fixas por 12 minutos. Remova a solução de hematina e enxágue as placas com água da torneira. Para se livrar da solução de coloração restante.

Tire fotos de cada colônia usando um microscópio estéreo e importe arquivos no formato jpeg ou TIFF para o seu computador. Abra as fotos com o software image J e analise o número exato de células de cada colônia, conforme descrito na animação a seguir. Abra o software Image J e importe uma imagem de colônia usando a função de abertura de arquivo no menu suspenso.

Prossiga usando o processo. Subtrair função de fundo. Use a função de seleção elíptica ou pincel no menu J da imagem para marcar a margem da colônia.

Limpe a imagem ao redor usando a função editar limpar fora e corte a imagem selecionando o corte da imagem. Ajuste o limite manualmente usando a função de limite de ajuste de imagem para que todas as células fiquem completamente coloridas. Vermelho. Conte o número da célula da colônia selecionando.

Analise, analise partículas. Escolha as configurações apropriadas otimizadas para cada tipo de célula e selecione OK Se executado corretamente. Este protocolo permite o isolamento de uma população virtualmente pura de células que compartilham as características das células progenitoras endoteliais e mesenquimais humanas, que são autólogas entre si porque são derivadas do mesmo cordão.

A partir do quinto dia, as células mesenquimais em forma de fuso aparecerão abaixo do pedaço do cordão preso à placa de cultura. Após um a dois dias, os primeiros aglomerados de células progenitoras formadoras de colônias endoteliais ou e CFCs se tornarão visíveis sob um microscópio invertido. Esta enorme colônia de CFCs em rápido crescimento se formou após 11 dias.

Tanto os MSCs quanto os E CFCs podem ser aprovados e expandidos. Recomendamos uma análise subsequente de todos os produtos de cultura usando citometria de fluxo para confirmar o fenótipo apropriado. Lembre-se de que as linhagens endotelial e mesênquima reagem a anticorpos específicos para CD 73, CD 1 46, CD 29 e CD 1 0 5.

Observe que as MSCs expressaram a coxa um, que foi detectada usando um anticorpo anti CD 90. Os CFCs E são positivos para CD 31, que também é chamado de molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias ou pcam. Está bem estabelecido que a expressão de imunorreatividade de CD 34 no cordão por E CFCs pode ser reduzida por meio de cultura repetida.

Marcadores de células sanguíneas como CD 45, H-L-A-D-R e CD 14 permaneceram negativos para ambos os tipos de células. A hierarquia de células progenitoras entre E CFCs pode ser avaliada usando o software Image J, contando o número preciso de células de cada colônia. Acabamos de mostrar como isolar, expandir e analisar maças e ECEs de um código umbilical humano ao fazer este procedimento.

É importante trabalhar em condições estéreis e verificar o fenótipo e a pureza antes de usar as células em estudos subsequentes. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.