Name: Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a extrair DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos para estudar comunidades microbianas. Este método permite analisar a diversidade e o potencial metabólico de microrganismos em diferentes horizontes do solo.

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Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Knowledge Development Fund, British Columbia Genoma ea British Columbia Ministério de Florestas e Faixa para apoiar estudos em andamento de produtividade do solo da floresta. SL foi apoiado por uma bolsa da Fundação Centro TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Parte I: Extração de DNA Procedimento 1. 8 horas são necessárias, para o processamento de 6 amostras excluindo quantificação de DNA. Antes de iniciar a extração, você vai precisar de pré-chill morteiro pilão, e espátula em um freezer -20 ° C ou usando nitrogênio líquido. Além disso, pré-chill tubos de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio álcool isoamílico (24:1) no gelo. Definir o forno de hibridação a 65 ° C para pré-aquecer. Verifique solução CTAB, se é cristalizado quente a 60 ° C para derreter os cristais. Completar a solução de desnaturação e tampão de extração, adicionando os ingredientes passada, pouco antes de começar a extração (veja a receita abaixo). Realizar todos os procedimentos de extração em uma capela. 2. Preparar o tampão de desnaturação e tampão de extração. Nota: Para maximizar o rendimento de DNA, é fundamental para fazer precisamente buffers seguir as instruções. 3. Colocar 2 g de solo em uma argamassa pré-refrigeradas. Nota: O solo coletados em campo devem ser congeladas em gelo seco para o transporte e armazenadas a -80 ° C. Descongelar e solo peneira com uma peneira de 2 mm antes da extração do DNA. Você pode aumentar o montante inicial do solo até 10 g. 4. Adicionar 1 ml de solução de desnaturação ao solo. 5. Congelamento e moer o solo em N 2 líquido usando um pilão até que as partículas do solo olhar em pó e homogênea. Repita congelamento e trituração duas vezes. Nota: Mantenha a amostra de solo congelado durante a moagem, utilizando nitrogênio líquido suficiente para cobrir totalmente a amostra de solo. Derretendo ligeira durante a moagem é aceitável. 6. Transferir o solo de terra para um tubo de 50 ml com uma espátula de pré-refrigerados. Nota: A amostra de solo solo podem ser armazenadas a -80 ° C neste momento, se necessário. 7. Adicionar 9 ml de tampão de extração. Para misturar a solução e no solo, brevemente vortex em baixa velocidade. Nota: Para garantir o buffer é homogênea, aquecê-lo a 60 ° C por 10-15 minutos antes de usar. Manter o resto de tampão a 60 ° C em toda a extração. Vortex em velocidade 8 (numa escala onde 10 é o máximo). 8. Incubar por 40 min a 65 ° C em um forno de hibridização. Durante a incubação, os tubos de girar continuamente na velocidade mais baixa, ou inverter cuidadosamente os tubos a cada 10 minutos. Nota: Coloque o tubo horizontalmente em um forno de hibridização para permitir buffer de entrar em contato com o solo sobre uma grande superfície. A solução pode parecer um pouco viscoso durante a incubação. 9. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para a pré-refrigerados tubo de 50 ml contendo 20 ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), manter no gelo. Nota: Quando você transferir o sobrenadante, tome cuidado para não perturbar a camada orgânica (camada inferior). Deixe 1-2 ml de sobrenadante, se for necessário, a fim de coletar somente o sobrenadante limpo. Muitas vezes você pode ver uma camada de bege (mm aproximadamente 1-3 de espessura) em cima do sobrenadante. Não perturbe essa camada ao coletar o sobrenadante. Tente deslizar a ponta ao longo da parede do tubo para impedir a ruptura desta camada bege. Se o sobrenadante é muito turvo, repetir a extração de álcool clorofórmio-isoamílico mais uma vez no sobrenadante. Não use pipetas plásticas descartáveis ​​ao transferir clorofórmio, como clorofórmio irá derreter o plástico. Use uma pipeta de vidro, ou um copo cilindro graduado, ou derramar clorofórmio diretamente em tubos cônicos de 50 ml. 10. Extraia o pelotas do solo mais 2 vezes; 10.1. Adicionar 5 ml tampão de extração para as pelotas do solo, misture delicadamente com 1 ml ponta seguido por vórtex breve em baixa velocidade. Nota: Agite e misture o buffer antes de usar. 10.2. Incubar a 65 ° C por 10 min em forno de hibridização. Centrifugar a 1800 x g, por 10 min a 10-14 ° C. Transfira o sobrenadante para o tubo no passo 9. Manter o tubo com sobrenadante coletado e clorofórmio-álcool isoamílico em gelo durante a extração. Nota: Certifique-se de adicionar o sobrenadante para o tubo mesmo sem cruzar a mistura entre as amostras. 10.3. Repita 9.1 e 9.2 mais uma vez. 11. Usando uma placa rotativa, muito suavemente balance o tubo que contém o sobrenadante (14-19 ml) e clorofórmio-álcool isoamílico em 1,25 rpm por 10 min. Nota: Feche a tampa com muito rigor para evitar fugas. Coloque uma toalha de papel sobre a placa de balanço antes de colocar o tubo de modo que qualquer vazamento pode ser facilmente detectado. 12. Centrifugar a 1800 x g, por 20 min a 10-14 ° C. 13. Transferência de fase aquosa para um novo tubo. Nota: Não perturbar a interfase entre a fase aquosa (camada superior) e camada orgânica (inferiorcamada) quando você transferir o sobrenadante. Deixe aproximadamente 1,5-2 ml sobrenadante para garantir a coleta de apenas sobrenadante limpo. 14. Recuperar o DNA usando álcool isopropílico (15.a etapa - 21.a). Alternativamente, use Amicon ® Ultra-15 Centrífuga Dispositivos Filter (passo 15.b - 21.b) se você esperar muito baixa quantidade de biomassa em sua amostra, que irá produzir pellet dificilmente visível por isopropílico precipitação de álcool que é difícil de recuperar. 15.a. Coloque o sobrenadante para um tubo de ultracentrífuga novo. 16.a. Adicionar álcool isopropílico para o sobrenadante coletado em uma relação de volume de 0.6:1. Inverter os tubos suavemente algumas vezes para misturar. 17.a Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. 18.a. Centrifugar a 16.000 x g, por 20 min a 20-25 ° C. Garantir os pesos de todos os tubos são equilibradas bem antes da etapa de centrifugação. Nota: Mark a direção da força centrífuga sobre o tubo, para que você possa detectar o pellet de DNA com mais facilidade quando o rendimento de DNA é baixa. 19.a. Remover álcool isopropílico por decantação ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de DNA. Nota: Remover álcool isopropílico, logo que a centrifugação seja concluída. Tenha muito cuidado para não perder o pellet de DNA. O tamanho do pellet de DNA pode variar muito, dependendo do tipo de solo, a partir de uma bem visível (~ 9 mm de diâmetro) para apenas visível. É recomendado para remover os resíduos de álcool isopropílico por aspiração ao longo da parede do tubo com cuidado para não sugar o pellet de DNA. 20.a. Seca DNA pellet em temperatura ambiente por 5-20 min. Nota: Não mais seco pellet de DNA, caso contrário, será difícil para dissolver o DNA. 21.A. Ressuspender o sedimento de DNA em 200 mL de TE. Misturá-lo tocando suave. Transferir a solução de DNA em tubo de 1,5 ml. Manter o tubo a 4 ° C durante a noite, a fim de dissolver completamente DNA. Nota: Dependendo do tamanho do pellet, você pode ajustar o volume de TE para adicionar. Geralmente 200-400 mL de TE funciona bem. * Como alternativa, siga os passos 15.b - 21.b. 15.b. Uma pré-lavagem Amicon ® Ultra-15 Centrífuga dispositivos de filtro, adicione 15 ml TE para o dispositivo e centrifugar a 3500 x g, por 10 min. Descartar o escoamento. 16.b. Coloque a solução de DNA a partir do passo 13 para o filtro Amicon pré-lavados. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a 200-500 mL. Descartar o escoamento. 17.b. Lavar o DNA com TE duas vezes; adicionar 10 ml TE aos dispositivos Amicon filtro. Centrifugar a 3500 x g até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 200 mL. Descartar o escoamento. Repita mais uma vez. 18-B Transferir a solução de DNA no filtro para um tubo ml novo 1.5. 19.b. Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon. Lavar ambos os lados da membrana do filtro por pipetagem cima e para baixo a fim de recuperar qualquer resíduo de DNA no filtro. Adicionar esta solução de lavagem para o tubo de 18-B passo 20.b. Se necessário, o DNA pode ser ainda mais concentrada por microcontrolador Ultracel YM-30 ® Unidade Centrífuga Filter; pré-lavagem do filtro, adicionando 200 mL de TE e centrifugação a 10.000 x g por 7 minutos. Adicionar a solução de DNA para o filtro e centrifugar a 5000 x g por 1 min. Repetir a centrifugação até que a quantidade de solução de DNA no filtro reduzido a cerca de 50 ul. Nota: Máximo volume da amostra inicial para microcontrolador filtro é de 500 mL. Não centrifugue a velocidades superiores a 14.000 x g. Não mais de centrífuga até a membrana seca completamente. Garantir que algum líquido ainda cobre o filtro após a centrifugação. Se mais de centrifugado e da membrana está seca, em seguida, adicione 15 mL TE, agitar suavemente durante 30 segundos e avance para o passo 21.b. 21.b. Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 xg por 3 min para recuperar o DNA. 22. Quantificar DNA por TAE gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V por 4 horas), e por espectrofotômetro Nanodrop ou Pico-verde ensaio e leitor de placas. Nota: quantidade de DNA pode ser estimado através da comparação da faixa de amostra para a banda marcador com concentração conhecida (marcador molecular de DNA de alta ou λHindIII) sobre o gel. 23. Verificar a integridade do DNA de alto peso molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) com 1%, 1xTAE gel (Para mais detalhes veja o Passo II, part2 em <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 por Taupp et al 2009).. Nota: Você pode usar gel agarose regulares para essa finalidade QC, em vez de baixa temperatura de fusão agarose. Em resumo, as condições de eletroforese são as seguintes: 02/0250 kb, 6 volts, tempo de comutação inicial: 5 segundos, tempo final de comutação: 15 seg, executado por 12 horas a 14 ° C. Ouro SYBR coloração de uma hora para visualizar o DNA do gel. 24. Se os pesos moleculares de DNA extraídos são satisfatórios, em seguida, avance para a etapa de centrifugação de gradiente de CsCl seguinte. Alternativamente, o DNA pode ser armazenado a -20 ° C ou -80 ° C antes da centrifugação CsCl. A mediana do tamanho do DNA deve ser igual ou superior a 36 Kb, se você quiser construir uma grande biblioteca de inserir DNA metagenomic. Parte II. Purificação de DNA usando cloreto de césio ultracentrifugação de gradiente Preparação de centrifugação: 1,5 - 2 horas Etapa de centrifugação: 18 horas Removendo brometo de etídio (EtBr) e concentrando o ADN após a centrifugação: 3 horas Procedimento Para detalhes, consulte Wright et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Resultados representante / Resultado A quantidade total de DNA genômico isolado de 2 g de floresta orgânica do solo (horizonte O) e horizontes minerais (Ae, AB, Bt e horizontes) (amostragem da produtividade do solo de Longo Prazo (LTSP) site localizado na Skulow lago, BC, Canadá e gerido pela BC Ministério de Florestas e Range) variou de 10 mg a 180 mg. O tamanho médio de DNA isolado foi geralmente entre 40-60 kb (Figura 1). A relação de absorvância a 260 nm foi nm/280 entre 1,3-1,6 e houve um pico em 230 nm, o que pode indicar a contaminação ácidos húmicos freqüentemente observada em amostras de solo. A centrifugação em gradiente de CsCl reduziu drasticamente essa contaminação e também aumentou a proporção de 260/280 para 1,8-1,9, como mostrado na Figura 2a e 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Imagens figura 1. PFGE do DNA genômico extraído antes ultracentrifugação CsCl. lane1: 1 kb marcador 100 ng, pista 2: λHind III marcador 100 ng, pista 3: λHind III marcador 250 ng, pista 4: λHind III marcador 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marcador 100 ng, pista 6 e 7: genômica DNA isolado do solo de horizonte mineral Ae, pista 8 e 9: o DNA genômico isolado do horizonte AB mineral do solo no local LTSP localizado Skulow lago, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2. Chromograms do DNA genômico detectada pelo espectrofotômetro antes (A) e depois de CsCl ultracentrifugação (B). Observe a redução do valor de absorbância no comprimento de onda nm após 230 CsCl ultracentrifugação, o que indica melhoria na qualidade do DNA genômico. Por favor, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Receita * Desnaturação solução 4 M isotiocianato de guanidina 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercaptoetanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Solução de desnaturação: 10 ml no total </td></tr><tr><td> Isotiocianato de guanidina (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> EDTA 0.5M </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar água a 9,95 ml no total. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 50 ul 2-mercaptoetanol imediatamente antes da utilização. (5 mL de 2-mercaptoetanol por 1 ml da solução de desnaturação) Nota: Manter a solução de desnaturação a 4 ° C. Não use tampão mais de uma semana. Se possível, faça uma solução tampão nova de usar. </td></tr></table> ** Tampão de extração 100 mM tampão fosfato de sódio [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl Brometo de hexadeciltrimetilamônio 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Tampão de extração de 1 L, no total </td></tr><tr><td> Sódio 1M tampão fosfato [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e mantê-lo à temperatura ambiente. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar 200ml, brometo de hexadeciltrimetilamônio 5% (CTAB, autoclavado) e 100 ml, 20% SDS (autoclavada) imediatamente antes da utilização. Se CTAB foi cristalizado, derretê-lo a 60 ° C. * Tampão fosfato de sódio 1M: 57,7 ml, sódio 1M fosfato monossódico (NaH 2 PO 4) e 42,3 ml, 1M Fosfato de sódio dibásico (NaH 2 PO 4). Ajustar o pH para 7,0 Nota: Não use SDS 20% se tiver precipitação. É normal ver suspensão leitosa quando você adiciona SDS para a solução. Uma vez que você adicionar SDS, coloque o tampão de extração a 60 ° C para garantir SDS é bem suspenso. </td></tr></table>

extração de dna genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

O microbioma do solo é um reservatório vasto e relativamente inexplorado da diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com nutrientes e fluxo de energia nos ecossistemas terrestres. Cultivo independente de genômica ambiental, também conhecida como metagenomic, abordagens prometem um acesso sem precedentes a essa informação genética no que diz respeito à reconstrução caminho e triagem funcional para terapêuticas de alto valor e os processos de conversão de biomassa. No entanto, o microbioma solo ainda permanece um desafio em grande parte devido à dificuldade na obtenção de DNA de alto peso molecular de qualidade suficiente para a produção de grandes inserir biblioteca. Aqui nós apresentamos um protocolo para a extração de alto peso molecular, o DNA genômico microbiana comunidade de solos e sedimentos. A qualidade do DNA genômico isolado é ideal para a construção de grandes bibliotecas genômicas inserir ambientais para aplicações a jusante seqüenciamento e análise. O procedimento começa com a lise celular. Paredes celulares e membranas de micróbios são lisadas por ambas as forças mecânicas (trituração) e químicas (β-mercaptoetanol). DNA genômico é então isolado usando tampão de extração, clorofórmio-álcool isoamílico e álcool isopropílico. Os buffers empregados para a lise e os passos de extração incluem isotiocianato de guanidina e brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) para preservar a integridade do DNA genômico de alto peso molecular. Dependendo da sua aplicação a jusante, o DNA genômico isolado pode ser purificado usando cloreto de césio (CsCl) ultracentrifugação de gradiente, o que reduz as impurezas, incluindo os ácidos húmicos. O primeiro procedimento, a extração, leva aproximadamente 8 horas, com exclusão de etapa de quantificação de DNA. A ultracentrifugação gradiente de CsCl, é um processo de dois dias. Durante todo o procedimento, o DNA genômico deve ser tratada com cuidado para evitar corte, evitar vórtex grave e dura pipetagem repetitiva.

Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

O microbioma do solo é um vasto e relativamente inexplorado reservatório de diversidade genômica e inovação metabólica que está intimamente associado com...

Olá, sou San Lee do laboratório de Stephen Harlem, do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para extração de DNA genômico de alto peso molecular de solo florestal, que também é aplicável a uma grande variedade de tipos de solo e sedimento. Utilizamos o DNA genômico de alto peso molecular para construir a biblioteca metagenômica das comunidades microbianas do solo.Com essas bibliotecas em mãos, podemos estudar a diversidade e o potencial metabólico das comunidades microbianas distribuídas entre diferentes horizontes do solo. Então, vamos começar. Este protocolo inicia-se com a lise celular.O primeiro passo é completar o tampão desnaturante adicionando beta-mercaptoetanol até uma concentração de 0,5%. Para obter os melhores resultados, prepare a solução desnaturante fresca a cada vez. Alternativamente, utilize um tampão com menos de uma semana de preparo que tenha sido mantido a quatro graus Celsius. Para o próximo passo, você precisará de um recipiente com nitrogênio líquido, uma autoclave e um almofariz, pistilo e espátula previamente resfriados.Coloque uma amostra de solo congelada de dois gramas no almofariz previamente resfriado. Adicione um mililitro da solução desnaturante. Em seguida, adicione nitrogênio líquido para cobrir completamente o solo.Use um pilão pré-resfriado para moer a amostra até que as partículas do solo pareçam pulverulentas e homogêneas e a amostra comece a derreter. Em seguida, adicione mais nitrogênio líquido e repita a etapa de moagem. Isso conclui a etapa de lise celular usando uma espátula pré-resfriada.Transfira a amostra moída para um tubo cônico de 50 mililitros. Mantenha a amostra sobre gelo para prosseguir imediatamente para a etapa de extração de DNA ou armazene a menos 80 graus Celsius. Para uso, logo antes de iniciar a extração de DNA, complete o tampão de extração adicionando brometo de hexadeciltrimetilamônio ou CTAB e SDS primeiro.Verifique se o CTAB está cristalizado e, caso esteja, dissolva-o a 60 graus Celsius antes de prosseguir. Em seguida, adicione-o à solução para uma concentração total de 1%. A seguir, adicione a solução de SDS a 20% para obter uma concentração final de 2%. A suspensão esbranquiçada que se forma é normal.Após a adição do SDS, mantenha o tampão de extração finalizado homogêneo armazenando-o a 60 graus Celsius após 10 a 15 minutos. Uma vez que o tampão de extração esteja bem dissolvido e homogêneo, adicione nove mililitros do tampão de extração à amostra de solo e vortexe brevemente em baixa velocidade para misturar. Incube a amostra com o tampão de extração em forno de hibridização a 65 graus Celsius por 40 minutos.Durante a incubação, inverta suavemente os tubos a cada 10 minutos ou gire continuamente os tubos na velocidade mais baixa do rotor. Durante a incubação, a solução pode apresentar leve viscosidade após o período de incubação. O próximo passo é usar clorofórmio-álcool isoamílico para purificar o DNA dos materiais orgânicos na mistura de lise.Inicie centrifugando a amostra por 10 minutos a 1800 Gs a aproximadamente 10 a 14 graus Celsius na câmara de fluxo laminar, colete o sobrenadante contendo o DNA deslizando cuidadosamente a ponteira da pipeta ao longo da parede do tubo, evitando a camada esbranquiçada na parte superior e a camada orgânica na parte inferior. Transfira o sobrenadante para um tubo de 50 mililitros previamente resfriado contendo 20 mililitros de álcool ISL com clorofórmio ou i a a a seguir, repita o processo de extração mais duas vezes na mesma amostra. Enquanto isso, mantenha o extrato de DNA e o clorofórmio i a a em gelo na câmara de fluxo laminar.Para a segunda extração de DNA, retorne ao tubo contendo o pellet de solo com o tampão de extração residual e adicione mais cinco mililitros de tampão de extração. Agite suavemente com uma ponteira de um mililitro para misturar e vortexe brevemente para ressuspender o pellet, como anteriormente. Incube a 65 graus Celsius desta vez por 10 minutos.Em seguida, centrifugue a 1800 Gs por 10 minutos. A cerca de 10 a 14 graus Celsius na câmara de fluxo laminar, transfira o sobrenadante para o tubo contendo clorofórmio, álcool isoamílico ou clorofórmio i a a e o sobrenadante da extração anterior. Repita todo o processo de extração mais uma vez para extrair o máximo possível de DNA da amostra de solo.Quando você tiver realizado um total de três extrações em sua amostra de solo, agite suavemente o tubo contendo o sobrenadante coletado e clorofórmio em uma placa rotatória a 1,25 RRP m por 10 minutos. Após esta etapa de mistura, centrifugue o tubo a 1800 Gs por 20 minutos a aproximadamente 10 a 14 graus Celsius. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de ultracentrífuga, deixando um a dois mililitros de SNAT para evitar perturbar a interface entre as fases aquosa e orgânica. Agora, para precipitar o DNA, adicione 0,6 mililitros de álcool isopropílico.Para cada mililitro do sobrenatante coletado, inverta suavemente os tubos algumas vezes para misturar. Neste momento, você poderá observar o precipitado de DNA formando longos filamentos. Em seguida, incube o DNA com o isopropanol por 30 minutos à temperatura ambiente.Após a incubação, é hora de pelotizar o DNA por centrifugação; marque um canto do tubo ao colocá-lo na centrífuga para saber onde esperar o pellet de DNA. Centrifugue a 16.000 ×g por 20 minutos a 20–25 °C. Após a centrifugação, remova o álcool isopropílico por decantação ou por sucção a vácuo. Tenha cuidado para não perder o pellet de DNA, cujo tamanho varia de quase imperceptível a nove milímetros de largura, dependendo da eficiência da extração e da quantidade de biomassa nas amostras de solo. Seque o pellet de DNA em temperatura ambiente por cinco a 20 minutos. Cuidado para não secar em excesso. Quando o pellet estiver seco,Resuspenda o DNA em 200 a 400 microlitros de te. Misture com leves batidas. Transfira a solução de DNA para um tubo de 1,5 mililitro.Mantenha o DNA a quatro graus Celsius durante a noite. Para dissolver completamente o DNA após sua extração da amostra de solo, os passos restantes para verificar a concentração e a integridade do DNA da amostra são procedimentos padrão, descritos em detalhes em outro protocolo do JoVE do laboratório Hallam. Determine a concentração de DNA utilizando o método de sua escolha.Também verifique a integridade do DNA de alto peso molecular realizando eletroforese em campo pulsado, ou PFGE, com 10 a 20 microlitros da sua amostra de DNA. O tamanho mediano do DNA deve ser de 36 quilobases ou maior, dependendo da sua aplicação posterior. Prossiga para a próxima etapa de centrifugação em gradiente de cloreto de césio; alternativamente, o DNA pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius antes da ultracentrifugação.O próximo passo é utilizar a centrifugação em gradiente de cloreto de césio para purificar ainda mais o DNA, removendo impurezas, após a centrifugação em gradiente de cloreto de césio concentrar e purificar ainda mais o DNA usando dispositivos de filtro centrífugo AmCon e MicroCon. A centrifugação em gradiente de cloreto de césio é fundamental para obter DNA de alta qualidade e é descrita em detalhes em outro protocolo do JoVE do laboratório Hallam. Após realizar os passos de centrifugação em gradiente de cloreto de césio e concentração, verifique a concentração de DNA utilizando o método de sua preferência.Em seguida, verifique novamente a integridade do DNA de alto peso molecular analisando uma pequena amostra do DNA por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A quantidade total de DNA genômico isolado de dois gramas de solo forçado varia de 10 a 180 microgramas, conforme mostrado na eletroforese antes e após a ultracentrifugação em cloreto de césio. A faixa de tamanho do DNA isolado geralmente varia entre 40 e 60 quilobases; aqui é apresentado um cromatograma de amostras de DNA genômico antes e após a ultracentrifugação em cloreto de césio.Esta etapa melhora a pureza do DNA, aumentando a razão 260/280 de 1,3 a 1,6 antes para 1,8 a 1,9 depois. Além disso, o pico de absorvância em 230 nanômetros, que indica contaminação por ácido húmico, foi reduzido com sucesso após a centrifugação. Acabamos de mostrar como isolar DNA genômico de alto peso molecular de comunidades microbianas do solo.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar o tampão de extração e o tampão desnaturante exatamente conforme as instruções. E tenha cuidado para não atingir o seu palato de DNA após a precipitação com álcool isopropílico. Quando recuperar a faixa de DNA após a centrifugação em gradiente de cloreto.Não se esqueça de enxaguar a seringa com o tampão TE para maximizar a recuperação do DNA. E, finalmente, verifique a quantidade e a qualidade do DNA isolado em todas as etapas sugeridas. Pronto.Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Este vídeo demonstra o protocolo para a extração de DNA a partir de material fixado em formalina parafina. Este é um procedimento multi-dia em que as secções de tecido são desparafinizadas com xilol, reidratados com etanol e tratados com proteinase K para purificar e isolar DNA para análise de genes específicos ou genome-wide subseqüentes.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Nós fornecemos um protocolo melhorado para a extração de DNA de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Células microbianas são separados da matriz mat antes da extração e purificação DNA. Isso aumenta a concentração, qualidade e tamanho do DNA. O protocolo pode ser usado para outras amostras refratário.

Extração de DNA de alto peso molecular de Esteiras Microbianas

A extração de DNA da saliva pode fornecer uma fonte prontamente disponível de DNA de alto peso molecular, com pouca ou nenhuma degradação/fragmentação.  Este protocolo fornece parâmetros otimizados para coleta/armazenamento de saliva e extração de DNA para qualidade e quantidade suficientes para ensaios de DNA a jusante com requisitos de alta qualidade.

Coleta e Extração de DNA de saliva para Next Generation Sequencing

A criosfera oferece acesso a organismos preservados que persistiram sob condições ambientais do passado. Um protocolo é apresentada para recolher e descontaminar núcleos permafrost de solos e gelo. A ausência de colónias exógenas e DNA sugerem que os microrganismos detectados representam o material, em vez de contaminação de perfuração ou de processamento.

Remoção de materiais exógenos da parte exterior dos núcleos congelados para investigar a antiga comunidades biológicas abrigava Dentro

Descrito aqui é um método para a extração, purificação e controle de qualidade do DNA genômico do patógeno fúngico biotrófico obrigatório, oídio, para uso em sequenciamento de genoma de leitura longa.

Purificação de DNA de alto peso molecular genômico de oídio de longo Read Sequencing

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

Extração aprimorada de DNA de baixo peso molecular de águas residuais para avaliação abrangente da resistência antimicrobiana 

Este protocolo descreve o método CTAB para extrair DNA de alta qualidade de micobactérias, superando desafios causados por suas paredes celulares resistentes e ricas em ácido micólico. O processo envolve digestão enzimática, lise celular com CTAB e purificação do DNA por meio de extração orgânica e precipitação de etanol. Esse método produz DNA adequado para estudos moleculares e é confiável para pesquisas micobacterianas.

Extração de Ácido Desoxirribonucleico de Genoma Integral de Espécies de Mycobacterium via Técnica de Brometo de Cetiltrimetilamônio

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Aprenda a extrair DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos para estudar comunidades microbianas. Este método permite analisar a diversidade e o potencial metabólico de microrganismos em diferentes horizontes do solo.

Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

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