Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

Olá, sou Andrea Balbo. Eu trabalho no grupo Peter Shucks no National Institutes of Health. Neste vídeo, vamos demonstrar a você nossos procedimentos para a montagem, carregamento e alinhamento do rotor de uma célula de amostra de ultracentrífuga analítica.

Vamos começar. Coletados. Aqui estão os componentes de uma célula de amostra de ultracentrífuga analítica Empilhado dentro do invólucro da célula está um campo de carvão de setor duplo de 12 milímetros, peça central epon que será imprensada entre dois conjuntos de janela. Cada conjunto de janela consiste em uma junta de janela, um forro de janela e uma janela mantida dentro do suporte da janela.

Essas peças serão então deslizadas para dentro do invólucro da célula, alinhando seus rasgos de chaveta com a chave encontrada dentro do cilindro do invólucro, uma junta do invólucro e, em seguida, um anel de parafuso fechou a célula de amostra com uma pressão de torque entre 120 e 140 libras-polegada. Depois de carregar sua amostra em referência a duas juntas do plugue do invólucro e um plugue do invólucro vedam os orifícios de carregamento da célula para evitar artefatos de varredura, vazamentos e quebras durante os experimentos, é vital que todos os componentes estejam limpos, secos, sem poeira, livres e nas melhores condições possíveis, examine com frequência e substitua quando necessário. Você também precisará do seguinte, uma ultracentrífuga analítica, rotor de titânio de quatro orifícios, uma balança de laboratório, uma chave de torque com mostrador legível e um suporte de torque, um contrapeso e pesos de contrapeso, uma chave de fenda, um par de pinças, um pipetador de 200 microlitros equipado com uma ponta de pipeta cônica longa, ferramentas de alinhamento e lubrificante spin coat.

Começamos a construção da célula de amostra juntando dois conjuntos de janelas. Primeiro coloque uma junta de janela na parte inferior do suporte da janela. Em seguida, posicione o forro da janela, ou às vezes é chamado de almofada de janela dentro do suporte da janela, de modo que a abertura do forro fique oposta ao rasgo de chaveta do suporte em um pequeno ângulo.

Em seguida, coloque a janela no suporte, alinhando a marca de riscagem na janela com o rasgo de chaveta do suporte da janela. Pressione suavemente as bordas em ambos os lados da janela. Para garantir a vedação adequada e o twerk preciso da célula de amostra, revestimos levemente a junta do invólucro no anel do parafuso.

Com o lubrificante spin coat, espalhe uma quantidade muito pequena de spin coat entre o polegar e o indicador. Cubra as roscas do anel do parafuso com uma película fina e invisível de spin coat. Da mesma forma, cubra a junta da caixa.

Limpe qualquer lubrificante visível. Para iniciar a montagem da célula de amostra. Deslize um conjunto de janela com a janela voltada para cima em sua direção no compartimento da célula, alinhando o rasgo de chaveta com a chave do invólucro.

Alinhe o rasgo de chaveta central com a chave da caixa e deixe-a cair suavemente em cima do conjunto da janela dentro da caixa. Nunca use qualquer tipo de ferramenta para empurrar a peça central para dentro do compartimento da célula. Isso pode causar danos permanentes à peça central, resultando em experimentos de armazenamento de vazamentos.

Gire o segundo conjunto da janela de forma que a janela fique voltada para a peça central e para longe de você. Alinhe o rasgo de chaveta com a chave da caixa e deslize-o para baixo na parte superior da peça central. Coloque a junta da caixa em cima.

Em seguida, um anel de parafuso para que a palavra fique visível. Usando os dedos. Em seguida, uma ferramenta de alinhamento, aperte manualmente o anel do parafuso.

Às vezes, a peça central não desliza facilmente para dentro do cilindro da carcaça. Você pode primeiro alinhá-lo e, em seguida, colocar o segundo conjunto de janela em cima dele. Aplicando uma leve pressão para baixo no conjunto da janela.

Você pode deslizar ambos para dentro do invólucro da célula ao mesmo tempo. Desta forma, evitamos pressionar diretamente a peça central. Agora é um bom momento para procurar na célula por fiapos de poeira e impressões digitais.

Você também notará os anéis de Newton que indicam que ainda há ar entre a peça central e as janelas. Eles desaparecerão após o aperto com o anel de parafuso para cima e a palavra visível. Coloque a célula de amostra totalmente dentro da célula.

Colette de torque do suporte de torque. Mantenha a célula no lugar aplicando pressão constante na alça do suporte de torque. Em um movimento contínuo, aperte o anel do parafuso entre 120 e 140 libras de polegada.

Solte a alça do suporte de torque e remova cuidadosamente a célula de amostra. Carregamos rotineiramente um volume de 400 microlitros em cada setor da peça central de 12 milímetros. Usando uma pipeta de 200 microlitros, posicione a célula de amostra com os orifícios de carga na parte superior e a palavra no anel do parafuso visível.

Deslize a ponta da pipeta até a metade para o setor central esquerdo através dos orifícios de carregamento e dispense lentamente 200 microlitros de solução de referência. Repita uma vez para totalizar 400 microlitros usando a mesma ponta de pipeta e a mesma técnica com cuidado e lentamente. Encha o setor de centro de mesa direito com 400 microlitros de solução de amostra.

É imperativo combinar os volumes de referência e soluções de amostra o mais próximo possível. Encaixar a ponta da pipeta firmemente na pipeta, carregar e dispensar lentamente as soluções, evitando o carregamento de bolhas e usando a mesma ponta da pipeta para ambas as soluções. Todos ajudam a manter os volumes iguais para selar a célula.

Coloque duas juntas vermelhas do plugue da caixa confortavelmente em cada orifício de carregamento, certificando-se de que estejam posicionadas cuidadosamente entre a peça central e a carcaça de alumínio. Cubra cada orifício de carregamento com um plugue de caixa e aperte manualmente com uma pequena chave de fenda. Antes de carregar o rotor, certifique-se de que o contrapeso e a célula que ficará oposta ao contrapeso estejam a 0,5 gramas um do outro em peso.

Comece com um saldo em zero. Primeiro, pese uma célula de amostra que estará em posição oposta ao contrapeso. Rasgue a balança para subtrair o peso da célula da amostra.

Em seguida, pese o contrapeso. Aqui descobrimos que o contrapeso é 4,193 gramas mais leve que a célula de amostra. Selecione um peso de contrapeso de quatro gramas e aparafuse-o no orifício de fixação do contrapeso, certificando-se de que não se projete do topo.

Pese o contrapeso para certificar-se de que o peso final esteja dentro de 0,5 gramas. Usando um rotor de quatro orifícios, coloque o contrapeso na posição quatro de modo que a seta branca fique visível e apontando na direção da força centrífuga. Usando uma ferramenta de alinhamento, certifique-se de que ela esteja totalmente dentro do rotor.

Posicione a célula de amostra da balança com os plugues da caixa voltados para o centro do rotor e a palavra no anel do parafuso visível. Novamente, usando uma ferramenta de alinhamento, certifique-se de que esteja totalmente dentro do rotor. Olhando por baixo do rotor.

Alinhe o interior. Escriba, marque a marca mais próxima do centro do rotor com a marca de riscagem no contrapeso Usando uma ferramenta de alinhamento. Da mesma forma, alinhe a célula de amostra na posição dois.

Depois que todas as células estiverem alinhadas, o rotor está pronto para ser colocado na câmara da centrífuga.