Name: Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Aprenda a visualizar a replicação de DNA em moléculas únicas usando microscopia de fluorescência em tempo real. Este método permite estudar a dinâmica dos replissomos e a síntese de DNA coordenada.

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Samir Hamdan auxiliado no desenvolvimento desta técnica. E. coli são proteínas do laboratório do Prof Nick Dixon, proteínas Universidade de Wollongong, e T7 são do Prof Charles Richardson, Harvard Medical School. Trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (GM077248 para AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Antes de realizar um experimento de replicação única molécula, alguns materiais precisam ser preparadas com antecedência. 1. Modelo de replicação do DNA O substrato para a reação de replicação é um biotinilado, M13 círculo cauda rolando preparado usando o padrão de biologia molecular 1,2 técnicas. Materiais: M13mp18 DNA de fita simples, primer oligonucleotídeo biotinilado cauda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7 DNA polimerase, bloco de calor, fenol / álcool isoamílico / Clorofórmio <ol><li> Recozer a oligo cauda biotinilado para o M13, adicionando um excesso de 10 vezes de oligo em TBS tampão (330 nM cauda oligo, 33 nM M13). </li><li> Aquecer a mistura a 65 ° C no bloco de calor. Uma vez aquecida, por sua vez o bloco de calor e deixe resfriamento lento corretamente anneal o primer. </li><li> Adicione o M13 preparado para uma mistura de 64 nM DNA polimerase T7 e buffer de replicação T7 contendo dNTPs e MgCl 2. </li><li> Incubar a reação a 37 ° C por 12 minutos e saciar com 100 mM EDTA. </li><li> Purificar o DNA preenchido produto com fenol / clorofórmio / isoamílico extração de álcool e diálise em tampão TE ou buffer de armazenamento adequado e determinar a concentração de DNA (Back-extrair cada fase orgânica para recuperar qualquer residual preparado M13). </li><li> Uma iteração do modelo de preparação pode facilmente fazer alguns ml de modelo de concentração nanomolar, o suficiente para centenas de milhares de single-molécula de experimentos. </li></ol> 2. Lamelas funcionalizados Para prender a DNA para a lamela de vidro, o vidro é o primeiro funcionalizados com um aminosilane, que é acoplado a moléculas de PEG biotinilado. Este revestimento ajuda a reduzir as interações não específicas de DNA e proteínas de replicação com a superfície 1,3. Materiais: lamínulas de vidro, potes de coloração, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k NHS-éster, Biotina-PEG5k-NHSester, acetona, 1M KOH, Etanol, Forno sonicador Bath, <ol><li> Limpam-se as lamínulas de vidro, colocando-os na coloração frascos e encher os frascos com etanol. Sonicado por 30 minutos e enxaguar os frascos e encher com 1 M KOH. Sonicado por 30 minutos Repita os dois lavagens. </li><li> Para a reação de funcionalização em primeiro lugar, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Enchei as talhas de acetona e sonicate por 10 min. Enxaguar os frascos novamente com acetona. </li><li> Prepare uma solução 2% v / v do reagente silano em acetona. Adicionar ao tinas de coloração e agitar por 2 minutos. Esta reação casais do grupo de alcóxi de aminosilane ao vidro, deixando uma amina reativos para a etapa seguinte de acoplamento. Saciar a reação com um grande excesso de água. </li><li> Seca as lamelas cozendo-los a 110 ° C no forno por 30 minutos. </li><li> Prepare um metoxi 50:1: biotina mistura PEG em 100 mM NaHCO 3 pH 8.2. Apontar para cerca de 0,2% PEG w / v biotinilado. </li><li> Pipetar 100 mL da mistura PEG em uma lamela seca silanizadas e colocar outra lamínula por cima. Incluindo um espaçador lamela de vidro vai permitir a separação das lamelas. </li><li> Incubar as lamelas na solução de PEG por 3 horas, em seguida, separe cada par de lamelas e lavar abundantemente com água. Tenha cuidado para manter as lamelas funcionalizados lateral-se como apenas o lado uma vez serão revestidas com PEG. </li><li> Seca as lamelas e armazenar sob vácuo. As superfícies de permanecer estável por pelo menos um mês, assim que dezenas de lamelas podem ser feitas em um lote e usado quando necessário. </li></ol> Estes materiais devem ser feitas antes do tempo, e então usado para cada experimento. Para iniciar cada experimento molécula única, comece a montagem da câmara de fluxo. 3. Preparação câmara de fluxo O experimento é realizado com uma câmara de fluxo simples construída com uma lamela funcionalizados, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubo. Uma câmara de fluxo está preparada para 1,4 cada molécula única experiência. Materiais: fita dupla face, lâmina de barbear, lâmina de quartzo com furos para tubos de epóxi, Quick-seca, lamela funcionalizados (veja acima), Estreptavidina solução (25 mL de 1 mg / mL em PBS), tubulação, tampão de bloqueio (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Comece colocando 20-25 mL de tampão de bloqueio em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. </li><li> Dê uma lamela PEG-funcionalizados e espalhar 125 de PBS-diluída solução de estreptavidina sobre a superfície. Deixar isso para incubar por 20 minutos enquanto prepara outras partes da câmara, permitindo estreptavidina para ligar a Biotins superfície. </li><li> Corte um pedaço de dupla faced fita para combinar com o tamanho da lâmina de quartzo. Marcar a posição dos furos de tubo na fita com um lápis, para que um esboço da câmara de fluxo podem ser tiradas na fita (1 mg / mL). </li><li> Faça um retângulo de 2 mm de largura em torno dos furos. Isso servirá como um canal de fluxo, por isso não deixe de fazer os lados em linha reta e deixar espaço ao redor da tubulação de entrada e saída. Se desejar, múltiplos canais ou tamanhos diferentes podem ser usados. </li><li> Corte ao longo do contorno desenhado, tornando reto, cortes limpos para garantir que nenhum sobressaia adesivo para o canal. </li><li> Limpe o quartzo, cuidadosamente, com acetona ou etanol para remover adesivo da construção anterior de fluxo de células. </li><li> Encontrar o melhor alinhamento do contorno do canal, remove um dos lados da camada adesiva e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina de quartzo. Tenha o cuidado de alinhar a fita corretamente, como os buracos de entrada e saída necessidade de permanecer desbloqueados. </li><li> Cortar comprimentos de tubulação para a entrada e saída da célula de fluxo. Isso ajuda a cortar a extremidade do tubo em cerca de um ângulo de 30 ° para que o tubo não vai pressionar plana contra o fundo de câmara. Colocar os tubos em algum tipo de apoio a suspendê-las para fixação fácil a célula de fluxo nas próximas etapas. </li><li> Lavar a lamela estreptavidina revestida abundantemente com água e seque com ar comprimido. Lembre-se que apenas um lado é funcionalizado; ter cuidado para não transformar a lamela mais. Remover o outro lado do suporte de fita e colocar a lâmina de quartzo para a lamela. </li><li> Pressione levemente na lamela a empurrar para fora todo o ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar as bolhas de ar entrando no canal de fluxo. </li><li> Vedação dos lados da câmara com epóxi. Insira o tubo de corte nos orifícios do quartzo e foca no lugar com epóxi. Isso precisa secar por alguns minutos. </li><li> Depois de seco, comece a bloquear a superfície, puxando alguns dos desgaseificados tampão de bloqueio através de um dos tubos. A agulha calibre 21 se encaixa perfeitamente dentro do tubo de 0,76 milímetros. Lavar algumas vezes para remover bolhas de ar, e permitir que a câmara para incubar por pelo menos meia hora. </li></ol> 4. Única molécula-Experimento de replicação Materiais: câmara de fluxo preparados, SYTOX Orange, microscópio TIRF, 532 nm do laser, CCD da câmera, computador com software de aquisição de imagem, Rolling círculo substrato DNA, proteínas de replicação <ol><li> Após a célula de fluxo foi bloqueado, tudo está pronto para começar a experiência única molécula. </li><li> Pegue a célula de fluxo e colocá-lo no palco microscópio. Segure a câmara no lugar com clipes de palco e ter certeza de que o canal de fluxo é posicionado em linha reta ao longo do eixo-y. </li><li> Conecte o tubo de saída de fluxo de células para a bomba de seringa, usando um tubo conector maior diâmetro ou uma agulha. Coloque a entrada em tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover qualquer ar no tubo. Um filme suave do tubo de saída vai ajudar a limpar as bolhas de ar aprisionado na célula de fluxo. </li><li> Diluir o modelo de DNA de ações a 25 pM em 1 mL de tampão de bloqueio. Fluxo para a câmara de fluxo moderado para permitir a cobertura boa superfície de DNA. 0,025 mL / min por 30 minutos funciona bem. Isto pode ser variado com base em quantas moléculas de DNA estão na superfície para cada lote de lamelas ou quantos forem desejados para o experimento. </li><li> Uma vez que o DNA se encontra, lavar DNA em excesso com tampão de bloqueio. Lavagem para pelo menos 200 o fluxo de células-volumes para se livrar de todo o DNA livre. </li><li> Começar a desgaseificação do buffer de replicação. Para a E. experimentos de replicação coli, fazer isso a 37 ° C para reduzir o risco de bolhas na câmara de fluxo aquecido. </li><li> Ligue o laser e câmera. O CCD refrigerado precisa atingir a temperatura antes que ele possa ser usado. </li><li> Se realizar a 37 ° C experimento, por sua vez o aquecedor ligado. Certifique-se o objetivo está em contato com a célula de fluxo ou ele vai ser um dissipador de calor mais tarde. </li><li> Após a lavagem e desgaseificação, a reação pode ser preparado. Nucleotídeos Mix, DTT, e SYTOX no buffer de replicação. Em seguida, adicione proteínas e misture delicadamente. </li><li> Fluxo da mistura de reação dentro da célula de fluxo. Esta velocidade do fluxo deve ser suficiente para esticar dsDNA. Para a 2 mm de largura, canal de fluxo 100 mícrons de altura 0,04 mL / min funciona bem. </li><li> Dar tempo para a mistura de entrar na câmara e começar a imagem. Uma boa dica é mover o campo de visão para o lado do canal e foco no material adesivo. Isso irá assegurar que você está perto da superfície para focagem. </li><li> Ajustar a potência do laser, o foco do microscópio, e ângulo TIRF. Manter o baixo consumo de energia para evitar qualquer photocleavage do DNA manchado. Adquira com 1-5 frames / segundo por vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Se desejar, repita para obter trajetórias mais de replicação ou mover para um novo campo para ver mais moléculas. </li><li> Após a mistura de reação é quase vazio, ele é uma boa idéia a fluir com mais buffer com SYTOX para ver os campos de vista do outro. Tomando várias imagens de diferentes moléculas replicado fornece estatísticas para a determinação de processabilidade. </li></ol> 5. Resultados representante Moléculas replicantes ativamente são facilmente visíveis como linhas crescente de DNA manchado. Em nossos experimentos, fluindo 25 pM do substrato M13 dá 100-1000 moléculas em um 60x 125 M x, campo 125 mM de vista (Figura 1). Realização de experimentos de replicação usando o E. proteínas coli replissoma a 37 ° C (veja Materiais para detalhes) dá moléculas replicantes 50-50 por campo de visão. Em concentrações equivalentes dos replissoma T7, que inicia no substrato com muito mais eficiência, observa-se&gt; 70% das moléculas em um campo de replicar. Estas condições produzem uma densidade do produto tão alto que moléculas individuais são difíceis de resolver e analisar, de modo que o T7 experimentos são realizados em concentrações mais baixas de proteína. Análise de dados: Para obter dados de taxa, basta traçar o ponto final do DNA em função do tempo e calcular a inclinação (Figura 2). Para processabilidade, determinar o comprimento total do DNA. Ambos estes números terão de ser convertido em pares de bases. Antes de executar o experimento, você deve saber o tamanho do pixel da câmera para a ampliação adequada. Para a conversão de pares de bases, uma boa estimativa é simplesmente a conversão com base no comprimento de cristalografia de DNA, 2,9 pb / nm. No entanto, o fluxo laminar não será completamente esticar o DNA, para uma calibragem de comprimento DNA deve ser realizado tomando um DNA comprimento conhecido, por exemplo, 48.502 bp λ DNA, anexá-lo à célula de fluxo com um oligo biotinilado e medir seu comprimento SYTOX manchada no a vazão utilizada para o experimento de replicação. Determinar o número de pares de bases / pixel permitirá o cálculo preciso das taxas de replicação e processivities. Levando inúmeras imagens e filmes irá fornecer um grande número de moléculas do produto, permitindo plotagem de taxa e processabilidade distribuições (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (De Ref 1.) Um dos desenhos animados) do ensaio de replicação rolling-círculo. (SA, estreptavidina). Levando-vertente de síntese se estende a cauda ligando o círculo e de superfície. A cauda é convertido para dsDNA pela polimerase vertente em atraso e se estendia pelo fluxo laminar. b) Exemplo de campo de visão com SYTOX Laranja e 532 nm de excitação. Pequenas manchas fluorescentes são amarrados, não replicado substratos. Observe o comprimento do extremo dos produtos e ao grande número de produtos por campo (cada célula de fluxo contém&gt; 5000 tais campos). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adaptado da Ref. 1.) A, b) Kymographs típico de moléculas replicadoras de T7 (a) e E. coli (b) experimentos. c) as trajetórias Endpoint de moléculas de a) e b) plotados em função do tempo. Trajetórias estão equipados com a regressão linear para obter taxas de replicação. Exemplos mostrados são 99,4 bp s -1 e 467,1 bp s -1. d) Comprimento distribuições de produtos de replicação, se encaixam com decaimento exponencial simples para obter processabilidade: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Taxa de distribuições de trajetórias única molécula, se encaixam com gaussianas único. Significa: 75,9 ± 4,8 s -1 bp (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

Um crítico de controlo está a analisar o efeito da mancha, SYTOX Orange, sobre as proteínas de replicação de interesse. Uma maneira simples de fazer isso é realizar o experimento de replicação na célula de fluxo, como descrito, mas com a omissão de SYTOX. Após a mistura de reação fluiu através da câmara, adicionar tampão com SYTOX para manchar DNA e examinar a distribuição do comprimento das moléculas replicado. Alternativamente, reações granel padrão pode ser utilizado para verificar qualquer efeito sobre a taxa de SYTOX replicação e eficiência. O experimento aqui descrito utiliza apenas um canal de fluxo único. Isto pode ser alterado facilmente através da criação de multi-canal de câmaras de fluxo ou usando PDMS ou similar dispositivos microfluídicos. Aumentar o número de canais facilita muito triagem das concentrações de proteínas, os mutantes, ou moléculas de inibidor e aumenta a rapidez da coleta de dados de replicação. Como mencionado, realizamos a E. experimentos de replicação coli a 37 ° C utilizando uma casa construída em alumínio aquecedor de célula de fluxo, um elemento de aquecimento resistivo (aquecedor de cartucho) e fonte de alimentação variável. Isto dá boa estabilidade de temperatura e evita a compra de um aquecedor objetivo. Para calibrar o aquecedor, nós simplesmente um furo no centro de um alto fluxo de quartzo celular, inserido um termopar no canal de fluxo e fluiu buffer como normal. Medir o fluxo de temperatura tampão celular em tensões crescentes permite aquecimento precisas.

T7 Replicação: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutamato de potássio, 10 mM de cloreto de magnésio, 100 mg / mL BSA, com 5 mM ditiotreitol, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes uso. Proteínas adicionadas como: 5 nM gp4 (hexâmero), 40 nM polimerase (1:1 GP5: thioredoxin), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli replicação: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM de acetato de magnésio, 80 mM de cloreto de potássio, 100 mg / mL BSA com 10 mM ditiotreitol, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs mM, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes do uso. Proteínas adicionadas como: 30 nM DnaB (hexâmero), 180 nM DNAC (monômero), 30 nM αεθ, 15 nM 2 τ γ uma δδ&#39;χψ ou τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetrâmero), 20 nM Pria, 40 nM PRIB, 320 nM Pric, 480 nM DNAT 1,6

replicação de dna visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Nós descrevemos um simples microscopia de fluorescência baseada em método em tempo real para observar a replicação do DNA ao nível de moléculas individuais. A circular, modelo de DNA bifurcada é anexado a uma lamela de vidro funcionalizados e replicados extensivamente após a introdução das proteínas de replicação e nucleotídeos (Figura 1). O crescimento do produto DNA dupla fita (dsDNA) é estendido com fluxo laminar e visualizados usando um corante intercalando. Medir a posição do fim de DNA crescente em tempo real permite a determinação precisa da taxa de replicação (Figura 2). Além disso, o comprimento dos produtos de DNA concluído relatórios sobre a processabilidade de replicação. Este experimento pode ser realizado muito facilmente e rapidamente e requer apenas um microscópio de fluorescência com uma câmera razoavelmente sensíveis.

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Descrevemos um método simples em tempo real, baseado em microscopia de fluorescência, para observar a replicação do DNA ao nível de molécula única. Um DNA circular e bifurcado...

Nesta técnica, lamínulas de vidro são funcionalizadas com uma mistura de moléculas de PEG inertas e biotiniladas. Uma câmara de fluxo é criada com essa superfície funcionalizada e colocada sobre um microscópio TIRF. Modelos circulares biotinilados são ligados à superfície utilizando estreptavidina multivalente.Quando os substratos são replicados pela adição de proteínas da zona de replicação e nucleotídeos, o DNA de dupla fita resultante é alongado por fluxo laminar e visualizado em tempo real usando um corante intercalante. Olá, sou Nathan Tanner do laboratório de Antoine Van Ian, do Departamento de Bioquímica Biológica e Farmacologia Molecular da Escola Médica de Harvard. Sou Joe Laro, também do laboratório Van Noian.Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem de fluorescência da replicação do DNA em tempo real no nível de única molécula. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as atividades coordenadas de síntese de DNA em complexos de replicação individuais. Então, vamos começar.Para iniciar este procedimento, hibridize o oligo com cauda biotinilada ao DNA simples fita M13 adicionando um excesso de dez vezes do oligo em tampão TBS, aquecendo a 65 graus Celsius e, em seguida, desligando o bloco térmico para permitir o resfriamento lento e a adequada hibridização do iniciador. Agora que o iniciador M13 está pronto, adicione-o a uma mistura contendo 64 nanomolares da polimerase T7 e tampão de replicação T7 contendo dNDPs e cloreto de magnésio, e incube a reação a 37 graus Celsius por 12 minutos. Ao final da incubação, interrompa a reação com EDTA 100 milimolar.A seguir, purifique o DNA do produto preenchido com fenol, álcool isoamilico e clorofórmio, realize extração e diализação em tampão TE ou outro tampão de armazenamento adequado, e refaça a extração de cada fase orgânica para recuperar qualquer primer residual. Após a diálise, determine a concentração de DNA com espectrofotômetro UV-vis. Uma iteração do preparo do molde pode gerar concentração nanomolar suficiente de molde para centenas a milhares de experimentos de molécula única.Agora que o DNA está pronto, prossiga para o preparo das lamínulas funcionalizadas. O DNA a ser replicado é ligado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil Lane, no qual o grupo Oxi do Amil se liga ao vidro, deixando um amina disponível para ligar moléculas de peg biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície.Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol submetido à sonicção. Enxágue os frascos por 30 minutos, encha com hidróxido de potássio 1 M, submeta à sonicção por 30 minutos e repita ambas as lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, é necessário remover todos os vestígios de água.Encha os frascos de coloração com acetona e sonique por 10 minutos. Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga adicionando o reagente sine aos frascos e agite por dois minutos.Em seguida, interrompa a reação com um grande excesso de água. Depois, seque as lamínulas aquecendo-as a 110 graus Celsius em estufa por 30 minutos. A seguir, prepare a mistura de PEG a aproximadamente 0,2% peso por volume com PEG aminado, incluindo um espaçador de lamínula de vidro que permitirá a separação das lamínulas; pipete 100 microlitros sobre uma lamínula seca silanizada.Coloque um segundo lamínula por cima. Incube os lamínulas na solução de PEG por três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave abundantemente com água.Tenha cuidado para manter os lâminas com o lado funcionalizado voltado para cima, pois apenas um lado será revestido com peg. Por fim, seque os lâminas com ar comprimido e armazene-os sob vácuo em um dessecador; as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lâminas podem ser produzidas em um único lote e utilizadas conforme necessário.Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. Comece colocando de 20 a 25 mililitros de tampão bloqueador contendo BSA em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar em etapas posteriores. Em seguida, dilua 25 microlitros de estreptavidina em 100 microlitros de PBS e espalhe a solução sobre a superfície de uma lamínula funcionalizada com pinos; incube por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir que a estreptavidina se ligue à biotina da superfície, enquanto prepara as outras partes da câmara.Enquanto a lamínula está em incubação, corte um pedaço de fita adesiva dupla face com revestimento em ambos os lados, de modo que corresponda ao tamanho da lâmina de quartzo utilizada para montar a câmara de fluxo. Marque a posição dos orifícios para os tubos na fita com um lápis, de forma que um contorno da câmara de fluxo possa ser desenhado sobre a fita. Após marcar os orifícios, faça um retângulo de dois milímetros de largura ao redor das marcações.Este retângulo servirá como canal de fluxo, portanto, certifique-se de fazer lados retos e deixar espaço ao redor da entrada e saída da tubulação. Agora corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete para dentro do canal. Limpe a lâmina de quartzo completamente usando acetona para remover o adesivo da construção da célula de fluxo utilizada em experimentos anteriores.Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do revestimento adesivo e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina da câmara. Tenha cuidado para alinhar corretamente a fita, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desobstruídos.Em seguida, prepare os comprimentos cortados de tubo de 0,76 milímetro para a entrada e saída da célula de fluxo. É útil cortar a extremidade do tubo em um ângulo de aproximadamente 30 graus para que o tubo não fique pressionado contra o fundo da câmara. Suspenda os tubos em suportes para tubos de ensaio para facilitar a ligação à célula de fluxo nas próximas etapas.Neste momento, a incubação da lamínula já foi concluída. Enxágue bem a lamínula revestida com strep avid ENC com água e seque utilizando ar comprimido. Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um dos lados está funcionalizado.Por fim, conclua a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado da fita adesiva e colocando a lâmina de quartzo sobre a lamínula. Pressione levemente a lamínula para expelir qualquer ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a prevenir a formação de bolhas de ar no canal de fluxo.Selar os lados da câmara com epóxi. Inserir o tubo cortado nos orifícios do quartzo e selar com epóxi, deixando secar por alguns minutos. Quando o selo de epóxi estiver seco, iniciar o bloqueio da superfície.Usando uma agulha de 21 gauge. Puxe um pouco do tampão de bloqueio Degas através de um dos tubos. Lave algumas vezes para remover bolhas de ar e deixe a câmara incubando por pelo menos meia hora antes de prosseguir para o experimento de replicação de molécula única.Agora que a célula de fluxo foi bloqueada, coloque-a sobre a platina do microscópio. Segure a câmara no lugar com grampos de platina e certifique-se de que o canal de fluxo esteja alinhado ao longo do eixo y. Conecte o tubo de saída da célula de fluxo à bomba de seringa utilizando um tubo conector de diâmetro maior.Coloque a entrada no tampão de bloqueio e puxe suavemente a seringa para remover qualquer ar presente no tubo. Um leve toque no tubo de saída ajudará a eliminar bolhas de ar aprisionadas na célula de fluxo. Agora, adicione o DNA, diluindo o molde de DNA estoque até 25 picomolar em um mililitro de tampão de bloqueio, e faça fluir na câmara a uma taxa moderada, como 0,025 mililitros por minuto, durante 30 minutos, para permitir uma boa cobertura da superfície com DNA.Uma vez que o DNA esteja na câmara, remova o excesso de DNA utilizando uma lavagem com tampão bloqueador por pelo menos 200 volumes da câmara de fluxo. Para eliminar todo o DNA livre, ligue o laser e a câmera. O CCD refrigerado precisa atingir a temperatura adequada antes de poder ser utilizado.Após remover o excesso de DNA e desgaseificar o tampão de replicação, prepare a mistura de reação de replicação com nucleotídeos, DTT e citoxina no tampão de replicação. Em seguida, adicione as proteínas e misture suavemente. Depois, introduza a mistura de reação na câmara de fluxo.A velocidade do fluxo aqui precisa ser suficiente para esticar o DNA de fita dupla em um canal de fluxo com dois milímetros de largura e 100 micrômetros de altura; 0,04 mililitros por minuto funciona bem. Deixe o tempo necessário para a mistura entrar na câmara, cerca de 10 minutos.Mova o campo de visão para o lado do canal e foque no material adesivo para garantir que se está próximo à superfície ao focar e iniciar a aquisição de imagens. Ajuste a potência do laser, o foco do microscópio e o ângulo do tufo. Mantenha a potência baixa para evitar qualquer clivagem fotodinâmica do DNA marcado.Adquira de um a cinco quadros por segundo durante vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Repita para obter trajetórias de replicação mais longas ou mova para um novo campo para observar mais moléculas quando quase toda a mistura de reação tiver sido bombeada para a célula; adicione mais tampão com cit para visualizar outros campos. A obtenção de múltiplas imagens de diferentes moléculas replicadas fornece estatísticas para a determinação da produtividade.No círculo rolante. No ensaio de replicação, a síntese da fita líder estende a cauda que liga o círculo à superfície e a cauda é convertida em DNA de dupla fita pela polimerase da fita tardia e esticada pelo fluxo laminar mostrado. Aqui está um exemplo de campo de visão com citrino de citosina com excitação em 532 nanômetros.As pequenas manchas fluorescentes são substratos não replicados ancorados. Observe o comprimento extremo dos produtos e o grande número de produtos por campo. Um campo típico de visão mostrará inúmeras moléculas em replicação, visíveis como linhas brilhantes crescentes de DNA corado. Experimentos com E. coli a 37 graus Celsius apresentam de cinco a 50 moléculas por campo, dependendo da densidade superficial.A zona de replicação do fago T7 inicia com muito mais eficiência e replicará mais de 50% das moléculas em um campo. Com tal alta densidade, é difícil resolver moléculas individuais, como visto aqui. Portanto, realize o experimento com o fago T7 em concentrações mais baixas de proteína ou menor densidade superficial. Gráficos de trajetórias típicas de moléculas replicantes provenientes de experimentos com E. coli e T7 incluem trajetórias finais de moléculas de E. coli e T7 plotadas em função do tempo. As trajetórias são ajustadas por regressão linear para obter as taxas de replicação, que, neste exemplo, são de 467,1 pares de bases por segundo para E. coli e 99,4 pares de bases por segundo para T7.Para o T7, as distribuições de taxa das trajetórias de moléculas individuais ajustadas com gaussianas únicas apresentam uma média de 535,5 ± 39 pares de bases por segundo para E. coli e 75,9 ± 4,8 pares de bases por segundo. Para o T7, as distribuições de comprimento dos produtos de replicação são ajustadas com decaimento exponencial simples para obter a produtividade, que é de 85,3 ± 6,1 quilopares de bases para E. coli e 25,3 ± 1,7 quilopares de bases para o G7. Em seguida, mostramos como medir a replicação coordenada de DNA com moléculas individuais.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de funcionalizar adequadamente as lamínulas e criar canais de fluxo limpos e retos. Certifique-se de manter a carga de potência do laser baixa e minimizar a clivagem fotossensível do DNA de longa cadeia. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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