Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Olá, sou Leah Kent da STEM Gen. Hoje vamos mostrar como descongelar e congelar células-tronco embrionárias humanas. Então, vamos começar.

Para descongelar células-tronco embrionárias humanas, um frasco criogênico é retirado do nitrogênio líquido e descongelado rapidamente. Em um banho-maria a 37 graus Celsius, a suspensão celular é transferida do frasco criogênico para um tubo cônico, diluída com meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas e centrifugada. Para formar um pequeno pellet celular, o sobrenadante é então removido e o pellet celular é ressuspenso com meio fresco de cultura de células-tronco embrionárias humanas no tubo antes de ser semeado em um poço de uma placa de cultura celular de seis poços previamente revestida com uma camada de células alimentadoras de metano irradiadas.

No dia anterior ao descongelamento das células ES humanas, plaque uma camada de sustentação de fibroblastos embrionários de camundongo irradiados, ou mes, em meio de cultura meth. Adicione meio em um poço de uma placa de cultura tecidual de seis poços revestida com gelatina. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para garantir um descongelamento eficiente e bem-sucedido, certifique-se de ter todos os equipamentos e reagentes necessários prontos. Antes de retirar o ESL humano do nitrogênio líquido. Usando pinças metálicas, retire um frasco criogênico de ESL humano do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.

Rolando o frasco entre as mãos com luvas por três a cinco segundos. Para remover a geada, anote as informações no rótulo do frasco usando pinça de metal. Mergulhe o frasco em um banho-maria a 37 graus Celsius.

Agite suavemente o frasco e observe com frequência, mas rapidamente, o progresso do descongelamento segurando o frasco contra a luz. Para verificar o tamanho do cristal de gelo. Não mergulhe a tampa do frasco no banho-maria, pois isso poderia contaminar as células.

Quando restar apenas um pequeno cristal de gelo, submergir o frasco em etanol para esterilizá-lo em uma cabine de segurança biológica estéril e transferir o conteúdo do frasco criogênico diretamente para o fundo de um tubo cônico de 15 mililitros. Adicionar lentamente quatro mililitros de meio de cultura de células-tronco humanas ao tubo.

Balançe suavemente o tubo para misturar continuamente as células enquanto o novo meio é adicionado ao tubo. Centrifugue as células E humanas por cinco minutos a 200 Gs enquanto as células estiverem na centrífuga. Retire a placa de alimentadores de metano previamente preparada do incubador a 37 graus Celsius e rotule-a com as informações apropriadas da ESL humana, como linhagem celular, número de passagem e data de descongelamento.

Aspire o meio de cultura de MEF e adicione um mililitro de PBS ao poço. Retorne o pellet de E ESL humano para a cabine de segurança biológica e aspire cuidadosamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não aspirar o pellet celular, mas remova o máximo possível do sobrenadante, pois esta solução contém DMSO do meio de congelamento.Resus.

Suspenda suavemente o pellet adicionando 2,5 mililitros de meio de cultura humano ESL. Usando uma pipeta de vidro de cinco mililitros e pipetando de três a quatro vezes, aspire o PBS do alimento MEF. Adicione cuidadosa e lentamente todos os 2,5 mililitros da suspensão de células-tronco humanas ao poço preparado da placa de seis poços.

Coloque a placa no incubador a 37 graus Celsius e deslize-a cuidadosamente para frente e para trás, e de lado a lado, para distribuir uniformemente as células por todo o poço. Para evitar concentrar as colônias no centro. Não agite a placa em um padrão circular.

Deixe as células aderirem a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite, no dia seguinte ao descongelamento. Remova o meio com quaisquer células flutuantes e adicione 2,5 mililitros de meio fresco de cultura de células-tronco humanas ao poço.

Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite e continue o cultivo até que as colônias estejam prontas para serem repassadas. O protocolo de congelamento de células-tronco embrionárias humanas começa com colônias de células-tronco embrionárias humanas de tamanho médio e saudáveis cultivadas em uma placa de seis poços. Após a incubação do cultivo com a enzima colagenase IV, as colônias são raspadas com uma pipeta de vidro de cinco mililitros, coletadas em um tubo cônico e centrifugadas para formar um pellet celular solto.

Após aspirar o sobrenatante, o pellet celular é ressuspendido. Primeiro com meio de cultura de células-tronco humanas e depois diluído com dois x meio de criopreservação. As células são distribuídas uniformemente em alíquotas de um mililitro e congeladas em frascos criogênicos.

Enquanto as células estão na centrífuga, rotule os frascos criogênicos dentro da cabine de segurança com o número de passagem da linhagem celular e a data de congelamento. A densidade típica para o congelamento de células E es humanas é um poço de células de uma placa de seis poços por frasco criogênico. Quando as células ESL humanas tiverem sido centrifugadas, leve o tubo de volta para a cabine de segurança biológica.

Aspire o sobrenatante do tubo. Tendo cuidado para não perturbar o pellet celular solto, ressuspenda o pellet celular com a quantidade apropriada de cultura humana ESL.

Adicione 0,5 mililitros de cultura de ESL humano. Meio por frasco criogênico. Seja muito cuidadoso ao pipetar, pois as células-tronco embrionárias humanas se recuperam melhor quando congeladas em fragmentos de colônia relativamente grandes; lentamente e agitando suavemente o tubo, adicione a quantidade apropriada do meio de congelamento para células-tronco embrionárias humanas 2x às células.

Uma vez que o meio de congelação é adicionado, misture-o pipetando a solução extremamente suavemente, uma a duas vezes rapidamente, mas adicione cuidadosamente um mililitro da suspensão celular a cada tubo criogênico. Transfira os tubos para um recipiente de congelação com isopropanol e coloque no congelador a menos 80 graus Celsius durante a noite. As células congelarão a uma taxa de um grau Celsius por minuto no recipiente de congelação com isopropanol no dia seguinte.

Transfira rapidamente os frascos congelados para um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido usando pinças metálicas. No primeiro dia após as células-tronco humanas serem pensadas, as colônias pequenas podem parecer transparentes e podem ser difíceis de visualizar ao microscópio. Como foram recentemente pensadas, as células-tronco embrionárias humanas tendem a proliferar de forma relativamente lenta.

Eles podem levar alguns dias em cultura para aparecer como colônias estabelecidas. Acabamos de mostrar como descongelar e congelar culturas de células-tronco embrionárias humanas. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.