Name: Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprenda a obter traços de FRET de moléculas únicas de DNA imobilizadas em superfície usando microscopia confocal automatizada. Este método permite estudar dinâmica de ácidos nucleicos e interações com enzimas em tempo real.

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Agradecemos a Chandran Sabanayagam por sua ajuda no desenvolvimento do sistema, Joshua Edel para aconselhamento sobre a concepção do dispositivo micro e os funcionários do Instituto Rowland na Universidade de Harvard para usinagem de peças da instalação. Reconhecemos discussões úteis com os membros do grupo Meller no Instituto Rowland e na Universidade de Boston, e os membros do grupo T. Ha &#39;s em UIUC para informações úteis. Finalmente, agradecemos o apoio financeiro da National Science Foundation (PHY-0701207) e do Instituto Nacional de Saúde (GM075893).

1 - Montagem da célula microfluídica A célula microfluídica é feita por uma fusão padronizada, 2 mm de espessura, polidimetilsiloxano disco (PDMS) para uma cobertura de vidro de quartzo limpo de fresco. O disco contém quatro PDMS 30 mL câmaras retangulares que são acessados ​​por entrada e saída flexíveis capilares conectados a um reservatório de tampão e uma bomba de seringa, respectivamente, para o fluxo controlado de buffer. A célula de fluxo é suportado em sua parte traseira por uma janela de vidro e colocado em um porta-celular feito sob medida contendo um elemento termoelétrico refrigerado a água para regular a temperatura. <ol><li> Para fazer o padrão PDMS disco, misturar 10 partes de base elastômero de silicone com um agente de cura parte, misture bem e deixe por 1 hora de desgaseificação a vácuo. </li><li> Delicadamente despeje a mistura de elastômero para o molde de células microfluídicos. No nosso caso, este é um um wafer de silício &quot;, com quatro faixas (1x10 1x10 4 x 3 x 300 mm) feita a partir de fotorresiste negativo. Deixe isso para a cura em uma placa quente a 70 ° C por duas horas. </li><li> Retire cuidadosamente o disco PDMS curado do molde utilizando uma lâmina de barbear. Fundir o disco em uma janela de vidro 1&#39;&#39;(contendo 8 x 2 mm de diâmetro pré-furos em ambas as extremidades dos canais) por plasma oxidante ambas as superfícies por 30 segundos. Fusível as janelas de vidro para o lado plano do disco PDMS (o lado que não contenham os canais). </li><li> Inserir um tubo de 2 polegadas de sílica fundida longo e flexível capilar através do orifício de cada janela de vidro, até atingir o canal. Inserção de uma agulha e depois seguir com o capilar pode facilitar este processo. Os orifícios de vidro da janela usando um composto de fundição de cura rápida de silicone tais como Kwik-Cast. </li><li> Enxágüe os canais com etanol e água, e plasma-ativar a célula em conjunto com um recém-limpos, lamínula de 1 polegada circular de quartzo por 30 segundos. Sugerimos a limpeza dessa lamínula usando piranha *. Fundir o lamínula para o lado da célula que contém os canais, de vedação das câmaras. </li><li> Deixe o celular se reuniram para cura de noite à temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha é uma solução de H 2 O 2 e H 2 SO 4 em 1:2,5 proporções. Para limpar o lamínulas, mergulha-as na piranha a 90 ° C por 20 min. 2 - Ativação da superfície para imobilização molécula Para estudos de ácido nucléico, o esquema mais simples imobilização de superfície consiste em primeiro revestimento de vidro ou de quartzo com lamínula biotinilado albumina bovina (BSA) e depois com estreptavidina. Isto permite que a amostra biotinilado a ser imobilizada com alta especificidade para os dias em temperatura ambiente. <ol><li> Conectar tubos flexíveis para os capilares para a injecção de buffer fácil usando uma seringa e agulha. </li><li> Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de BSA biotinilado em tampão A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrado através de filtros 0,02 mm) para o canal e incubar por pelo menos 30 min. </li><li> ML de tampão de fluxo 300-500 A para remover qualquer BSA livre biotinilado do canal, tomando cuidado para não prender as bolhas de ar no interior da câmara. </li><li> Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de estreptavidina em tampão A e incubar por 15 min. Em seguida, repita a Etapa 3. </li><li> Fluxo através de uma solução pM 05/03 da amostra biotinilado. Realizar um exame de superfície para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes. Se necessário, aumentar a concentração da amostra para obter uma melhor cobertura. Incubar por 10 min e repita o passo 3. </li></ol> A célula microfluídica é montado em um palco motorizado xy permitindo movimento (até 25 mm) grossa usando codificada opticamente motores DC, e do movimento (1 nm) bem usando dois acionadores de circuito fechado piezo (Physik Instrumente modelo M-014 ou similar). Isto pode ser feito antes ou após a ativação da superfície para a imobilização da amostra. 3 - Preparar o tampão Imaging (IB) O IB consiste de um sistema enzimático de limpeza de oxigênio e um supressor triplet, como Trolox. Uma vez que o IB é lavada através constantemente durante a noite, pelo menos, 10 ml deve ser preparado com antecedência. <ol><li> Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glicose, pelo menos 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl em água deionizada. A maior concentração de tampão é importante por duas razões: Trolox dissolvendo vai acidificar a solução, ea reação enzimática irá também diminuir o pH da solução ao longo do tempo. Uma vez que esta solução tem uma vida útil longa, pode ser armazenado como uma solução de reserva. </li><li> Dissolver 5 mg de Trolox no buffer preparada na Etapa 1 em vortex por alguns minutos e, em seguida, balançando para&gt; 10 min. Trolox não é muito solúvel em água em pH&gt; 7, por isso não apressar esse passo. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mm e deixar de desgaseificação a vácuo por 10 minutos. </li><li> Prepare a solução &quot;gloxy&quot; enzimática através da mistura de 60 mL water, 20 l de tampão 5X A, 20 l de catalase, uma glicose oxidase mg e 100 l de 10 mg / ml BSA. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 mM centrífuga. </li><li> Misture delicadamente o buffer da Etapa 2 com a solução &quot;gloxy&quot; do Passo 3 evitando a formação de bolhas de ar. </li><li> O fluxo IB através do canal a uma taxa constante de 5 mL / min usando uma bomba de seringa mecânicas para controlar a vazão. Bolha de gás argônio para o reservatório IB para evitar que o oxigênio atmosférico de re-dissolvendo-se no buffer. </li></ol> A varredura de superfície, localização molécula e aquisição de traços de intensidade única molécula é controlado por um programa LabView que permite a coleta de dados automatizada 1. O programa verifica 20x20 M 2 áreas em 0,2 mM resolução, com uma taxa de 0,1 mícron / ms. Os dados são processados ​​imediatamente para produzir intensidade ponderadas localizações de todos os pixels acima da contagem de fundo. Uma vez que as moléculas imobilizadas são encontrados, eles são movidos um por um para o volume confocal e as intensidades do doador e receptor fluoróforo são registrados como uma função do tempo até que ambos photobleach fluoróforos. O estágio é então programado para mover para uma nova origem 100 mm de distância, e o processo de digitalização é repetido. 4 - Resultados Representante Abaixo estão algumas imagens que mostram a célula montada microfluídicos antes da ativação da superfície e depois de ser montado no microscópio pronto para imobilização molécula. Se o canal é ativado com sucesso, verifica a superfície deve ser semelhante ao ilustrado abaixo scans mostrando de emissão do doador de corante (verde) e receptor (vermelho) após a excitação do doador direto. Estas moléculas são movidos um por um para o volume de sondagem ea fluorescência é registrado ao longo do tempo até que ambos photobleach corantes, como mostrado nos traços única molécula. A partir de vestígios como estes pode-se obter a eficiência FRET que informa sobre a separação dos doadores aceitador-instantânea, que por sua vez é usado para explorar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: Célula microfluídica com quatro canais, cada um com entrada / saída capilares. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Célula montado no microscópio pronto para medições. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Configuração para sm-FRET medições. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Figuras 4 e 5: canal vermelho e verde de um exame de superfície de imobilizado FRET moléculas animado com laser verde. Clique para ver uma versão maior da <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figura 4</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">a figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figuras 6, 7, 8 e 9: trajetórias Intensidade do doador (verde) e receptor (vermelho) fluoróforos rotulados a uma molécula de DNA 8, 10, 16 e 18 pares de bases de distância. Clique para ver uma versão maior da <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">a figura 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Embora o protocolo acima foi optimizado para o nosso sistema em particular e para uma escolha específica de corantes (TMR e ATTO647N), é de modo algum o único método provado. Recentemente, um sistema de oxigênio alternativa limpeza composto de ácido protocatecuico (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxigenase (PCD) foi mostrado para aumentar a fotoestabilidade de determinados corantes 4. Da mesma forma, outros triplet estado quenchers tais como β-mercaptoetanol (BME) pode ser usado em vez de Trolox, embora estes não podem suprimir de longa duração piscar de alguns corantes, em particular Cy5 5. Apesar de imobilização via biotina-estreptavidina-biotina albumina bovina (BSA) é a escolha preferida para estudos ácidos nucléicos, um polietileno glicol (PEG) com revestimento de superfície é mais adequado para estudos de proteínas, uma vez que impede não-específica de adesão 1. Além disso, sub-difração limitada vesículas tamanho pode ser usado para encapsular a biomolécula de interesse nos casos em que pode ser afetada por interações de superfície 6. Neste artigo nós usamos uma configuração confocal equipado com fotodiodos avalanche de silicone para adquirir os traços intensidade de fluorescência. Este protocolo funciona igualmente bem com a Total microscópios reflexão interna de fluorescência (TIRF) equipados com câmeras CCD. Independentemente da microscopia utilizadas, sm-FRET pode informar sobre resoluções espaciais aproximando do angstrom, quando o doador eo receptor de sinal estão devidamente corrigido 7.

<table><tbody><tr><td>Tubo capilar de sílica fundida</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de cobertura de sílica fundida</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA biotinilada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Kit Elastômero Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Kit de Elastômero de Silicone</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glicose Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Selante Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Composto de Moldagem de Silicone</td></tr></tbody></table>

sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de superfície-imobilizada biomoléculas

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia tem sido amplamente utilizada para estudar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico, tais como ácidos nucléicos e proteínas. Única molécula FRET (sm-FRET) medições em moléculas imobilizadas permitir observações longo do sistema de forma eficaz até que ambos os corantes photobleach, resultando em tempo de traços que o relatório sobre a dinâmica biomolecular com uma ampla gama de escalas de tempo de milissegundos para minutos. Para facilitar a aquisição de grande número de vestígios de análises estatísticas, o processo deve ser automatizado e ao meio ambiente amostra deve ser rigidamente controlado sobre o tempo de medição inteira (~ 12 horas). Isso é feito usando um microscópio de varredura confocal automatizada que permite o interrogatório de milhares de moléculas individuais durante a noite, e uma célula microfluídicos que permite a troca de tampão controlada, com teor de oxigênio restrito e mantém uma temperatura constante durante todo o período de medição. Aqui nós mostramos como montar o dispositivo micro e como ativar a sua superfície para imobilização de DNA. Então nós explicamos como preparar um tampão para maximizar a fotoestabilidade e duração da fluoróforos. Finalmente, vamos mostrar os passos envolvidos na preparação da instalação para a aquisição automatizada de molécula tempo resolvido única FRET traços de moléculas de DNA.

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

A microscopia de Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET) tem sido amplamente utilizada para estudar a estrutura e a dinâmica de moléculas de interesse biológico, ...

Para estudar a dinâmica de moléculas individuais ao longo de um período prolongado de tempo, é necessário primeiro localizá-las no espaço. Isso é conseguido imobilizando-as na superfície de uma célula microfluídica. O procedimento começa com a montagem da célula, que contém quatro câmaras onde as biomoléculas serão fixadas.As câmaras estão conectadas ao exterior por meio de capilares de entrada e saída. A célula é feita pela fusão de um disco de PDMS com padrão definido a uma lamínula de quartzo. A célula montada é então fixada no microscópio de fluorescência e tubos flexíveis são conectados aos capilares para permitir a troca fácil de soluções através das câmaras, ativando primeiro a superfície para imobilização de moléculas com um fluxo, uma solução de BSA biotinilada através de um dos canais.A BSA será absorvida pela câmara. Em seguida, faça passar uma solução de estreptavidina, que por sua vez se ligará à biotina. Por fim, faça passar o oligonucleotídeo biotinilado, que se ligará à estreptavidina, fixando assim a molécula de interesse à superfície da lamínula de quartzo.Um tampão de imagem projetado para maximizar a estabilidade e a intensidade da duração de vida dos fluoróforos é fluído através da câmara a uma taxa constante durante todo o período de aquisição. A configuração automatizada varre diferentes seções da superfície em busca de moléculas que possuam fluoróforos doador e aceitador, e então as move uma a uma para o volume de detecção, obtendo para cada uma uma curva temporal de intensidade de fluorescência até que ambos os fluoróforos sofram fotobranqueamento. Olá, sou Nicholas Dfi do laboratório do Professor Miller do departamento de engenharia biomédica da Universidade de Boston.Hoje vamos mostrar um procedimento para obter traços de F de molécula única a partir de ácidos nucleicos imobilizados utilizando um arranjo confocal. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a dinâmica de ácidos nucleicos e as interações entre ácidos nucleicos e enzimas. Então, vamos começar.O Microfluid Excel é produzido pela fusão de um disco de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS com dois milímetros de espessura e previamente moldado a uma lamínula de quartzo recentemente limpa. Para fabricar o disco de PDMS moldado, combine 10 partes da base de elastômero de silicone com uma parte do agente de cura, misture bem e desgaseifique por uma hora em vácuo. Após a desgaseificação da base de elastômero, despeje-a suavemente no molde da célula microfluídica.Deixe a mistura de elastômero curar em uma placa aquecedora a 70 graus Celsius por duas horas. Após a cura, retire cuidadosamente o disco de PDMS do molde usando uma lâmina de barbear. O disco de PDMS contém quatro câmaras retangulares de 30 microlitros.Fusione o lado plano do disco de PDMS, o lado que não contém os canais, a uma janela de vidro de uma polegada por oxidação a plasma de ambas as superfícies por 30 segundos. A janela de vidro possui de oito a dois orifícios de dois milímetros em ambas as extremidades dos canais, que foram previamente perfurados. Em seguida, um tubo capilar flexível de sílica fundida com dois centímetros de comprimento é inserido através de cada orifício da janela de vidro.Para fazer isso, insira primeiro uma agulha e, em seguida, insira o tubo capilar até que alcance o canal. Sobre as aberturas da janela de vidro, aplique um composto de cura rápida para moldagem de silicone, como o quick cast. Enxágue os canais com etanol e água após a ativação por plasma da célula e de uma lamínula circular de quartzo de uma polegada previamente limpa com solução piranha por 30 segundos.Fusione a lamínula ao lado da célula contendo os canais. As câmaras estão agora seladas. Deixe a célula montada curando durante a noite à temperatura ambiente.Após a microfluídica montada em Excel ter sido curada durante a noite, ela é colocada em um suporte personalizado e montada na platina do microscópio confocal para iniciar a ativação da superfície da célula. Para a imobilização da molécula, conecte tubos flexíveis aos capilares da célula para facilitar a injeção de tampão utilizando uma seringa e uma agulha. Agora, injete uma solução de 0,1 miligramas por mililitro de BSA biotinilada no tampão A no canal e incube por pelo menos 30 minutos.Após a incubação de 30 minutos, faça passar de 300 a 500 microlitros do tampão A para remover qualquer BSA biotinilada não absorvida do canal, tomando cuidado para não aprisionar bolhas de ar na câmara. Em seguida, injete uma solução de 0,1 miligrama por mililitro de STR din no tampão A e incube por 15 minutos.Após o fluxo de incubação de 15 minutos, adicione 300 a 500 microlitros do tampão A para remover qualquer strep din não absorvido do canal. Como antes, evite aprisionar bolhas de ar na câmara. Finalmente, faça passar uma solução de três a cinco picomolares da amostra biotinilada.Para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes, realiza-se uma varredura da superfície. Incube a amostra biotinilada por 10 minutos e repita o fluxo do tampão. Como mostrado anteriormente, o tampão de imagem ou IB consiste em um sistema enzimático de eliminação de oxigênio e um quenchador de tríade, como trol, para que o IB seja dissolvido primeiro.Cinco miligramas de trol se ligam a 10 mililitros de tampão de glicose por meio de vortex por alguns minutos e agitação por pelo menos 10 minutos. Filtre a solução e deixe-a sob gaseificação em vácuo por 10 minutos. Misture suavemente a solução de TRO lock com a solução enzimática Glocky, evitando a formação de bolhas de ar.Encha o reservatório com a solução IB. Em seguida, utilizando uma bomba de seringa mecânica, controle a taxa de fluxo, fazendo a IB passar pelo canal a uma taxa constante de cinco microlitros por minuto, e borbulhe gás argônio no reservatório de IB para impedir que o oxigênio atmosférico se dissolva no tampão. A varredura da superfície, a localização de moléculas e a aquisição de traços de intensidade de molécula única são controladas pelo programa LabVIEW, que varre áreas de 20 por 20 micrômetros quadrados com resolução de 0,2 micrômetro à taxa de 0,1 micrômetro por milissegundo.Os dados da varredura de superfície são imediatamente processados para fornecer as posições ponderadas pela intensidade de todos os pixels acima das contagens de fundo. Uma vez localizadas as moléculas imobilizadas, elas são movidas uma a uma para o volume confocal e as intensidades do fluoróforo doador e do aceptor são registradas em função do tempo até que ambos os fluoróforos sofram fotobranqueamento. Em seguida, a platina é programada para mover-se até uma nova origem, a 100 milímetros de distância, e o processo de varredura é repetido.O MICROFLUID Excel montado é mostrado aqui. Estas são varreduras de superfície mostrando moléculas individuais nos canais doador verde e aceptor vermelho. Alguns traços típicos de moléculas individuais mostrando a intensidade do aceptor em vermelho e do doador em verde são apresentados.Acabamos de mostrar como obter traços de moléculas individuais a partir de biomoléculas imobilizadas utilizando um arranjo confocal. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de executar cada etapa com cuidado e paciência, pois se trata de um experimento desafiador. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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