Name: Assembléia, Tuning e Uso de um microscópio de campo Apertureless Near Infrared for Imaging Protein (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda a montar e ajustar um microscópio de infravermelho de campo próximo para imagem de agregados proteicos. Este método combina microscopia de força atômica e laser visível para alinhamento óptico preciso.

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Agradecemos NSF, NSERC, NIH, e ONR.

<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

assembléia, tuning e uso de um microscópio de campo apertureless near infrared for imaging protein

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na montagem e operação de um microscópio de campo próximo infravermelho para imagens além do limite de difração. O microscópio de campo próximo apertureless é um instrumento de espalhamento de luz do tipo que fornece espectros de infravermelho em cerca de 20 nm resolução. Uma lista completa de componentes e um protocolo passo a passo para uso é fornecida. Erros comuns na montagem e afinação do instrumento são discutidas. Um conjunto de dados representativos que mostra a estrutura secundária de uma fibrilas amilóides é apresentado.

A montagem de um microscópio nearfield infravermelho para os agregados da proteína de imagem é descrito.

Assembléia, Tuning e Uso de um microscópio de campo Apertureless Near Infrared for Imaging Protein

Este artigo visa instruir o leitor na montagem e operação de um microscópio de campo próximo no infravermelho para imageamento além do limite de difração. O...

A montagem inicial do conjunto óptico é concluída configurando o microscópio óptico e o FM multimodo. O alinhamento do feixe infravermelho invisível é facilitado primeiramente alinhando-o com um laser visível de hélio-neônio vermelho. A linha contínua deve sobrepor-se ao infravermelho, a linha tracejada, com o objetivo de observar a luz laser atingindo o ápice da ponta do cantiléver e o detector de infravermelho.O alinhamento final do feixe infravermelho é feito ajustando a posição do microscópio óptico, bem como os espelhos, para obter um sinal de um F com a forma correta quando o sinal de campo próximo desejado é obtido. Simultaneamente, imagens de topografia FM e de campo próximo são coletadas utilizando o software nano scope. Olá, sou o Professor Gilbert Walker do Departamento de Química da Universidade de Toronto.Olá, sou Melissa Paulite, também do laboratório de Gilbert Walker. Hoje vamos mostrar a você o procedimento para a montagem e alinhamento iniciais da lista de aberturas do microscópio de varredura infravermelho de campo próximo. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar agregados proteicos.Então vamos começar. Antes de descrever a montagem e o ajuste do sistema de imagem, vamos primeiro analisar uma breve visão geral do sistema completo. As partes do sistema de imagem que descreveremos neste vídeo incluem a mesa óptica, a base do microscópio de força atômica multimodo, ou AFM, o scanner do AFM multimodo, a placa óptica elevada, os espelhos guia, o tubo óptico com diafragma e centro.Bloqueie o cubo óptico com o refletor parcial de selênio de zinco, o tubo óptico utilizado para fixar a montagem na plataforma elevatória. O objetivo infravermelho, o tubo óptico para a luz retroespalhada coletada. O cubo com um espelho paraboloide fora do eixo, o cubo para segurar a placa de germânio a 45 graus.A ocular do microscópio, o orifício montado na platina XY, o detector infravermelho de telureto de mercúrio cádmio ou MCT. O pré-amplificador do detector infravermelho, a platina XY para mover a posição do feixe, a mesa elevatória para focalizar o feixe, a platina Z para posicionar o detector infravermelho e a platina X para posicionar o detector infravermelho. Para iniciar a montagem da configuração óptica, utilize espelhos de ajuste para posicionar o feixe de hélio-neônio paralelamente à mesa óptica.A seguir, sem divisor de feixe no cubo e com o tubo óptico alongado na outra extremidade do cubo, direcione o feixe de hélio-neônio através das íris fixadas nas extremidades dos tubos. Agora, remova o scanner e conecte o tubo óptico alongado no lugar do objetivo infravermelho. Insira o refletor parcial de selênio de zinco para direcionar o feixe em direção à amostra.Deve ser montado de forma que o feixe de hélio-neônio atinja a superfície frontal do refletor no centro geométrico do cubo óptico. Ao girar o refletor parcial, direcione o feixe através da saída fechada. Como o suporte do refletor parcial não o mantém exatamente perpendicular, utilizamos dois parafusos de ajuste instalados internamente para permitir o movimento vertical do feixe.Em seguida, utilize anéis de borracha O para montar o espelho paralóide apertando os parafusos. Os anéis O comprimem-se, permitindo o ajuste do espelho. Use espelhos adicionais para direcionar o feixe de hélio-neônio em direção oposta, ajustando-o para passar através das íris previamente utilizadas.Este feixe será usado para ajustar o espelho paraboloide. O espelho paraboloide colocado no cubo óptico reflete a luz em direção ao detector, que será posicionado após o orifício de agulha. Parafusos de ajuste permitem direcionar o feixe através do orifício de agulha colocado na saída do cubo.Após o feixe ser ajustado através do orifício, posicione o detector MCT próximo ao orifício. Ajuste a posição do detector de infravermelho de modo que o feixe de hélio-neônio incida sobre o elemento sensor do detector. Desloque o detector para baixo em aproximadamente dois milímetros.Agora insira o suporte com a janela de germânio no cubo óptico localizado antes do diafragma. A janela de germânio com revestimento refletivo serve como filtro de infravermelho e permite observações visuais do cantiléver e da amostra. Em seguida, acople a ocular.Girar o ângulo do cubo permite que a ocular seja direcionada para a direção desejada mediante a rotação do suporte da janela de germânio. Direcione o feixe de hélio-neônio através do centro da ocular. Conecte o objetivo infravermelho e um scanner FM e fixe o bloqueador de feixe.Posicione uma amostra no escâner e direcione o feixe de hélio-neônio através do tubo óptico de entrada. Certifique-se de que o feixe seja largo o suficiente para transbordar sobre o feixe. Pare ajustando o fio do ocular.Obtenha uma imagem nítida do feixe focalizado na amostra. Em seguida, acople a cabeça de FM e posicione a sonda sobre a amostra. Foque o feixe de hélio-neônio na extremidade da alavanca de imageamento.Se fizer isso, o feixe será deslocado do centro do tubo óptico de entrada. Repita as etapas de ajuste até que o feixe esteja centralizado. Para iniciar os ajustes finais do espelho parabólico, substitua o orifício de saída pela abertura de íris na posição focal do espelho paraboloide e remova a janela de germânio e o detector de infravermelho.Lembre-se de marcar a posição do detector de infravermelho. Acople uma lente adicional após o diafragma, na distância focal aproximada da lente. O cantiléver engatado deve agora ser visível através da lente.Ajuste a posição do espelho paraboloide para centralizá-lo na extremidade da ponta através da íris fechada. Observe que, quando o feixe de hélio-neônio está corretamente focalizado na ponta, surge um brilho intenso entre a ponta e seu reflexo na superfície da amostra. Reinstale a janela de germânio e ajuste-a para facilitar a observação visual do cantiléver.Substitua a íris pelo orifício de agulha. Lembre-se de que o orifício de agulha usado para detecção no infravermelho deve ser deslocado do centro devido ao desvio do feixe de infravermelho causado pela janela de germânio. Posicione o detector de infravermelho na posição previamente marcada e direcione o feixe de infravermelho para que viaje junto com o feixe visível usado para o ajuste.Agora estamos prontos para analisar o procedimento de ajuste de rotina. A configuração é mais fácil de alinhar com o feixe visível de hélio-neônio do que com o feixe infravermelho invisível. O trajeto do feixe de hélio-neônio e do feixe infravermelho se encontram no espelho basculante.Se este espelho for inclinado para baixo, o hélio-neônio pode passar. Se o espelho estiver em posição, o infravermelho vai para o campo próximo. Configuração para alinhamento de um dos feixes.Utilize dois espelhos que não sejam comuns ao outro caminho. Se você observar o feixe no braço homo-dino, deverá ver um perfil de feixe semelhante a uma coroa. O modo FM agora está acoplado com realimentação de força para alinhamento fino com o estágio de campo próximo.Mova o objetivo do microscópio refletor para focalizar a luz na ponta, onde ela é dispersa. Coloque a janela de germânio no cubo óptico. Após o espelho paralóide, o feixe é focalizado neste ponto por um espelho paralóide.Mova o estágio para trás ou para frente até que você consiga ver uma imagem nítida da ponta e seu reflexo na superfície da amostra usando a janela de germânio. Agora, olhe através do telescópio, onde é possível ver a alavanca e a ponta sem o feixe de hélio-neônio. Você ainda pode ver alguma luz vermelha, mas essa é uma luz interna do controle de distância do microscópio de força atômica.Mova o estágio nas direções para a direita, para a esquerda e para cima e para baixo até obter um brilho vermelho intenso na ponta. Para sobrepor o campo de homodina à luz dispersa, primeiro abra o braço de homodina. Em seguida, olhe através da ocular.Você verá três ou mais pontos em uma linha com intensidade decrescente. Mova o espelho no braço homo dyne para que o segundo ponto se sobreponha à imagem da ponta, onde a ponta e seu reflexo se encontram. Para posicionar o detector, remova o espelho adicional.O feixe de hélio-neônio agora seguirá na direção do detector atrás do tubo. É possível observar pelo menos duas manchas em forma de anel. A segunda mancha a partir da direita deve passar pelo orifício na folha de proteção térmica diante do detector e atingir o elemento sensor.O ponto com maior intensidade deve ser visto na borda do orifício após o ajuste rotineiro estar completo. Vamos analisar o alinhamento do feixe infravermelho. Para alinhar o feixe infravermelho, utilize uma linha de laser de monóxido de carbono com uma intensidade de pelo menos 100 miliwatts.Isso facilitará o alinhamento. Para começar, preencha o detector com nitrogênio líquido. Levante o espelho montado em um suporte cinemático basculante para que o feixe infravermelho seja direcionado para o microscópio.Coloque um medidor de potência atrás da primeira íris e ajuste o espelho localizado antes do espelho montado em um suporte basculante cinemático. Para obter a maior potência, segure o medidor de potência atrás da íris mais próxima do estágio do campo próximo e mova o espelho basculante até obter a potência máxima. Durante o processo de alinhamento, repita esses passos várias vezes enquanto observa o sinal F1.Para verificar o sinal de um F, altere a referência do bloqueio no amplificador para um f igual à frequência de oscilação FM e vá para um tamanho de varredura Zs de três metros no modo de plotagem de força. Se houver má alinhamento, você verá um pico largo na escala de três metros. Para corrigir isso, será necessário repetir continuamente os passos anteriores até que o alinhamento melhore.Se você tiver um alinhamento médio, a curvatura do primeiro pico parecerá ligeiramente côncava, embora o segundo pico seja maior que o primeiro. Aqui, você pode tentar corrigir o alinhamento ajustando um ou ambos os espelhos de alinhamento. Se o seu alinhamento estiver bom, você verá apenas dois picos e o primeiro será mais alto que o segundo.A curvatura no lado direito do primeiro pico será negativa. Uma vez que você tenha um bom alinhamento, pode mover os espelhos para aumentar o máximo do primeiro pico. O sinal F deve estar em algum lugar entre cinco e doze volts, embora a forma do primeiro pico seja mais crítica.Por fim, mude para dois F e tente melhorar um pouco mais o sinal. Ao girar ligeiramente os espelhos e alterar a fase, o sinal de dois F deve ficar entre 0,6 e dois volts. Topografia experimental e campo próximo.Imagens de 21 a 31 fibrilas peptídicas são mostradas. A escala superior mostra a altura em nanômetros e a escala inferior mostra o contraste de campo próximo em volts de bloqueio; a imagem de topografia mostrada aqui foi coletada simultaneamente com a imagem de campo próximo obtida usando 1.631 centímetros inversos de radiação. Uma imagem de topografia coletada simultaneamente com a imagem de campo próximo obtida usando 1.691 centímetros inversos.A radiação é mostrada. As etiquetas representam FIs particulares e são usadas para destacar o tipo de confirmação secundária que cada FI possui. Acabamos de mostrar como montar uma linha e usar uma lista de aberturas em um microscópio infravermelho de varredura de campo próximo.Lembre-se das etapas realizadas durante o alinhamento para que você possa refazer seus passos caso o alinhamento esteja incorreto, e, acima de tudo, seja paciente. É isso. Obrigado por assistir.Boa sorte com seus experimentos.

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