Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Nesta técnica, as lamínulas de vidro são funcionalizadas com uma mistura de moléculas inertes e de biotina. Uma célula de fluxo é criada com esta superfície funcionalizada e colocada em um microscópio de grama. Os modelos de círculo rolante biotinilado são fixados à superfície usando estreptavidina multivalente.

Quando os substratos são replicados pela adição de proteínas e nucleotídeos da zona repli, o DNA de fita dupla resultante é estendido com fluxo laminar e visualizado em tempo real usando um corante intercolante. Olá, sou Nathan Tanner, do laboratório de Antoine Van Ian no Departamento de Química Biológica e Farmacologia Molecular da Harvard Medical School. Eu sou Joe Laro, também do laboratório Van Noian.

Hoje mostraremos um procedimento para imagens de fluorescência da replicação do DNA em tempo real no nível de uma única molécula. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar atividades coordenadas de síntese de DNA de complexos de replicação individuais. Então vamos começar.

Para iniciar este procedimento, anil o oligo de cauda biotinilado ao DNA de fita simples M 13, adicionando um excesso de dez vezes de oligo no aquecimento do tampão TBS a 65 graus Celsius e, em seguida, desligando o bloco de calor para permitir o resfriamento lento para apagar adequadamente o primer. Agora que o M 13 principal está pronto, adicione-o a uma mistura de 64 nanomolares T sete DNA polimerase e T sete tampão de replicação contendo D NDPs e cloreto de magnésio e incube a reação a 37 graus Celsius por 12 minutos. No final da incubação, temperar com EDTA 100 milimolares.

Em seguida, purifique o DNA do produto preenchido com fenol, álcool isoamílico, clorofórmio, extraia e dialise em tampão TE ou outro tampão de armazenamento adequado, extraia cada fase orgânica para recuperar qualquer resíduo preparado. M 13 após diálise, determinar a concentração de DNA com espectrofotômetro UV. Uma iteração da preparação do molde pode fazer concentração nanomolar suficiente de molde para centenas a milhares de experimentos de molécula única.

Agora que o DNA está pronto, prossiga para preparar as lamínulas funcionalizadas. O DNA a ser replicado é anexado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil Lane, o grupo Oxy do Amil se liga ao vidro deixando um amin disponível para a ligação de moléculas de pinos biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície.

Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol sonicate. Por 30 minutos, enxágue os frascos e encha com um monóxido de potássio molar Sonicate por 30 minutos e repita as duas lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, todos os vestígios de água precisam ser removidos.

Encha os frascos de coloração com acetona e sonicate por 10 minutos. Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga para adicionar o reagente senoidal aos frascos e agite por dois minutos.

Em seguida, tempere com um grande excesso de água. Em seguida, seque as lamínulas assando-as a 110 graus Celsius no forno por 30 minutos. Em seguida, prepare a mistura de PEG em cerca de 0,2% de peso por volume por um pino inado, incluindo um espaçador de lamínula de vidro para permitir a separação das lamínulas, pipete 100 microlitros em uma lamínula seca siloizada.

Coloque uma segunda lamínula por cima. Incubar as lamínulas na solução de PEG durante três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave extensivamente com água.

Tenha cuidado para manter as lamínulas com o lado funcionalizado para cima, pois apenas um lado será revestido com pino. Por fim, seque as lamínulas com ar comprimido e guarde-as sob vácuo em um dessecado, as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lamínulas podem ser feitas em lote e usadas conforme necessário.

Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. Comece colocando 20 a 25 mililitros de tampão de bloqueio contendo BSA em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. Em seguida, dilua 25 microlitros de estreptavidina em 100 microlitros de PBS e espalhe a solução sobre a superfície de uma lamínula funcionalizada por 20 minutos em temperatura ambiente para permitir que a estreptavidina se ligue à biotina da superfície enquanto prepara outras partes da câmara.

Enquanto a lamínula estiver incubando, corte um pedaço de fita dupla-face com suporte em ambos os lados para que corresponda ao tamanho da lâmina de quartzo usada para montar a câmara de fluxo. Marque a posição dos orifícios da tubulação na fita com um lápis para que um contorno da câmara de fluxo possa ser desenhado na fita. Depois de marcar os furos, faça um retângulo de dois milímetros de largura ao redor das marcações.

Este retângulo servirá como canal de fluxo, portanto, certifique-se de fazer lados retos e deixar espaço ao redor da entrada e saída da tubulação. Agora corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete no canal. Limpe bem a lâmina de quartzo usando acetona para remover o adesivo da construção da célula de fluxo usada em experimentos anteriores.

Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do adesivo e coloque cuidadosamente a fita na corrediça da quadra. Tenha cuidado para alinhar a fita corretamente, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desbloqueados.

Em seguida, prepare os comprimentos de corte da tubulação de 0,76 milímetro para a entrada e saída da célula de fluxo. Ajuda a cortar a extremidade do tubo em um ângulo de cerca de 30 graus para que o tubo não pressione contra o fundo da câmara. Suspenda a tubulação em racks de tubos de ensaio para facilitar a fixação à célula de fluxo nas próximas etapas.

Até agora, a incubação da lamínula está concluída. Enxágue bem a lamínula revestida com ENC com água e seque com ar comprimido. Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um lado está funcionalizado.

Por fim, conclua a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado do suporte da fita e colocando a lâmina de quartzo na lamínula. Pressione levemente a lamínula para empurrar para fora o ar preso no adesivo. Isso ajudará a evitar que bolhas de ar entrem no canal de fluxo.

Sele as laterais da câmara com epóxi. Insira o tubo cortado nos orifícios do quartzo e sele no lugar com epóxi e deixe secar por alguns minutos. Quando a vedação epóxi estiver seca, comece a bloquear a superfície.

Usando uma agulha de calibre 21. Puxe um pouco do tampão de bloqueio de desgaseificação através de um dos tubos. Lave algumas vezes para remover as bolhas de ar e deixe a câmara incubar por pelo menos meia hora antes de passar para a replicação de uma única molécula. Experimentar.

Agora que a célula de fluxo foi bloqueada, coloque-a no microscópio stage. Segure a câmara no lugar com stage clipes e certifique-se de que o canal de fluxo esteja alinhado ao longo do eixo y. Conecte o tubo de saída da célula de fluxo à bomba de seringa usando um tubo conector de diâmetro maior.

Coloque a entrada no tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover o ar do tubo. Um movimento suave do tubo de saída ajudará a limpar quaisquer bolhas de ar presas na célula de fluxo. Agora adicione o DNA, dilua o molde de DNA de estoque para 25 picomolares em um mililitro de bloqueio do fluxo de tampão para a câmara a uma taxa de fluxo moderada, como 0,025 mililitros por minuto por 30 minutos para permitir uma boa cobertura superficial do DNA.

Assim que o DNA estiver na câmara, lave o excesso de DNA usando a lavagem do tampão de bloqueio por pelo menos 200 volumes de células de fluxo. Para se livrar de todo o DNA livre, ligue o laser e a câmera. O CCD resfriado precisa atingir a temperatura antes de poder ser usado.

Depois de lavar o excesso de DNA e desgaseificar o tampão de replicação, prepare a reação de replicação, misture os nucleotídeos DTT e a citoxina no tampão de replicação. Em seguida, adicione as proteínas e misture delicadamente. Em seguida, flua a mistura de reação para a célula de fluxo.

A velocidade do fluxo aqui precisa ser suficiente para esticar o DNA de fita dupla por dois milímetros de largura. Canal de fluxo de 100 micrômetros de altura 0,04 mililitros por minuto funciona bem. Aguarde cerca de 10 minutos para que a mistura entre na câmara.

Mova o campo de view para o lado do canal e concentre-se no material adesivo para garantir que esteja próximo à superfície para focar e iniciar a geração de imagens. Ajuste o foco do microscópio de potência do laser e o ângulo do gramado. Mantenha a potência baixa para evitar qualquer clivagem fotográfica do DNA corado.

Adquira de um a cinco quadros por segundo por vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Repita para obter trajetórias de replicação mais longas ou mova-se para um novo campo para ver mais moléculas quando quase toda a mistura de reação tiver bombeado para o fluxo celular em mais tampão com cyt para ver outros campos de visão. A obtenção de várias imagens de diferentes moléculas replicadas fornece estatísticas para a determinação da produtividade.

No círculo rolante. A síntese de força principal do ensaio de replicação estende a cauda que liga o círculo e a superfície, a cauda é convertida em DNA de fita dupla pela polimerase de fita atrasada e esticada pelo fluxo laminar mostrado. Aqui está um exemplo de campo de visão com cyt orange a 532 nanômetros de excitação.

Os pequenos pontos fluorescentes são substratos não replicados amarrados. Observe o comprimento extremo dos produtos e o grande número de produtos por campo. Um campo de visão típico mostrará numerosas moléculas replicantes visíveis à medida que as crescentes linhas brilhantes de experimentos de DNAE Coli corados a 37 graus Celsius dão de cinco a 50 moléculas por campo, dependendo da densidade da superfície.

A zona T sete repla inicia com muito mais eficiência e replica mais de 50% das moléculas em um campo. Com uma densidade tão alta, é difícil resolver moléculas individuais como visto aqui. Portanto, execute o experimento T sete em concentrações de proteína mais baixas ou densidade de superfície Os gráficos Chime de moléculas replicantes típicas de e coli e os experimentos T sete incluem trajetórias finais de moléculas de e coli e T sete plotadas em relação ao tempo em que as trajetórias são ajustadas com regressão linear para obter taxas de replicação, que neste exemplo são 467,1 pares de bases por segundo para e coli e 99,4 pares de bases por segundo.

Para T sete, as distribuições de taxa de trajetórias de molécula única ajustadas com gaussianos únicos dão uma média de 535,5 mais ou menos 39 pares de bases por segundo para e coli e 75,9 mais ou menos 4,8 pares de bases por segundo. Para T sete, as distribuições de comprimento dos produtos de replicação são ajustadas com decaimento exponencial único para obter produtividade, que é 85,3 mais ou menos 6,1 pares de quilobases para e coli e 25,3 mais ou menos 1,7 pares de quilobases para G sete. Então, acabamos de mostrar como medir a replicação coordenada do DNA com moléculas únicas.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de funcionalizar adequadamente as lamínulas e fazer canais de fluxo retos e limpos. Certifique-se de manter a carga de energia do laser e minimizar a clivagem fotográfica do DNA longo. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.