Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos

Olá, sou San Lee, do laboratório de Stephen Harlem, no Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje mostramos um procedimento para extração genômica de DNA de alto peso molecular da floresta para o solo que também é aplicável a uma ampla variedade de tipos de solo e sedimento. Usamos DNA genômico de alto peso molecular para construir a biblioteca de medidores florestais das comunidades microbianas do solo.

Com essas bibliotecas em mãos, podemos estudar a diversidade e o potencial metabólico da partição das comunidades microbianas entre diferentes horizontes do solo. Então vamos começar. Este protocolo começa com a lise celular.

O primeiro passo é completar o tampão de desnaturação adicionando etanol betta mer capto a uma concentração de 0,5%Para obter melhores resultados, torne a solução desnaturante fresca a cada vez. Como alternativa, use tampão com menos de uma semana de idade que tenha sido mantido a quatro graus Celsius. Para a próxima etapa, você precisará de um fazedor de nitrogênio líquido e uma autoclave e pilão de almofariz pré-resfriado e espátula.

Coloque uma amostra de solo congelado de dois gramas na argamassa pré-resfriada. Adicione um mililitro da solução desnaturante. Em seguida, adicione nitrogênio líquido para cobrir totalmente o solo.

Use um pilão pré-resfriado para moer a amostra até que as partículas do solo pareçam pulverulentas e homogêneas e a amostra comece a derreter. Em seguida, adicione mais nitrogênio líquido e repita a etapa de moagem. Isso completa a etapa de lise celular usando uma espátula pré-resfriada.

Transferir a amostra moída para um tubo cónico de 50 mililitros. Mantenha a amostra no gelo para prosseguir imediatamente para a etapa de extração de DNA ou armazene a 80 graus Celsius negativos. Para uso em litros, pouco antes de iniciar a extração de DNA, complete o tampão de extração adicionando brometo de hexa deco trimetil amônio ou CTAB e SDS. Primeiro.

Verifique se o CTAB está cristalizado e, em caso afirmativo, dissolva-o a 60 graus Celsius antes de prosseguir. Em seguida, adicione-o à solução para uma concentração total de 1%Em seguida, adicione a solução 20%SDS a uma concentração final de 2%A suspensão leitosa. Que as formas são normais.

Uma vez que o SDS tenha sido adicionado, mantenha o tampão de extração completo homogêneo, armazenando-o a 60 graus Celsius após 10 a 15 minutos. Assim que o tampão de extração estiver bem dissolvido e homogêneo, adicione nove mililitros de tampão de extração à amostra de solo e vortex brevemente em baixa velocidade para misturar. Incube a amostra com tampão de extração em um forno de hibridização de 65 graus Celsius por 40 minutos.

Durante a incubação, inverta suavemente os tubos a cada 10 minutos ou gire continuamente os tubos na velocidade mais baixa do rotor. Durante a incubação, a solução pode parecer ligeiramente viscosa após a incubação. O próximo passo é usar álcool clorofórmio isoamílico para purificar o DNA do material orgânico na mistura de lise.

Comece centrifugando a amostra por 10 minutos a 1800 Gs a cerca de 10 a 14 graus Celsius na coifa, colete o DNA contendo sobrenadante deslizando a ponta da pipeta cuidadosamente ao longo da lateral do tubo, evitando a camada bege na parte superior e a camada orgânica na parte inferior. Transferir o sobrenadante para um tubo pré-refrigerado de 50 mililitros contendo 20 mililitros de álcool ISL de clorofórmio ou em seguida, repetir o processo de extracção mais duas vezes na mesma amostra. Enquanto isso, mantenha o extrato de DNA e o clorofórmio no gelo no capô.

Para a segunda extração de DNA, volte para o tubo que contém o pellet de solo com tampão de extração residual e adicione mais cinco mililitros de tampão de extração. Mexa delicadamente com uma ponta de um mililitro para misturar e vortex brevemente para ressuspender o pellet como antes. Incube a 65 graus Celsius desta vez por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue a 1800 Gs por 10 minutos. A cerca de 10 a 14 graus Celsius na coifa, transferir o sobrenadante para o tubo que contém clorofórmio, álcool isoamílico ou clorofórmio i a a e o sobrenadante da extracção anterior. Repita todo o processo de extração mais uma vez para extrair o máximo de DNA possível da amostra de solo.

Quando tiver completado um total de três extracções na sua amostra de solo, agite muito suavemente o tubo que contém o supra nadante e o clorofórmio recolhidos i a a 1,25 PVP m durante 10 minutos Após esta etapa de mistura, centrifugue o tubo a 1800 Gs durante 20 minutos a cerca de 10 a 14 graus Celsius. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de ultracentrífuga, deixando de um a dois mililitros de SNAT para evitar perturbar a interface entre as fases aquosa e orgânica. Agora, para precipitar o DNA, adicione 0,6 mililitros de álcool isopropílico.

Para cada mililitro de sobrenadante coletado, inverta os tubos suavemente algumas vezes para misturar. Neste ponto, você pode ser capaz de ver o DNA precipitar em longos fios. Em seguida, incubar o ADN com o isopropanol durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Após a incubação, é hora de granular o DNA por centrifugação, marque um canto do tubo ao colocá-lo na centrífuga para saber onde esperar o pellet de DNA Gire a 16.000 GS por 20 minutos a 20 a 25 graus Celsius após a centrifugação, remova o álcool isopropílico por decantação e / ou aspiração a vácuo. Tenha cuidado para não perder o pellet de DNA, que varia em tamanho de quase invisível a nove milímetros de largura, dependendo da eficiência de extração e biomassa em amostras de solo, seque o pellet de DNA em temperatura ambiente por cinco a 20 minutos. Cuidado para não secar demais quando o pellet estiver seco.

Ressuspenda o DNA em 200 a 400 microlitros de te. Misture batendo suavemente. Transfira a solução de DNA para um tubo de 1,5 mililitro.

Mantenha o DNA a quatro graus Celsius durante a noite. Para dissolver totalmente o DNA depois que o DNA foi extraído da amostra de solo, as etapas restantes para verificar a concentração e a integridade do DNA da amostra são procedimentos padrão, descritos em detalhes em outro protocolo JoVE do laboratório Hallam. Determine a concentração de DNA usando o método de sua escolha.

Verifique também a integridade do DNA de alto peso molecular esgotando de 10 a 20 microlitros de sua amostra de DNA usando eletroforese em gel de campo pulsado ou PFGE. O tamanho médio do DNA deve ser de 36 quilobases ou mais, dependendo da sua aplicação a jusante. Prossiga para a seguinte etapa de centrífuga de gradiente de cloreto de césio alternativamente, o DNA pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius antes da ultracentrifugação.

O próximo passo é usar a centrifugação com gradiente de cloreto de césio para purificar ainda mais o DNA, removendo impurezas, seguindo o concentrado de centrifugação com gradiente de cloreto de césio e purificar ainda mais o DNA usando dispositivos de filtro centrífugo AmCon e MicroCon. A centrifugação do gradiente de cloreto de césio é a chave para obter DNA de alta qualidade e é descrita em detalhes em outro protocolo JoVE do laboratório Hallam. Depois de realizar as etapas de centrifugação e concentração do gradiente de cloreto de césio, verifique a concentração de DNA usando o método de sua escolha.

Em seguida, verifique a integridade do DNA de alto peso molecular mais uma vez, executando uma pequena amostra do DNA usando PFGE. A quantidade total de DNA genômico isolado de dois gramas de solo forçado varia de 10 a 180 microgramas, conforme mostrado no gel antes e depois da ultracentrifugação do cloreto de césio. A faixa de tamanho do DNA isolado geralmente varia entre 40 a 60 quilobases mostradas aqui é um cromatograma de amostras de DNA genômico antes e depois da ultracentrifugação do cloreto de césio.

Esta etapa melhora a pureza do DNA, aumentando a proporção de dois 60 sobre dois 80 de 1,3 a 1,6 antes para 1,8 a 1,9 depois. Além disso, o pico de absorbância em 230 nanômetros, o que implica contaminação por ácido húmico, foi reduzido com sucesso após a centrifugação. Acabamos de mostrar como isolar DNA genômico de alto peso molecular de comunidades microbianas do solo.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de fazer o tampão de extração e desnaturação seguindo precisamente as instruções. E tome cuidado para não atingir seu palato de DNA após a precipitação de álcool isopropílico. Quando você recupera a banda de DNA após a centrificação do gradiente de cloreto.

Não se esqueça de enxaguar a seringa com o TE para maximizar a recuperação do DNA. E, finalmente, para verificar a quantidade e a qualidade do seu DNA isolado em todas as etapas sugeridas. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.