Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Para estudar a dinâmica de moléculas individuais ao longo de um período prolongado de tempo, é necessário primeiro localizá-las no espaço. Isso é conseguido imobilizando-as na superfície de uma célula microfluídica. O procedimento começa com a montagem da célula, que contém quatro câmaras onde as biomoléculas serão fixadas.

As câmaras estão conectadas ao exterior por meio de capilares de entrada e saída. A célula é feita pela fusão de um disco de PDMS com padrão definido a uma lamínula de quartzo. A célula montada é então fixada no microscópio de fluorescência e tubos flexíveis são conectados aos capilares para permitir a troca fácil de soluções através das câmaras, ativando primeiro a superfície para imobilização de moléculas com um fluxo, uma solução de BSA biotinilada através de um dos canais.

A BSA será absorvida pela câmara. Em seguida, faça passar uma solução de estreptavidina, que por sua vez se ligará à biotina. Por fim, faça passar o oligonucleotídeo biotinilado, que se ligará à estreptavidina, fixando assim a molécula de interesse à superfície da lamínula de quartzo.

Um tampão de imagem projetado para maximizar a estabilidade e a intensidade da duração de vida dos fluoróforos é fluído através da câmara a uma taxa constante durante todo o período de aquisição. A configuração automatizada varre diferentes seções da superfície em busca de moléculas que possuam fluoróforos doador e aceitador, e então as move uma a uma para o volume de detecção, obtendo para cada uma uma curva temporal de intensidade de fluorescência até que ambos os fluoróforos sofram fotobranqueamento. Olá, sou Nicholas Dfi do laboratório do Professor Miller do departamento de engenharia biomédica da Universidade de Boston.

Hoje vamos mostrar um procedimento para obter traços de F de molécula única a partir de ácidos nucleicos imobilizados utilizando um arranjo confocal. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a dinâmica de ácidos nucleicos e as interações entre ácidos nucleicos e enzimas. Então, vamos começar.

O Microfluid Excel é produzido pela fusão de um disco de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS com dois milímetros de espessura e previamente moldado a uma lamínula de quartzo recentemente limpa. Para fabricar o disco de PDMS moldado, combine 10 partes da base de elastômero de silicone com uma parte do agente de cura, misture bem e desgaseifique por uma hora em vácuo. Após a desgaseificação da base de elastômero, despeje-a suavemente no molde da célula microfluídica.

Deixe a mistura de elastômero curar em uma placa aquecedora a 70 graus Celsius por duas horas. Após a cura, retire cuidadosamente o disco de PDMS do molde usando uma lâmina de barbear. O disco de PDMS contém quatro câmaras retangulares de 30 microlitros.

Fusione o lado plano do disco de PDMS, o lado que não contém os canais, a uma janela de vidro de uma polegada por oxidação a plasma de ambas as superfícies por 30 segundos. A janela de vidro possui de oito a dois orifícios de dois milímetros em ambas as extremidades dos canais, que foram previamente perfurados. Em seguida, um tubo capilar flexível de sílica fundida com dois centímetros de comprimento é inserido através de cada orifício da janela de vidro.

Para fazer isso, insira primeiro uma agulha e, em seguida, insira o tubo capilar até que alcance o canal. Sobre as aberturas da janela de vidro, aplique um composto de cura rápida para moldagem de silicone, como o quick cast. Enxágue os canais com etanol e água após a ativação por plasma da célula e de uma lamínula circular de quartzo de uma polegada previamente limpa com solução piranha por 30 segundos.

Fusione a lamínula ao lado da célula contendo os canais. As câmaras estão agora seladas. Deixe a célula montada curando durante a noite à temperatura ambiente.

Após a microfluídica montada em Excel ter sido curada durante a noite, ela é colocada em um suporte personalizado e montada na platina do microscópio confocal para iniciar a ativação da superfície da célula. Para a imobilização da molécula, conecte tubos flexíveis aos capilares da célula para facilitar a injeção de tampão utilizando uma seringa e uma agulha. Agora, injete uma solução de 0,1 miligramas por mililitro de BSA biotinilada no tampão A no canal e incube por pelo menos 30 minutos.

Após a incubação de 30 minutos, faça passar de 300 a 500 microlitros do tampão A para remover qualquer BSA biotinilada não absorvida do canal, tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar na câmara. Em seguida, injete uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de STR din no tampão A e incube por 15 minutos.

Após o fluxo de incubação de 15 minutos, adicione 300 a 500 microlitros do tampão A para remover qualquer strep din não absorvido do canal. Como antes, evite aprisionar bolhas de ar na câmara. Finalmente, faça passar uma solução de três a cinco picomolares da amostra biotinilada.

Para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes, realiza-se uma varredura da superfície. Incube a amostra biotinilada por 10 minutos e repita o fluxo do tampão. Como mostrado anteriormente, o tampão de imagem ou IB consiste em um sistema enzimático de eliminação de oxigênio e um quenchador de tríade, como trol, para que o IB seja dissolvido primeiro.

Cinco miligramas de trol se ligam a 10 mililitros de tampão de glicose por meio de vortex por alguns minutos e agitação por pelo menos 10 minutos. Filtre a solução e deixe-a sob gaseificação em vácuo por 10 minutos. Misture suavemente a solução de TRO lock com a solução enzimática Glocky, evitando a formação de bolhas de ar.

Encha o reservatório com a solução IB. Em seguida, utilizando uma bomba de seringa mecânica, controle a taxa de fluxo, fazendo a IB passar pelo canal a uma taxa constante de cinco microlitros por minuto, e borbulhe gás argônio no reservatório de IB para impedir que o oxigênio atmosférico se dissolva no tampão. A varredura da superfície, a localização de moléculas e a aquisição de traços de intensidade de molécula única são controladas pelo programa LabVIEW, que varre áreas de 20 por 20 micrômetros quadrados com resolução de 0,2 micrômetro à taxa de 0,1 micrômetro por milissegundo.

Os dados da varredura de superfície são imediatamente processados para fornecer as posições ponderadas pela intensidade de todos os pixels acima das contagens de fundo. Uma vez localizadas as moléculas imobilizadas, elas são movidas uma a uma para o volume confocal e as intensidades do fluoróforo doador e do aceptor são registradas em função do tempo até que ambos os fluoróforos sofram fotobranqueamento. Em seguida, a platina é programada para mover-se até uma nova origem, a 100 milímetros de distância, e o processo de varredura é repetido.

O MICROFLUID Excel montado é mostrado aqui. Estas são varreduras de superfície mostrando moléculas individuais nos canais doador verde e aceptor vermelho. Alguns traços típicos de moléculas individuais mostrando a intensidade do aceptor em vermelho e do doador em verde são apresentados.

Acabamos de mostrar como obter traços de moléculas individuais a partir de biomoléculas imobilizadas utilizando um arranjo confocal. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar cada etapa com cuidado e paciência, pois se trata de um experimento desafiador. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.