Extração de DNA genômico de alto peso molecular de solos e sedimentos
10 de novembro de 2009
Uma metodologia para isolar alto peso molecular e DNA genômico de alta qualidade da comunidade microbiana do solo é descrito.
Olá, sou San Lee do laboratório de Stephen Harlem, do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para extração de DNA genômico de alto peso molecular de solo florestal, que também é aplicável a uma grande variedade de tipos de solo e sedimento. Utilizamos o DNA genômico de alto peso molecular para construir a biblioteca metagenômica das comunidades microbianas do solo.
Com essas bibliotecas em mãos, podemos estudar a diversidade e o potencial metabólico das comunidades microbianas distribuídas entre diferentes horizontes do solo. Então, vamos começar. Este protocolo inicia-se com a lise celular.
O primeiro passo é completar o tampão desnaturante adicionando beta-mercaptoetanol até uma concentração de 0,5%. Para obter os melhores resultados, prepare a solução desnaturante fresca a cada vez. Alternativamente, utilize um tampão com menos de uma semana de preparo que tenha sido mantido a quatro graus Celsius. Para o próximo passo, você precisará de um recipiente com nitrogênio líquido, uma autoclave e um almofariz, pistilo e espátula previamente resfriados.
Coloque uma amostra de solo congelada de dois gramas no almofariz previamente resfriado. Adicione um mililitro da solução desnaturante. Em seguida, adicione nitrogênio líquido para cobrir completamente o solo.
Use um pilão pré-resfriado para moer a amostra até que as partículas do solo pareçam pulverulentas e homogêneas e a amostra comece a derreter. Em seguida, adicione mais nitrogênio líquido e repita a etapa de moagem. Isso conclui a etapa de lise celular usando uma espátula pré-resfriada.
Transfira a amostra moída para um tubo cônico de 50 mililitros. Mantenha a amostra sobre gelo para prosseguir imediatamente para a etapa de extração de DNA ou armazene a menos 80 graus Celsius. Para uso, logo antes de iniciar a extração de DNA, complete o tampão de extração adicionando brometo de hexadeciltrimetilamônio ou CTAB e SDS primeiro.
Verifique se o CTAB está cristalizado e, caso esteja, dissolva-o a 60 graus Celsius antes de prosseguir. Em seguida, adicione-o à solução para uma concentração total de 1%. A seguir, adicione a solução de SDS a 20% para obter uma concentração final de 2%. A suspensão esbranquiçada que se forma é normal.
Após a adição do SDS, mantenha o tampão de extração finalizado homogêneo armazenando-o a 60 graus Celsius após 10 a 15 minutos. Uma vez que o tampão de extração esteja bem dissolvido e homogêneo, adicione nove mililitros do tampão de extração à amostra de solo e vortexe brevemente em baixa velocidade para misturar. Incube a amostra com o tampão de extração em forno de hibridização a 65 graus Celsius por 40 minutos.
Durante a incubação, inverta suavemente os tubos a cada 10 minutos ou gire continuamente os tubos na velocidade mais baixa do rotor. Durante a incubação, a solução pode apresentar leve viscosidade após o período de incubação. O próximo passo é usar clorofórmio-álcool isoamílico para purificar o DNA dos materiais orgânicos na mistura de lise.
Inicie centrifugando a amostra por 10 minutos a 1800 Gs a aproximadamente 10 a 14 graus Celsius na câmara de fluxo laminar, colete o sobrenadante contendo o DNA deslizando cuidadosamente a ponteira da pipeta ao longo da parede do tubo, evitando a camada esbranquiçada na parte superior e a camada orgânica na parte inferior. Transfira o sobrenadante para um tubo de 50 mililitros previamente resfriado contendo 20 mililitros de álcool ISL com clorofórmio ou i a a a seguir, repita o processo de extração mais duas vezes na mesma amostra. Enquanto isso, mantenha o extrato de DNA e o clorofórmio i a a em gelo na câmara de fluxo laminar.
Para a segunda extração de DNA, retorne ao tubo contendo o pellet de solo com o tampão de extração residual e adicione mais cinco mililitros de tampão de extração. Agite suavemente com uma ponteira de um mililitro para misturar e vortexe brevemente para ressuspender o pellet, como anteriormente. Incube a 65 graus Celsius desta vez por 10 minutos.
Em seguida, centrifugue a 1800 Gs por 10 minutos. A cerca de 10 a 14 graus Celsius na câmara de fluxo laminar, transfira o sobrenadante para o tubo contendo clorofórmio, álcool isoamílico ou clorofórmio i a a e o sobrenadante da extração anterior. Repita todo o processo de extração mais uma vez para extrair o máximo possível de DNA da amostra de solo.
Quando você tiver realizado um total de três extrações em sua amostra de solo, agite suavemente o tubo contendo o sobrenadante coletado e clorofórmio em uma placa rotatória a 1,25 RRP m por 10 minutos. Após esta etapa de mistura, centrifugue o tubo a 1800 Gs por 20 minutos a aproximadamente 10 a 14 graus Celsius. Após a centrifugação, transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de ultracentrífuga, deixando um a dois mililitros de SNAT para evitar perturbar a interface entre as fases aquosa e orgânica. Agora, para precipitar o DNA, adicione 0,6 mililitros de álcool isopropílico.
Para cada mililitro do sobrenatante coletado, inverta suavemente os tubos algumas vezes para misturar. Neste momento, você poderá observar o precipitado de DNA formando longos filamentos. Em seguida, incube o DNA com o isopropanol por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após a incubação, é hora de pelotizar o DNA por centrifugação; marque um canto do tubo ao colocá-lo na centrífuga para saber onde esperar o pellet de DNA. Centrifugue a 16.000 ×g por 20 minutos a 20–25 °C. Após a centrifugação, remova o álcool isopropílico por decantação ou por sucção a vácuo. Tenha cuidado para não perder o pellet de DNA, cujo tamanho varia de quase imperceptível a nove milímetros de largura, dependendo da eficiência da extração e da quantidade de biomassa nas amostras de solo. Seque o pellet de DNA em temperatura ambiente por cinco a 20 minutos. Cuidado para não secar em excesso. Quando o pellet estiver seco,
Resuspenda o DNA em 200 a 400 microlitros de te. Misture com leves batidas. Transfira a solução de DNA para um tubo de 1,5 mililitro.
Mantenha o DNA a quatro graus Celsius durante a noite. Para dissolver completamente o DNA após sua extração da amostra de solo, os passos restantes para verificar a concentração e a integridade do DNA da amostra são procedimentos padrão, descritos em detalhes em outro protocolo do JoVE do laboratório Hallam. Determine a concentração de DNA utilizando o método de sua escolha.
Também verifique a integridade do DNA de alto peso molecular realizando eletroforese em campo pulsado, ou PFGE, com 10 a 20 microlitros da sua amostra de DNA. O tamanho mediano do DNA deve ser de 36 quilobases ou maior, dependendo da sua aplicação posterior. Prossiga para a próxima etapa de centrifugação em gradiente de cloreto de césio; alternativamente, o DNA pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius antes da ultracentrifugação.
O próximo passo é utilizar a centrifugação em gradiente de cloreto de césio para purificar ainda mais o DNA, removendo impurezas, após a centrifugação em gradiente de cloreto de césio concentrar e purificar ainda mais o DNA usando dispositivos de filtro centrífugo AmCon e MicroCon. A centrifugação em gradiente de cloreto de césio é fundamental para obter DNA de alta qualidade e é descrita em detalhes em outro protocolo do JoVE do laboratório Hallam. Após realizar os passos de centrifugação em gradiente de cloreto de césio e concentração, verifique a concentração de DNA utilizando o método de sua preferência.
Em seguida, verifique novamente a integridade do DNA de alto peso molecular analisando uma pequena amostra do DNA por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A quantidade total de DNA genômico isolado de dois gramas de solo forçado varia de 10 a 180 microgramas, conforme mostrado na eletroforese antes e após a ultracentrifugação em cloreto de césio. A faixa de tamanho do DNA isolado geralmente varia entre 40 e 60 quilobases; aqui é apresentado um cromatograma de amostras de DNA genômico antes e após a ultracentrifugação em cloreto de césio.
Esta etapa melhora a pureza do DNA, aumentando a razão 260/280 de 1,3 a 1,6 antes para 1,8 a 1,9 depois. Além disso, o pico de absorvância em 230 nanômetros, que indica contaminação por ácido húmico, foi reduzido com sucesso após a centrifugação. Acabamos de mostrar como isolar DNA genômico de alto peso molecular de comunidades microbianas do solo.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar o tampão de extração e o tampão desnaturante exatamente conforme as instruções. E tenha cuidado para não atingir o seu palato de DNA após a precipitação com álcool isopropílico. Quando recuperar a faixa de DNA após a centrifugação em gradiente de cloreto.
Não se esqueça de enxaguar a seringa com o tampão TE para maximizar a recuperação do DNA. E, finalmente, verifique a quantidade e a qualidade do DNA isolado em todas as etapas sugeridas. Pronto.
Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia para o isolamento de DNA genômico de alto peso molecular de comunidades microbianas do solo. O procedimento é aplicável a diversos tipos de solo e sedimento, permitindo o estudo da diversidade microbiana e do potencial metabólico.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Genômica
- Ciência Ambiental
Antecedentes
- O DNA genômico de alto peso molecular é essencial para o estudo das comunidades microbianas.
- As comunidades microbianas do solo desempenham um papel significativo nas funções dos ecossistemas.
- Compreender a diversidade microbiana pode orientar práticas de manejo ambiental.
- Os métodos atuais podem não isolar eficazmente DNA de alta qualidade do solo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para extrair DNA genômico de alto peso molecular.
- Facilitar a construção de bibliotecas para o estudo de comunidades microbianas.
- Aprimorar a compreensão da diversidade microbiana em diferentes horizontes do solo.
Métodos Utilizados
- Lise celular para liberar o DNA de células microbianas.
- Isolamento de DNA genômico de alto peso molecular.
- Aplicação do método a diversos tipos de solo.
- Construção de bibliotecas de metragem florestal para análise.
Resultados Principais
- Extração bem-sucedida de DNA genômico de alta qualidade a partir de amostras de solo.
- As bibliotecas construídas fornecem informações sobre a diversidade microbiana.
- O método é aplicável a uma ampla variedade de tipos de solo e sedimento.
- Facilita pesquisas futuras sobre o potencial metabólico microbiano.
Conclusões
- A metodologia desenvolvida é eficaz para o isolamento de DNA genômico.
- A extração de DNA de alto peso molecular é fundamental para estudos microbianos.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar a ecologia microbiana.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O acesso ao DNA genômico de alto peso molecular proveniente de amostras ambientais complexas permite a construção de bibliotecas metagenômicas com inserções grandes para triagem funcional e descoberta de vias metabólicas. Essa capacidade apoia a identificação de alvos e a geração de compostos iniciais na descoberta de fármacos a partir de produtos naturais, fornecendo acesso ao potencial metabólico microbiano não cultivado. O método aborda um gargalo fundamental na genômica ambiental, facilitando a redução de riscos em hipóteses terapêuticas iniciais por meio do acesso direto a microbiomas do solo geneticamente diversos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao fornecer acesso a comunidades microbianas geneticamente diversas e não cultivadas para a descoberta de alvos.
- Valor Operacional: Produz DNA de alto peso molecular adequado para a construção de bibliotecas com inserções grandes, reduzindo o viés de clonagem e aumentando as taxas de acerto funcionais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera modelos de DNA para triagem funcional metagenômica de vias biossintéticas derivadas de solo associadas a atividade terapêutica.
- Valor Operacional: Fornece DNA purificado com reduzida contaminação por ácidos húmicos, melhorando a eficiência das reações enzimáticas subsequentes e a reprodutibilidade dos ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a identificação de funções enzimáticas inovadoras e compostos bioativos a partir de micróbios ambientais para validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Permite a construção de bibliotecas prontas para sequenciamento destinadas à expressão heteróloga e otimização de compostos iniciais na descoberta de fármacos antimicrobianos ou anticâncer.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, permitindo a construção de bibliotecas para campanhas de triagem que orientam a identificação de compostos ativos e a seleção de candidatos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Facilita a exploração isenta de hipóteses do potencial metabólico microbiano do solo para a descoberta de alvos e vias.
- Triagem: Produz entradas de DNA para ensaios de triagem funcional projetados para detectar metabólitos bioativos ou atividades enzimáticas.
- Análises: Permite a verificação de tamanho e pureza por meio de eletroforese em campo pulsado e centrifugação em gradiente de cloreto de césio para garantir a qualidade da biblioteca.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta de genes ambientais à avaliação pré-clínica mediante a expressão de vias clonadas em hospedeiros manipuláveis.
- Reutilização Empresarial: Fornece um protocolo padronizado e escalonável de extração de DNA aplicável a diversas amostras de solo e sedimento para campanhas repetidas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao acessar reservatórios microbianos geneticamente ricos e não cultivados.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização no isolamento de DNA, reduzindo a variabilidade entre diferentes tipos de amostras ambientais.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper no estágio inicial de descoberta, ampliando o acesso a um novo espaço químico proveniente de microbiomas do solo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos promissores derivados de bibliotecas metagenômicas com potencial funcional validado.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular e no manuseio de reagentes perigosos, como beta-mercaptoetanol, clorofórmio e cloreto de césio.
- Depende do acesso a equipamentos de ultracentrifugação para etapas com gradiente de cloreto de césio e sistemas de eletroforese em campo pulsado para avaliação da integridade do DNA.
- Necessita de procedimentos operacionais padronizados entre as equipes para garantir rendimento e qualidade consistentes de DNA a partir de matrizes de solo variáveis.
- Envolve o manuseio cuidadoso das amostras para evitar a quebra do DNA, incluindo a ausência de vortex vigoroso e pipetagem repetitiva durante as etapas de extração e precipitação.
- É limitado pela variabilidade inerente do teor de ácidos húmicos no solo, o que pode exigir a otimização das etapas de purificação para certos tipos de amostras.
