Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

Este vídeo demonstra a eletrofiação de polímeros, uma técnica popular na engenharia de tecidos e no cultivo celular para criar scaffolds de fibras que imitam a arquitetura e a escala de tamanho da matriz extracelular nativa. Aqui, realizamos a eletrofiação de um ácido hialurônico fotoreativo capaz de reticulação mediante exposição à luz e apresentamos aplicações adicionais de processamento, como o fotopadroneamento, um processo que cria canais e scaffolds com porosidade em múltiplas escalas para aumentar a infiltração celular e a distribuição tecidual. Além disso, utilizamos a formação de scaffolds com múltiplos polímeros, o que permite a eletrofiação de dois polímeros diferentes em um mesmo material, possibilitando o ajuste das propriedades mecânicas e da degradação do scaffold, bem como a personalização da porosidade para infiltração celular.

Olá, sou Jamie Kovi do laboratório de Jason Burdick do Departamento de Bioengenharia da Universidade da Pensilvânia. Olá, sou Harini Swin, também do Laboratório Burdick. Hoje vamos mostrar um procedimento para a eletrofiação de scaffolds de fibras para engenharia de tecidos.

Também apresentaremos as capacidades adicionais de processamento por modelagem fotográfica e formação de estruturas com múltiplos polímeros. Utilizamos esses procedimentos em nosso laboratório para estudar interações e infiltrações de células HMSE em scaffolds de ácido hialurônico. Também empregamos essas técnicas com diversos outros polímeros para estudar tecidos reforçados por fibras, como o menisco e o miocárdio.

Então vamos começar. Prepare uma solução a 0,5% em peso do fotoiniciador I 2 9 5 9 ou I 2 9 5 9 em água desionizada, dissolvendo-a a 37 graus Celsius por vários dias.

Uma cura é utilizada se um polímero fotoreativo for necessário para a eletrofiação. Para preparar a solução de eletrofiação, combine as concentrações finais em água desionizada: 2% em peso de ácido hialurônico metilado ou MEHA, 3% em peso de poli(óxido de etileno) ou PEO e 0,05% em peso de solução de I 2 9 5 9; vortexie por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Para dissolver a solução, transfira-a para uma seringa e fixe uma agulha de calibre 18, com seis polegadas de comprimento e ponta romba, na extremidade.

Em seguida, utilize uma bomba de seringa e configure-a para ejetar a uma taxa de 1,2 mililitros por hora. Insira a agulha do motor da seringa na bomba de seringa. Conecte o cabo terra de uma fonte de alta tensão ao aparato de coleta.

Neste procedimento, utilizaremos um mandril girando a cerca de 10 metros por segundo. Para coletar fibras alinhadas, conecte o cabo carregado positivamente à agulha e ajuste a agulha ou o dispositivo coletor de modo que haja uma distância de 15 centímetros entre os dois. Inicie o fluxo da bomba de seringa e, quando o fluido for visualizado na ponta da agulha, ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 22 quilovolts.

Colete as fibras sobre o suporte até atingir a espessura desejada. O tempo de coleta depende da espessura desejada e do volume da solução de eletrofiação utilizada. Para a fotopadronização, utilizamos membranas eletrofiadas giradas por 16 horas.

Remova o suporte do aparelho de coleta após a conclusão da coleta e armazene-o sob vácuo durante a noite para remoção completa do solvente. Corte amostras de cinco milímetros por cinco milímetros da malha do suporte com tesoura. Coloque cada suporte sobre uma lâmina de vidro revestida com folha de alumínio para preparar para a reticulação e posicione a máscara fotográfica diretamente sobre o suporte, cobrindo com uma lâmina de vidro limpa e prendendo ambas as extremidades da lâmina com clipes de papel.

Usando uma câmara de nitrogênio, purgue o andróide para inibir a redução da reticulação devido à exposição ao oxigênio. Coloque o conjunto do andróide na câmara de nitrogênio sob luz de 365 nanômetros com aproximadamente 10 miliwatts por centímetro quadrado, utilizando um adaptador colimador, durante cinco minutos. Remova cada andróide e coloque em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.

Adicione dois mililitros de água desionizada em cada poço. Realize o perfilhamento da placa para evitar a aberração de EVA da água e coloque a 37 graus Celsius por 24 horas. Troque a água a cada oito horas utilizando uma pipeta a vácuo para aspirar a água desionizada do poço entre as lavagens.

Prepare uma solução a 5% em peso de PEO em etanol a 90% em uma placa aquecedora. Agite a 700 RPM a 50 graus Celsius por pelo menos duas horas antes do procedimento. Após a agitação, adicione DPI para uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.

Transfira a solução de PEO e DPI para uma seringa de três mililitros e envolva-a com folha de alumínio para protegê-la da luz. Em seguida, prepare a solução de eletrofiação descrita na segunda seção e adicione metóxi etil biocarbono mol rod domine B para uma concentração final de 25 micromolar, pipetando com micropipeta para uma seringa de três mililitros. E envolva com folha de alumínio para protegê-la da luz.

Use com cuidado fita adesiva para fixar as bordas de lamínulas de vidro metiladas de 22 milímetros por 22 milímetros à superfície do mandril, de modo que as lamínulas se ajustem ao redor da circunferência do mandril. Usando um pedaço de tubo de silicone de cinco milímetros de comprimento, conecte uma extremidade a uma das seringas com conexões tipo luer lock. Conecte a outra extremidade a uma agulha, insira a seringa na bomba de seringa e passe a agulha através do orifício no ventilador.

Os ventiladores traduzem o comprimento do mandril e são usados para garantir uma distribuição igual dos dois polímeros na estrutura resultante. Certifique-se de que as pontas das agulhas estejam centralizadas no mandril para a seringa contendo MEHA. Posicione a ponta da agulha a 15 centímetros do mandril e ajuste o ventilador a uma distância de seis centímetros da ponta da agulha.

Configure a bomba de seringa para fornecer 1,2 mililitros por hora e ajuste a fonte de alimentação para 22 quilovolts. Monte a seringa com PEO exatamente da mesma maneira, mas posicione a ponta da agulha a 10 centímetros do mandril e ajuste a fonte de alimentação para 15 quilovolts. Em seguida, desligue as luzes e ligue o mandril e as bombas de seringa.

Remova o papel alumínio das seringas quando o fluido for visível nas pontas de ambas as agulhas. Ligue simultaneamente as fontes de alimentação e conecte os ventiladores quando a coleta estiver concluída. Desligue as fontes de alimentação e o mandril e desconecte cuidadosamente os ventiladores.

Remova as lamínulas e a fita usando uma lâmina de barbear. As fibras podem ser visualizadas em um microscópio de fluorescência equipado com filtros para rumina e dpi. Coloque cada lamínula com o polímero eletrofiado fixado em um poço individual de uma placa de seis poços.

Placa de poços Incube as estruturas em dois mililitros de PBS durante a noite para garantir a remoção completa do solvente e contaminantes. Após 24 horas, utilize vácuo para aspirar o PBS dos poços e coloque as estruturas sob uma lâmpada UV germicida em uma cabine de fluxo laminar por 30 minutos. Para esterilização, realize o cultivo celular padrão e prepare uma suspensão celular concentrada na densidade celular desejada.

Por exemplo, utilize 100 mililitros de suspensão celular para um lamínula de 22 por 22 milímetros. Incube por uma hora. Adicione a quantidade apropriada de meio de cultura celular a cada um.

Coloque novamente os andamios no incubador. Revele as células utilizando um kit comercialmente disponível de células vivas e mortas da Invitrogen para visualizar as células e fibras usando um microscópio fluorescente equipado com filtros para trissy e fitzy, conforme esperado. Andamios coletados em uma placa plana aterrada produzem fibras distribuídas aleatoriamente, enquanto andamios coletados em um mandril rotativo.

Produza fibras alinhadas ao serem visualizadas por microscopia eletrônica de varredura durante a reticulação fotossensibilizada do suporte; posicionamos uma máscara fotográfica entre o suporte e a fonte de luz após a imersão do suporte em água desionizada contendo ha não reativo. As áreas protegidas da luz e do PEO são removidas, e observamos a formação de macroporos, evidente pela coloração fluorescente. A eletrofiação simultânea dos jatos de MEHA e PEO resulta em um suporte compósito contendo populações distintas de fibras compostas pelos polímeros individuais.

Os HMCs parecem interagir positivamente com as fibras. Eles não apenas permanecem viáveis, como evidenciado pela coloração verde, mas também parecem se orientar de forma a alinhar-se ao longo das fibras vermelhas. Acabamos de mostrar como produzir por eletrofiação escafolds de fibras para engenharia de tecidos.

Também introduzimos capacidades adicionais, como a criação de padrões fotográficos e a eletrofiação de múltiplos polímeros. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de otimizar os parâmetros de eletrofiação de cada polímero para formar fibras uniformes antes de tentar quaisquer experimentos adicionais. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.