Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ

Ao combinar hibridização in situ e coloração tetra em uma técnica conhecida como ISTH, os números relativos e as relações espaciais entre as células efetoras imunes específicas do antígeno viral e as células e tecidos infectados por vírus podem ser determinados. O ISTH começa incorporando tecido fresco infectado por SIV em agros. O tecido é cortado em seções de 200 mícrons de espessura usando um vibrato e corado para antígeno viral.

CD específico oito células positivas usando tetrâmeros MHC marcados com fit C. Após o congelamento, essas seções de coloração são cortadas em seções de oito micrômetros de espessura usando um criostato e a hibridização in situ é realizada para localizar células infectadas por vírus. A microscopia confocal é usada para obter imagens das seções de coloração dupla e, finalmente, reconstruir as seções espessas originais para revelar a relação entre o efetor imunológico e as células-alvo.

O uso desse procedimento para examinar a infecção precoce por SIV provou ser um bom preditor para a gravidade da doença resultante. Olá, sou Chinen Lee, da árvore de laboratório de Ashley HA no Departamento de Microbiologia da Universidade de Minnesota. Sou Pam Skinner, professora assistente do Departamento de Ciências Biomédicas Veterinárias da Universidade de Minnesota.

Hoje mostraremos um procedimento para dentro do instituto hibridização ou ISTH para abreviar. Além de usar a coloração de incitério combinada com a hibridização de inci, como estamos demonstrando hoje, também usamos rotineiramente a coloração de incitério combinada com imuno-histoquímica para determinar a localização, abundância e perfil de expressão de proteína de células T CD oito específicas do antígeno in situ u. Ajudando-nos hoje com a coloração in situ com as seções grossas estarão o Dr.Heon Kim e Terry Matala e nos ajudando com uma preparação de seção fina e a hibridização in situ será Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, resfrie o banho Vibram contendo PBSH estéril a zero a dois graus Celsius. Defina o ângulo da lâmina do vibrador para 27 graus. Sempre que possível, mantenha os tecidos frescos resfriados no gelo e inicie o procedimento dentro de 24 horas após a coleta dos tecidos.

A fim de minimizar o resfriamento da degradação, o vibram também facilita o corte de um tecido fresco, corte o tecido conjuntivo e corte a amostra com bisturi em pequenos pedaços e coloque os pedaços em um barco de soro de leite e cubra com 4% de baixo derretimento. Agros em PBS derreteu a cerca de 40 graus Celsius. Certifique-se de que o tecido esteja em contato com o fundo do prato e empurre os pedaços de tecido para baixo se eles flutuarem, solidifique no gelo por três a cinco minutos.

Aqui o tecido do baço está sendo usado, mas o linfonodo, a vagina, o colo do útero, o útero ou outros tecidos frescos também podem ser usados com um bisturi. Corte o agros ao redor do tecido e, usando uma pinça, transfira cuidadosamente o tecido embutido no agros para o bloco de tecido. Continue revestindo um bloco de tecido Vibram com cola Loctite.

Não mova o pedaço de tecido depois de colocado no bloco de tecido. Deixe secar por cerca de 10 minutos no gelo. Em seguida, monte o bloco de tecido no vibrador e corte o tecido em seções de 200 micrômetros de espessura usando uma velocidade de avanço lenta e amplitude relativamente alta.

Use um pincel para transferir as seções cortadas para uma câmara de tecido especializada colocada no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços pré-preenchida com um mililitro de PBSH resfriado. Coloque até quatro seções de tecido em cada câmara de tecido. Rotule as amostras e prenda a tampa na placa com um elástico para corar as seções de tecido para células T específicas virais.

Os tetrâmeros conjugados com ZI são primeiro diluídos em tampão de bloqueio a nwt 0,5 microgramas por mililitro. A solução é pipetada em uma placa de 24 poços a um mililitro por poço. O tecido recém-cortado é transferido para a placa nas câmaras de tecido e pode balançar durante a noite a quatro graus Celsius.

Manter um poço vazio entre as câmaras de tecido contendo amostras diferentes para evitar a contaminação cruzada das soluções nas etapas subsequentes. Nesta etapa, pode-se adicionar anticorpos direcionados contra proteínas extracelulares ou de superfície celular. Para a lavagem, prepare uma placa de cultura de tecidos de 24 poços contendo PBSH resfriado após a incubação primária.

Lavado duas vezes, transferindo as câmaras de tecido para uma placa pré-cheia por 20 minutos de cada vez, certifique-se de drenar a maior parte do líquido das câmaras de tecido antes de transferir. Além disso, não pingue o conteúdo de uma amostra em outra ao mover as câmaras de tecido e monitore as seções nas câmaras de tecido para garantir que elas não fiquem presas nas laterais. Fixe as seções com 4% de paraldeído fresco em PBS por duas horas em temperatura ambiente após a fixação.

Lavado duas vezes com PBSH frio por cinco minutos de cada vez para amplificar o sinal dos tetrâmeros. Incubar as secções com anticorpos anti-fitzy de coelho numa proporção de um para 10 000 em tampão de bloqueio durante um a três dias. Nesta fase, pode-se adicionar anticorpos contra epítopos intracelulares.

Certificando-se de permanenteizar as células e bloquear locais inespecíficos antes da adição do anticorpo. A recuperação do antígeno também pode ser necessária após a segunda longa incubação destinada a amplificar o sinal. Lave as seções em PBSH três vezes por pelo menos 20 minutos e até várias horas de cada vez.

Realize uma incubação final com anticorpos marcados com fluorescência apropriados. Por exemplo, pode-se usar o anti-coelho de cabra SI três para ligar os anticorpos anti-fitzy de coelho para fazer com que as células da coloração do tetrâmero fiquem fluorescentes em vermelho. Se os anticorpos de camundongo foram usados para contracolorir proteínas de interesse, como CD oito, para visualizar células T assassinas, pode-se usar Alexa 488 anti-US de cabra para se ligar aos anticorpos de camundongo e fazer com que as células de coloração de anticorpos fluorescam diluições verdes de cada anticorpo devem ser determinadas empiricamente.

Incube por um a três dias mantenha as seções protegidas da luz, embrulhando as placas e o papel alumínio durante esta incubação e, posteriormente, à medida que a luz extingue a flora cai. Por fim, fixe as seções novamente para prender os tetrâmeros e os anticorpos no lugar. Lave e monte em uma lâmina de microscópio com gelatina de glicerol contendo quatro miligramas por mililitro de galato de perfil N para armazenamento a menos 20 graus Celsius até preparar seções finas para hibridização in-situ.

As seções de coloração de tetrâmero in situ agora podem ser analisadas com um microscópio confocal para determinar a localização, abundância e padrão de expressão proteica de células T CD específicas do antígeno, oito células T positivas na imagem mostrada, seções de tecido do baço de um recesso infectado com SIV meac foi corado com tetrâmeros gag para marcar CD específico para SIV, oito anticorpos de células T positivas, anticorpos CD 20 e CD três. Uma vez que a coloração dos contadores com anticorpos será perdida na próxima etapa. É importante analisar os tetrâmeros in situ antes de prosseguir.

Comece o procedimento de corte fino aquecendo as seções de 200 mícrons de espessura a 70 graus Celsius por cinco minutos em um bloco de calor para separar as seções grossas da lâmina. Depois que as seções forem destacadas, incorpore-as na OCT em gelo seco, preenchendo primeiro a parte inferior do molde de plástico com OCT. Em seguida, coloque o lenço de papel em cima da OCT e cubra-a com OCT.

Use um criostato para cortar seções de oito mícrons de espessura das seções embutidas na OCT e cole as seções de oito mícrons em lâminas siloizadas. As lâminas podem então ser armazenadas a 80 graus Celsius negativos em uma caixa lacrada para hibridização in situ subsequente. A hibridização in situ padrão é usada para detectar células infectadas por vírus por meio de sondas de costelas específicas de vírus marcadas com S 35.

O procedimento também inclui seções de revestimento com emulsão de trilho nuclear e corrediças de montagem. Em um meio primordial compatível com fluorescência, as imagens confocais são adquiridas usando um microscópio confocal BioRad MRC 1000, equipado com um dispositivo de reflexão azul epitubo. A coloração tetra in situ é visualizada usando o EPI one 605 para o tetra fluorocromo vermelho e EPI 2 522 DF 32 para o fluorocromo CD oito verde para hibridização in situ.

Use a reflexão EPI dois azuis para os grãos de prata resultantes do sinal de hibridização in-situ nos autógrafos de rádio desenvolvidos. Para iniciar a aquisição de imagens, adquira as imagens de cada seção da esquerda para a direita e de cima para baixo e certifique-se de capturar cada imagem com uma sobreposição de aproximadamente 20% com as imagens vizinhas. Para evitar lacunas na imagem de montagem reconstruída, nomeie cada imagem de acordo com seu bro e coluna em um arquivo do Excel.

Quando a coleta de dados dos slides estiver concluída, use o software assistente confocal para projetar imagens seriais Z para cada canal em uma única imagem usando um procedimento de ação do Photoshop sete disponível nos autores, mescle automaticamente a imagem projetada dos três canais em uma imagem RGB. Em seguida, junte as imagens mescladas em camadas para gerar uma imagem de montagem de toda a seção. Associe grãos de prata individuais e coloração de tetrâmero com células na montagem usando metamorfose ou Photoshop.

Atribua as coordenadas XY dos centros ou OIDs das células positivas de RNA viral e tetrâmero positivo. Exporte os dados OID para arquivos do Excel como números numéricos para cada célula e use os dados coletados nos arquivos do Excel para determinar as proporções de células efetoras imunes ou e para alvos virais ou células T do número total de células de tetrâmero positivo e RNA positivo viral na seção para capturar as relações espaciais entre células tetrâmero positivo e RNA positivo. Copie e cole seus respectivos gráficos dos arquivos do Excel em um documento do Photoshop no Photoshop.

Diminua a opacidade de uma camada para alinhar e dimensionar as grades para que elas coincidam com a cor, selecione e copie e cole em uma nova camada. As posições das células azuis de RNA positivo descartam a camada usada para alinhar as grades e as posições das células tetrâmero positivo e viral de RNA positivo serão reveladas na imagem achatada. Usando o método ISTH mostrado aqui, somos capazes de acompanhar a resposta imune à infecção por SIV após a inoculação intravaginal neste portal de entrada e nos tecidos linfáticos para os quais a infecção se espalha.

Há um grande número de células infectadas nesses locais de tecido 10 dias após a infecção, mas até três dias depois, há células CD A positivas para coloração verde, mas ainda não. Células tetra positivas específicas para SIV coradas de vermelho. A resposta imune é, portanto, tarde demais para eliminar a infecção.

No entanto, três semanas após a infecção, uma diminuição nas células infectadas é claramente visível, especialmente no portal de entrada. Usamos ISTH para mostrar que a extensão da redução estava correlacionada com a proximidade espacial e o número relativo de células efetoras imunes positivas para tetrâmero. Células-alvo positivas para N-S-I-V-R-N-A, chamamos isso de relação E para T in vivo.

As relações espaciais são prontamente visualizadas usando este método com células efetoras em vermelho e alvos virais em azul neste linfonodo infectado. Muitas células efetoras e alvo estão próximas e há áreas onde muitas células efetoras cercam uma única célula positiva para S-I-V-R-N-A, enquanto em outras áreas uma célula positiva para S-I-V-R-N-A fica sozinha. A proporção de ETT é simplesmente calculada à medida que as posições das células são determinadas e registradas pelos números de cada uma no arquivo Excel.

O melhor controle da infecção viral se correlaciona com um grande excesso de efetores vermelhos sobre alvos verdes de 43 para um. Nesse caso, no colo do útero e na vagina, onde a infecção começou, as relações de TET foram menores nos linfonodos. A correlação positiva entre altas taxas de TET e redução da carga viral do pico indica que uma resposta imune mais robusta no portal de entrada se traduz em melhor controle da infecção.

Acabamos de mostrar como detectar simultaneamente as células CDAT muito específicas e a célula de infecção por vírus in situ. Essa técnica nos permite visualizar simultaneamente células T específicas de antígenos e células infectadas por vírus nos tecidos. Esta técnica pode ser aplicada para avaliar a vacina baseada em células T positivas para CD oito e a outra interação patógeno e hospedeiro sem valor ao fazer este procedimento.

É importante manter todos os RNAs de reagentes livres antes dos insights de hibridização. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.