Name: O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprenda a usar SC1 para manter a auto-renovação de células-tronco embrionárias de camundongo sem LIF. Este método oferece uma alternativa econômica para cultivo celular em laboratório.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Sheng Ding do The Scripps Research Institute e Dr. Deng Hongkui da Universidade de Pequim por sua assistência e direção.

1. Preparação das placas de alimentação MEF <ol><li> Um dia antes de as células ES de cultura, frasco de descongelar um dos irradiados E14.5 CF-1 células alimentadoras MEF (veja nosso procedimento para descongelar células ES). </li><li> A placa de células alimentadoras MEF a uma densidade de 10.000 células / poço em uma placa de 12 poços. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. MEF célula mídia: DMEM suplementado com 10% ES-PBS, 1X e 1X glutamina não-aminoácidos essenciais. </li></ol> 2. Manutenção da auto-renovação das células ES rato <ol><li> Separar as células ES usando tripsina. Semente as células a uma densidade de 50.000 células / poço sobre as placas MEF previamente preparado alimentador em meios de crescimento (MEM suplementado com Knockout KSR 15%, 4 mM L-glutamina, 0,1 mM não-aminoácidos essenciais e 1X BME) suplementado com SC1 na concentração desejada (usamos 100 nM, 300 nM e 1 mM). Nós também adicionamos um controle positivo bem que foi complementado com 1000 μ / ml de LIF. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Cultura das células a 37 ° C e 5% CO 2 por 3-4 dias em cada passagem. Atualizar media a cada 48 horas. </li><li> Células passagem 1:10 - 01:15 com tripsina para manter uma densidade semelhante como a densidade de semeadura inicial. Depois de cinco passagens, as células podem ser examinados para a expressão de marcadores de pluripotência típico usando imunocitoquímica. </li></ol> 3. Exame imunocitoquímico de marcadores pluripotência <ol><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS. </li><li> Fixar as células com 500 mL de fixador por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS. </li><li> Bloco de ligação não específica com 500 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente. </li><li> Incubar as células com 250 mL do anticorpo primário específico (usamos Nanog, Sox2, SSEA1 e Oct4 nas seguintes diluições: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500) </li><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS. </li><li> Incubar as células com 250 mL de anticorpo secundário por duas horas à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos burro anti-rato conjugada com Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e anti-burro coelho conjugados com Alexa Fluor ® 488 em 1 : 2000). </li><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS. </li><li> Adicionar DAPI (concentração final de 1 mg / ml) para a última lavagem e incubar 5 minutos para visualizar núcleos. </li><li> Analisar as células em um microscópio fluorescente. </li></ol> 4. Resultados representativos: 1. Morfologia resultados: Células de camundongo ES (ESC R1) foram cultivadas em células alimentadoras MEF na presença de qualquer LIF ou SC1 para sustentar a auto-renovação em um estado indiferenciado. Após a segunda passagem, a diferenciação pode ser observada em células sem LIF ou SC1 (controle negativo) e depois de 5 passagens essencialmente nenhuma colônias indiferenciado foram observados. LIF (controle positivo) colónias tratadas permaneceu em um estado indiferenciado, durante o 5 passagens celular. Células tratadas com SC1 em concentrações de 300 nm ou 100 nM também permaneceu indiferenciado após 5 passagens, no entanto, as células tratadas com 1 mM morte celular SC1 experimentado após a quarta passagem. (Fig. 2 de nota app) A Tabela 1 resume as observações morfológicas. 2. Expressão de marcadores pluripotência Células-tronco embrionárias de rato mantidos por 5 passagens foram fixados e analisados ​​por imunocitoquímica para SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Expressão do marcador foi semelhante às células mantidas em LIF. (Fig. 3 e 4 de nota app) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: comparação Morfologia de células mantidas em LIF ou SC1. Nenhuma diferença na morfologia foi observada. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figura 2 e 3" /> Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 coloração de células ES mantido com SC1 ou LIF (fig. 4 de nota app). Células mantidas em SC1 mostram expressão do marcador semelhante pluripotência das células mantidas em LIF. Tabela 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Controle negativo </td><td> LIF Controle Positivo </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1 Passagem </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td></tr><tr><td> Passagem 2 </td><td> Alguns morfologia diferenciada </td><td> E normaisS morfologia celular </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td></tr><tr><td> Passage 3 </td><td> Maioria das células diferenciadas </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td></tr><tr><td> Passagem 4 </td><td> Não colônias ESC </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morte celular observado </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td></tr><tr><td> Passagem 5 </td><td> diferenciado </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morte celular observado </td><td> Morfologia das células normais ES </td><td> Morfologia das células normais ES </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Os autores deste artigo são empregados por Stemgent que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

O SC1 pequena molécula pode ser usada para manter a auto-renovação, com um estado indiferenciado em células ES mouse. Antes de usar em uma linhagem de células não testados, no entanto, deve ser titulada para determinar a concentração ideal. Por exemplo, testamos três concentrações no ES célula do rato linha ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrações foram capazes de sustentar as células ES mouse, no entanto, uma concentração de 1 mM era tóxico. SC1 também pode ser usado sob alimentação livre de condições.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Sox2</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo Oct4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

o uso de sc1 (pluripotin) para suporte mesc auto-renovação na ausência de lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Rato-tronco embrionárias (ES), as células são convencionalmente cultivados com fator inibitório de leucemia (LIF) para manter a auto-renovação.<sup&gt; 1</sup&gt; No entanto, LIF é caro e ativação da via LIF/JAK/STAT3 não é absolutamente necessário para manter o estado auto-renovação.<sup&gt; 2</sup&gt; A molécula SC1 pequena pode ser uma alternativa econômica para LIF. SC1 funções através da inibição dual de Ras-GAP e ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Ilustração de seu mecanismo de ação faz com que seja uma ferramenta útil para estudar o mecanismo molecular fundamental de auto-renovação. Aqui nós demonstrar o procedimento para a cultura de células ES mouse na presença de SC1 e mostrar que eles são capazes de manter a auto-renovação, na ausência de LIF. Células cultivadas com SC1 apresentaram morfologia similar ao mantido com células LIF. Ambos exibiram morfologia ES típico do mouse depois de cinco passagens. Expressão de marcadores de pluripotência típico (Oct4, Sox2, Nanog e SSEA1) foi observada após cinco passagens na presença de SC1. Além disso, SC1 não causou toxicidade evidente nas células ES mouse.

SC1 funções através da inibição dual de Ras-GAP e ERK1. Testamos a função de SC1 no apoio célula do rato ES auto-renovação, na ausência de LIF e mostrou que SC1 é capaz de manter a auto-renovação de culturas de células de rato ES.

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

As células-tronco embrionárias (CTE) de camundongo são convencionalmente cultivadas com o fator inibidor de leucemia (LIF) para manter a autorrenovação.1 No entanto, o LIF é caro e ...

Olá, sou Sarah NAU do Laboratório STEM Gen em Boston. Hoje vamos mostrar um procedimento para manter a autorrenovação de células-tronco embrionárias de camundongo na presença da molécula pequena C um camundongo. As células-tronco embrionárias normalmente são cultivadas na presença do fator inibidor de leucemia para manter a autorrenovação.L, no entanto, é caro. Por isso, aqui forneceremos uma alternativa econômica, a molécula pequena SC one. Na última parte do vídeo, mostraremos uma comparação da expressão de marcadores de pluripotência entre células cultivadas em L e aquelas cultivadas em SC one.Então vamos começar. Um dia antes de cultivar as células-tronco embrionárias, descongele um frasco de células alimentadoras irradiadas. Plaque as células alimentadoras numa densidade de 10.000 células por poço.Em uma placa de 12 poços, incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, plaque as células ES na camada de alimentadores MEF, semando as células com uma densidade de 50.000 células por poço nas placas de alimentadores preparadas, em meio de crescimento suplementado com SC1 na concentração desejada — utilizamos 100 nanomolares, 300 nanomolares e 1 micromolar.Como controle, adicionamos um poço que foi suplementado com 1000 microgramas por mililitro de LIF. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, troque o meio para o cultivo contínuo. Renove o meio a cada 48 horas, repicando as células na proporção de uma para cada 10, a cada três ou quatro dias, para manter uma densidade semelhante à densidade inicial de semeadura. Após cinco repiques, podemos agora verificar a expressão de marcadores típicos de pluripotência utilizando imunoquímica para iniciar a imunoquímica de células-tronco.Inicie lavando as células suavemente três vezes com PBS. Fixe as células com 500 microlitros de paraformaldeído 4% por 20 minutos à temperatura ambiente. Após lavar as células em PBS mais três vezes, bloquee a ligação não específica com 500 microlitros de tampão bloqueador por uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 250 microlitros do anticorpo primário às células e deixe incubarem a quatro graus Celsius durante a noite. Neste experimento, estamos incubando com os anticorpos nano SOX dois, SSEA um e OCT quatro. Após outra série de lavagens, incube as células com 250 microlitros do anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente por duas horas à temperatura ambiente, mantendo-as protegidas da luz, e lave as células pela última vez, adicionando DAPI numa concentração final de um micrograma por mililitro à última lavagem.Em seguida, incubar as células por cinco minutos para corar os núcleos. Por fim, analisar as células ao microscópio fluorescente. São mostradas aqui imagens de contraste de fase de células ES de camundongo cultivadas sobre células alimentadoras na presença de LIF ou SC1 para manter a autorrenovação em um estado indiferenciado.Aqui, são mostradas células ES de camundongo, que foram mantidas por cinco passagens. As células foram fixadas e examinadas por imunocitoquímica para SSEA-1, OCT-4, Nanog e SOX-2. A expressão dos marcadores para células mantidas em C1 foi semelhante àquela das células mantidas em LIF.Acabamos de mostrar como usar a molécula de pequeno porte SC one para manter a autorrenovação em células-tronco embrionárias de camundongo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o SC one deve ser titulado para determinar a concentração ideal antes de ser usado em uma linhagem celular não testada. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

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Aprenda a usar SC1 para manter a auto-renovação de células-tronco embrionárias de camundongo sem LIF. Este método oferece uma alternativa econômica para cultivo celular em laboratório.

O uso de SC1 (Pluripotin) para Suporte MESC auto-renovação na ausência de LIF

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