Name: Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda métodos cirúrgicos para estudar a regeneração do barbilhão maxilar em Danio rerio. Este protocolo demonstra amputação, coleta de espécimes e preparação histológica para análise morfológica detalhada.

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Estes métodos foram desenvolvidos por EEL durante uma licença de pesquisa no laboratório de Apoio JT foi fornecido pela Universidade DePaul Research Council e um NIH / NIDCR R01 conceder ao JT (DE016678). Agradecemos os esforços de Hunter Caroline, técnico de cuidados de animais nas instalações do núcleo zebrafish CMRC e Pawluczuk Paulina, a nossa assistente de laboratório de graduação.

Zebrafish criação Peixe-zebra são alojados e criados de acordo com métodos padronizados 1. Passado o período tardio larval, o estágio de desenvolvimento de um peixe-zebra pode ser medido pelo seu comprimento padrão (SL), ou a distância em linha reta em milímetros do ponto anteriormost do lábio superior para a base da nadadeira caudal (placa hypural posteriormost) 2. Em aproximadamente um mês após a fertilização (10-12 mm SL), o barbos nasal e maxilar aparecer como transparente brotos epiteliais perto do pits olfativa e nos cantos posterior da maxila, respectivamente. Como o peixe-zebra amadurece, a estender-se barbos estreito, whisker-como apêndices. Porque o barbo maxilar é maior (2-3 mm) e mais fácil de manipular, nosso protocolo aplica-se somente a este apêndice particular; técnicas semelhantes, no entanto, poderia ser adaptada para o menor nasal barbos. Clipping Barbel <ol><li> Anestesiar zebrafish adulto na fase desejada (por exemplo., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 meses pós-fertilização) por imersão em 0,015% MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato) tamponada a 7,0 pH em água do sistema. Observe os movimentos até parar de nadar e ventilação branquial torna-se lenta e regular. Dependendo do tamanho do peixe, anestesia completa demora cerca de 05/02 minutos. </li><li> Usando um arrastão aquário, peixes de transferência de 1-3 em um momento de um pedaço dobrado de papel toalha molhada em uma placa de Petri. Usando uma espátula sem corte, orientar o peixe assim que são paralelos uns aos outro lado e lateral esquerdo para cima. Parte dobra da toalha de papel molhado sobre a parte caudal do peixe, cobrindo todo o corpo até o opérculo (guelra cobre) para manter a pele e as guelras úmidas durante o procedimento. </li><li> Ver a placa de Petri sob estereomicroscópio, utilizando-se de baixo ângulo de luz incidente para iluminar a região da cabeça. Foco na base do barbo maxilar esquerdo, que se projeta a partir do canto posterior ventral da maxila (Fig. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. </li><li> Firmemente segure o eixo do barbo ligeiramente para a extremidade distal da maxila. Elevar o eixo barbo e inserir as mandíbulas de uma tesoura de ponta fina de primavera apenas proximal ao fórceps. A tesoura pode ser tocado com a pinça para a estabilidade. Deslize as mandíbulas da tesoura ao longo do eixo do barbo até que a ponta se aproxima da borda da maxila. Fechar a tesoura para cortar através do eixo barbos. O barbo amputada, ainda agarrado na pinça, pode ser removido para a fixação ou observação posterior. </li><li> Transferir imediatamente o peixe para um pequeno tanque de água sistema limpo (~ 500 mL) contendo uma gota de azul de metileno para controlar a infecção fúngica superficial. Permitir que o peixe se recuperar durante a noite. Na manhã seguinte, devolver o peixe para o sistema de criação. Barbel regeneração é máxima após 2 semanas. </li></ol> Incorporação de Agar Pares Barbel <ol><li> Coletar peixes pela técnica apropriada a eutanásia e fixar em um tubo de 50 mL de paraformaldeído 4% tampão fosfato (PBS) com agitação a 4 ° C durante a noite. O volume de fixador deve ser pelo menos dez vezes o volume do tecido. Após a fixação, descarte de resíduos paraformaldeído em um recipiente aprovado e lavar o tecido completamente em diversas mudanças de PBS. </li><li> Prepare em um mL de vidro 250 ml frasco 150 de 2% agarose (T m ~ 37 ° C) em água destilada. Calor com um microondas ou chapa quente, agitando periodicamente até que esteja completamente dissolvido. Equilibrar a solução fundida em um banho de água 50-60 ° C. </li><li> Montar um equipamento de eletroforese em gel padrão, colocando um molde de gel vedado pequena (10 x 10 cm; ~ 100 mL de volume gel) firmemente contra os lados da câmara de buffer. Adicionar 2-4 pequena amostra pentes de dentes (4 x 1,5 mm). </li><li> Sobre uma superfície plana, coloque a agarose derretida no molde para cobrir apenas a base dos favos, formando poços muito superficial. Imediatamente coloque a agarose sobra volta para o banho de água morna, que será usado posteriormente para incorporar o tecido (Passos 9-12). Coloque um copo longo Pasteur pipeta no frasco para manter a pipeta para a mesma temperatura que a agarose. </li><li> Permita que o gel para endurecer por 20-30 minutos. Remover os favos, em seguida, retire o molde gel contendo o gel endurecido da câmara de buffer. Firmemente a fita lados abertos do molde gel com fita de laboratório para que o gel não deslize para fora. Esta fita deve se estender vários milímetros sobre a superfície do agarose para que agarose adicionais podem ser adicionados mais tarde (Passo 13). </li><li> Posicione o molde de gel no palco de um estereomicroscópio. Ampliar um poço vazio e trazer as bordas em foco. </li><li> Sobre a superfície do agarose ao lado do bem, pipetar uma gota de água ou tampão contendo os espécimes fixos barbo (por exemplo, regenerar, e controle). Using dobrados pinos de insetos, arraste as amostras úmidas para dentro do poço e empurrá-los para o fundo. Orientar o barbo eixos paralelos um ao outro e alinhados contra oposto bordas longas do poço. Tensão superficial vai ajudar a segurar o tecido na posição. </li><li> Quando estiver pronto para incorporar, use uma ponteira fina ou o canto de um tecido de laboratório para remover o excesso de fluido do poço. Trabalhar rapidamente para não deixar o tecido secar. </li><li> Usando a pipeta Pasteur de vidro aquecido, gentilmente pipeta fresco agarose derretida e em torno da espécimes para selar o tecido barbo no lugar. Não encha demais. Antes da agarose endurece, fazer adaptações de última hora com os pinos de insetos. </li><li> Coloque uma etiqueta numerada exemplar de papel ao lado do bem e prenda-o com uma pequena gota de agarose. </li><li> Repita os passos 6 a 10 para cada poço de espécimes. </li><li> Se desejar para a calibração da imagem, inserir um pedaço de papel com uma escala micrométrica impressos (por exemplo, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) no fundo de um poço vazio. Achatar o papel para o fundo do poço e cobri-lo com agarose quente. </li><li> Depois de todos os espécimes são incorporados, a superfície do gel será irregular, com gotas de agarose endurecido. Coloque o gel sobre uma superfície plana e gentilmente despeje adicionais agarose derretida até a superfície superior é uniforme. Use a menor quantidade de agarose necessário para obter uma superfície lisa; muito agarose vai obscura de luz de transmissão fotografia. Permitir que esta camada superior para endurecer. </li><li> O gel pode agora ser fotografado no palco de um estereomicroscópio para registrar morfologia bruta para cada par de barbo. Calibração da imagem é obtida por fotografar a escala micrométrica incorporado. </li><li> O gel inteiro pode ser armazenado envolto em toalhas de papel molhado e selado em um saco plástico a 4 ° por várias semanas. </li><li> Para posterior análise, blocos de ágar contendo par casado de barbos podem ser cortadas do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha e processados ​​para exame histológico de parafina ou cryosectioning por métodos padrão 3,4. Alternativamente, barbos individuais podem ser dissecados fora da agarose com agulhas finas, lavadas em água, e processados ​​para outras aplicações a jusante (por exemplo, imuno-histoquímica todo-mount ou microscopia confocal). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

O peixe-zebra maxilar barbo é um sistema de tecido subutilizados para estudar o crescimento, manutenção e regeneração de vários tipos de células no zebrafish. Embora o apêndice barbel não tem analógico humanos, os tipos de células que contém são altamente conservadas, tornando possível o estudo da pele, glândulas, vasos melanócitos, circulatório e os nervos em uma estrutura opticamente clara e anatomicamente simples cilíndrico. Semelhante ao fin bem estudado caudal, tecido barbel podem ser induzidas a regenerar pela amputação. Usando a fronteira da maxila como um marco anatômico, o plano de amputação pode ser colocado com precisão, facilitando a medição de barbo rebrota. Para um operador experiente, cada cirurgia leva apenas alguns segundos. A recuperação é rápida, e nós temos até agora não detectaram efeitos a curto ou a longo prazo sobre o comportamento dos peixes. Peixe-zebra com um mergulho barbel maxilar, comer e raça de forma tão eficaz como controles não-cirúrgico, e têm a sobrevivência comparável ao momento da coleta de tecido, até 6 meses após a cirurgia. O impacto fisiológico da cirurgia prevista para ser mínimo, porque 1) o paladar extraoral transportados no barbo também são encontrados em muitas outras partes do epitélio de peixes, incluindo lábios, bochechas e cabeça 5, e 2) papilas gustativas diferenciar aparecem no o barbo regeneração dentro de 72 horas (LeClair et al., dados não publicados). Isso torna o barbo maxilar um sistema minimamente invasivo para estudar a cicatrização de feridas, a revascularização e reinervação no contexto de um vertebrado adulto. Após a indução cirúrgica de regeneração, barbos podem ser coletados em intervalos de medição morfométricas e / ou análise microscópica do tecido fixo. Convenientemente, o barbo maxilar é aproximadamente o comprimento (2-3 mm) e diâmetro (100-200 mm) de um embrião de peixe-zebra, facilitando a aplicação de muitos protocolos padrão, incluindo histologia de parafina, cryosectioning, todo-mount imuno-histoquímica, e in situ hibridização. Em conjunto, estas características tornam o barbo maxilar altamente viável em modelo in vivo para estudar reparo e regeneração tecidual.

Equipamentos microscópio Um microscópio estéreo dissecando com transmitida e iluminação incidente de fibra óptica é necessário para barbel clipping e incorporação de agar. Clipping Barbel <ul><li> Água do sistema de peixe </li><li> 2 tanques de peixe-zebra cruzamento </li><li> MS-222 (3-aminobenzoato de etilo metanossulfonato; Sigma Chemical # E10521-10G) </li><li> estéril de 120 mm placa de Petri </li><li> toalhas de papel molhado </li><li> espátula de metal sem corte </li><li> Dumont # 55 Bio Inox Pinça (Ferramentas Ciência Belas # 11255-20) </li><li> Mini-Vannas primavera tesouras (Ferramentas Ciência Belas # 15000-00) </li><li> metileno agente antifúngico azul (Drs. Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> pequeno aquário fishnet </li></ul> Coleta de tecido e incorporação de agar <ul><li> 4% paraformaldeído em 1x tampão fosfato (PBS-PF), até aliquotado em tubos cônicos de 50 mL e armazenadas congeladas a -20 ° C use </li><li> 1x tampão fosfato (pH 7,27-6) </li><li> 250 mL frasco de vidro </li><li> Agarose 2% em água destilada </li><li> padrão pequena plataforma eletroforese em gel de agarose (gel tamanho = ~ 10 cm quadrado) </li><li> pequeno pente de dentes amostra de eletroforese (tamanho pente 4 x 1,5 mm) </li><li> banho de água morna (50-60 ° C) </li><li> fita de laboratório </li><li> preto esmaltado pinos de insetos, o tamanho 000 (Ferramentas Ciência Belas # 26000-25) </li><li> 02/01 retentores de pinos (ferramentas de Ciência Belas # 26016-12) </li><li> De 9 polegadas de vidro Pasteur pipeta </li><li> pipeta lâmpada ou bomba </li><li> tecidos de laboratório </li><li> pequenas etiquetas de papel </li><li> (Opcional) escala de calibração impressa </li><li> toalhas de papel molhado </li><li> zip encerramento saco plástico </li><li> bisturi / lâmina de barbear (para cortar blocos de agar) </li></ul>

métodos para o estudo do maxilar zebrafish barbel

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbos são apêndices sensoriais da pele encontrados em peixes, répteis e anfíbios. O peixe-zebra, Danio rerio, desenvolve dois pares de barbos-um par de curto nasal e um par mais maxilar. Barbel tecido contém células de origem ectodérmica, mesodérmica e origem da crista neural, incluindo as células da pele, glândulas, papilas gustativas, os melanócitos, vasos circulatórios e nervos sensoriais. Diferentemente da maioria dos tecidos adultos, o barbo maxilar é opticamente clara, o que nos permite visualizar o desenvolvimento ea manutenção destes tipos de tecidos em todo o ciclo de vida. Este vídeo mostra o desenvolvimento inicial do barbo maxilar (início cerca de um mês pós-fertilização) e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração no apêndice adultos (&gt; 3 meses pós-fertilização). Resumidamente, o barbo maxilar esquerdo de um peixe é elevado anestesiados com pinças esterilizadas imediatamente distal à borda caudal da maxila. Uma multa, tesoura primavera estéril é posicionado contra a pinça para cortar o eixo do barbo, a este nível, estabelecendo um marco anatômico para o plano de amputação. Crescimento regenerativa pode ser medida com relação a este plano, e em comparação com o barbo contralateral. Barbel tecido se regenera rapidamente, atingindo regrowth máxima dentro de 2 semanas da lesão. Técnicas de análise do barbo regeneradas incluem dissecar e incorporação de pares de barbos (regenerar e controle) nos poços de um gel de eletroforese de DNA padrão. Espécimes incorporados são convenientemente fotografados em um estereomicroscópio para a morfologia e morfometria bruta, e pode ser armazenado durante semanas antes de aplicações a jusante como histologia parafina, cryosectioning, e / ou imuno-histoquímica montar todo. Estes métodos estabelecer o barbo maxilar como um romance no sistema de tecido vivo para estudar a capacidade de regeneração dos vários tipos de células dentro do contexto genético de peixe-zebra.

O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Os barbilhões são apêndices sensoriais cutâneos encontrados em peixes, répteis e anfíbios. O peixe-zebra, Danio rerio, desenvolve dois pares de barbilhões: um nasal curto...

Os órgãos de marbres são uma coleção heterogênea de estruturas sensoriais encontradas em anfíbios, répteis e peixes. O peixe-zebra desenvolve dois pares de marbres, um par nasal menor e um par maxilar maior. Esses apêndices transparentes podem ser utilizados para estudar o desenvolvimento, a manutenção e a regeneração de diversos tipos celulares do peixe-zebra.Este vídeo apresenta o desenvolvimento do mármore maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração. As barbatanas são coletadas alguns dias ou semanas depois, seguidas pela dissecação e inclusão de regenerados e controles. Olá, sou Elizabeth LeClair do Laboratório LeClair na Universidade DePaul, e sou Ya Chesky da Escola de Medicina Feinberg da Universidade Northwestern e do Centro de Pesquisa do Hospital Infantil.Hoje vamos mostrar alguns procedimentos para estudar o mármor maxilar do peixe-zebra. Utilizamos esses procedimentos para estudar o crescimento e o desenvolvimento do mármor do peixe-zebra. Então, vamos começar.Em aproximadamente 30 a 40 dias após a fertilização, o barbilhão maxilar surge como uma gema epitelial transparente próxima ao canto ventral posterior da maxila. À medida que o peixe-zebra amadurece, o barbilhão se alonga formando um apêndice estreito semelhante a um bigode, com vários milímetros de comprimento. O barbilhão maduro contém diversos tipos celulares importantes, incluindo células pigmentares, células glandulares, botões gustativos, vasos circulatórios e nervos mielinizados.O melhor de tudo é que o barbelo é transparente em todas as fases do seu desenvolvimento. Como outros órgãos do peixe-zebra, o barbelo maxilar pode se regenerar após amputação proximal. Nesta seção, demonstramos um procedimento para cortar o barbelo na base da maxila.Isso também poderia ser chamado de ectomia unilateral. No dia da cirurgia, prepare dois pequenos tanques com água para peixes, um para anestesia e outro para recuperação. O tanque de anestesia contém trica a 0,015% tamponada a pH 7,0.No recipiente de recuperação com água para peixes, há peixes, água e uma gota de azul de metileno para controlar infecções fúngicas. Anestesie um a três peixes-zebra adultos por imersão no recipiente com trica, observando até que os movimentos de natação cessem e a ventilação branquial torne-se lenta e regular. Dependendo do tamanho dos peixes, a anestesia completa pode levar de dois a cinco minutos.Use uma rede de aquário para transferir os peixes para um pedaço de papel toalha úmido em uma placa de Petri. Com uma espátula romba, posicione os peixes de modo que fiquem paralelos entre si. Com o lado lateral esquerdo voltado para cima, dobre parte do papel toalha sobre os peixes para mantê-los úmidos.Em seguida, observe a placa de Petri ao microscópio estereoscópico utilizando luz incidente em baixo ângulo para iluminar a cabeça. Foque na base do mármulo maxilar esquerdo usando pinça fina. Segure firmemente o eixo do mármulo ligeiramente distal ao limite da maxila.Levante o mármor e insira uma tesoura de ponta fina com mola logo proximal às pinças para garantir estabilidade. A tesoura pode tocar as pinças ou, alternativamente, o fundo da placa de Petri. Deslize as lâminas da tesoura ao longo do eixo do mármor até que a borda de corte se aproxime da borda da maxila.Corte o eixo de mármore e remova o mármore amputado. Esse tecido pode ser fixado e analisado separadamente. Após a cirurgia, transfira o peixe para o tanque de recuperação.Deixe o peixe se recuperar por várias horas até a noite e devolva o peixe ao sistema de criação. Aguarde uma a duas semanas para que ocorra a regeneração das barbatanas. Na próxima seção, mostraremos como preparar o tecido fixado de peixe para análise.Este procedimento começa com mármores que foram coletados e fixados dias, semanas ou meses após a cirurgia. Lave o tecido fixado em uma solução salina tamponada e dissecione o mármore regenerado do lado esquerdo da cabeça. Não se esqueça da barba direita, que serve como controle para armazenamento temporário.Pipete cada par correspondente de bolinhas em uma gota de solução salina sobre uma placa de Petri. Cubra com a tampa e deixe sobre a bancada enquanto você sai. Prepare o gel aquecendo 150 mililitros de ágar a 2% até dissolução completa.Equilibre a solução em banho-maria a 50 a 60 graus Celsius. Em seguida, monte um equipamento padrão de eletroforese em gel e adicione de um a quatro dentes pequenos às amostras. Despeje o agarose derretido no molde do gel sobre uma superfície nivelada, adicionando apenas o suficiente para formar poços bem rasos.Retorne imediatamente os aros remanescentes para o banho de água morna. Insira uma pipeta de vidro longa de Pasteur de modo que a pipeta atinja a mesma temperatura dos aros. Após o gel esfriar, remova os pentes e, em seguida, o molde do gel.Para fixar firmemente o gel, use fita laboratorial de sua cor favorita para prender ambos os lados. A fita deve se estender vários milímetros acima da superfície dos aros, para que agarose adicional possa ser adicionada posteriormente. Posicione o molde do gel sobre a platina de um microscópio estereoscópico. Amplie um poço vazio e foque suas bordas.Pipete as bolinhas do recipiente de Petri para a superfície do gel adjacente ao poço usando alças equipadas com pinos de inseto curvados. Arraste as bolinhas para dentro do poço e empurre-as até o fundo. Alinhe as halteres paralelamente umas às outras e junto às bordas longas do poço. Antes da incorporação, use uma pipeta fina ou papel de laboratório para remover o excesso de fluido.Usando a pipeta de vidro aquecida, adicione cuidadosamente ágar fresco e fundido ao redor do tecido. Faça ajustes finais antes que o ágar endureça e não encha em excesso o poço. Registre o número do espécime adicionando um pequeno pedaço de papel numerado próximo ao poço.Após todos os espécimes estarem embutidos, alise a superfície superior do gel ao derramar uma camada fina de aros sobre o topo. Use a menor quantidade possível para que o gel permaneça transparente para a fotografia. Uma vez que o gel tenha endurecido, ele pode ser fotografado sob um microscópio estereoscópico para registrar o tamanho e a forma de cada par de bolinhas e coletar medidas morfométricas para análises posteriores.Blocos de ágar contendo pares correspondentes de bolinhas podem ser cortados do gel com uma lâmina de bisturi ou navalha. Esses blocos podem então ser processados para histologia em parafina ou criosecção por métodos padrão. Alternativamente, bolinhas individuais podem ser dissecadas do ágar com agulhas finas lavadas em água e, em seguida, processadas para outras aplicações posteriores, como imunohistoquímica em montagem inteira ou microscopia confocal.Por fim, o gel inteiro pode ser selado em um saco e armazenado sob refrigeração. Os espécimes permanecerão conservados por várias semanas. Acabamos de mostrar como observar e analisar o barbilho maxilar em desenvolvimento e em regeneração.É um sistema novo em peixe-zebra, então há muito a ser descoberto. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

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