Name: Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a isolar e purificar neurônios periféricos de Drosophila usando classificação por beads magnéticos. Este método rápido permite obter populações altamente purificadas para análises de RNA e estudos de neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para o apoio desta pesquisa (DNC) e do Gabinete do Reitor da Universidade George Mason da (EPRI).

Comentários gerais sobre classificação Bead Magnética de Neurônios Drosophila periférica (tempo total para a Conclusão do Protocolo: 2,5-3 horas) Procedimentos de laboratório padrão para manter um ambiente limpo e livre de RNAse devem ser observados em todos os momentos para prevenir a degradação do RNA. Quando a Drosophila cutícula larval é dissecada e colocada no buffer de células dissociação, os neurônios periféricos são uma das células último a destacar do cutícula. Nós exploramos esta propriedade e projetado este protocolo para remover a maior parte das células não-específicas da cutícula, como músculo e gordura antes de isolar os neurônios da. Com a prática, o protocolo de toda pode ser concluída com êxito em aproximadamente 2,5 horas. A preparação de contas revestidas de anticorpo deve ser concluída antes do experimento começa. 1. Preparando esferas magnéticas para Células Encadernação: Esta etapa deve ser concluída antes do início do experimento. As contas preparadas podem ser preparados e armazenados a 4 ° C até ser necessário. <ol><li> Lavar 100 l de contas Dynabeads M-280 Estreptavidina revestido três vezes em PBS pela ressuspensão em 500 mL de PBS fresco e peletização-lo em um campo magnético forte a cada vez. </li><li> Finalmente voltar a suspender as contas diretamente em 100 ul de undiluted biotinilado anticorpo anti-mouse-CD8a rato (concentração de anticorpos é 100 mg / ml). </li><li> Incubar a mistura por 1 hora no gelo com vórtex leve ocasional para evitar sedimentação. [1 mL de Dynabeads M-280 pode ligar 0,05-0,10 mg de anticorpo biotinilado]. </li><li> Lave a mistura do grânulo-anticorpo três vezes como descrito no passo 1.1 para remover o excesso de anticorpo. O esferas magnéticas são agora revestidas com anticorpos e pronto para ser usado. Armazenar a mistura do grânulo-anticorpos em 100 l de 1X PBS a 4 ° C até o uso. </li></ol> 2. Selecionar e lavar Larvas: (10-15 minutos) <ol><li> Escolha 30-50 anos combinados larvas de terceiro estádio e colocá-los em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml com 1-1,2 ml de fosfato 1X Buffered Saline (PBS). (3-5 minutos) </li><li> Fechar o tubo e vortex-lo no ajuste máximo três vezes por 1 segundo cada. </li><li> Usando um fogo-polido pipeta Pasteur desprezar o sobrenadante completamente. Repita a lavagem (2.1) e vortex (2.2) passos 3-4 vezes até que o sobrenadante é visivelmente clara de todas as partículas de alimentos e detritos. </li><li> Brevemente repetir a lavagem com 1 ml de etanol 70% e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar as larvas duas vezes com 1 ml de ddH2O e desprezar o sobrenadante. </li><li> Brevemente repetir a lavagem mais uma vez com 1 ml de RNase-AWAY e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar as larvas três vezes em 1 ml de ddH2O para assegurar a remoção completa de RNase-AWAY. </li></ol> 3. Dissecção: (10-12 minutos) <ol><li> 12/10 larvas lugar no centro de uma placa revestida 35 milímetros Sylgard Petri. Posicioná-los um pouco longe um do outro. [Passo Crítico: Descarte qualquer larvas que não parecem estar no estágio apropriado de desenvolvimento] </li><li> Cortado a ponta anterior das larvas usando um par de tesouras de dissecação muito bem para todas as larvas. </li><li> Usando um par de maçante Dumont No. 5 fórceps inverter as larvas de dentro para fora. Inserir uma pinça dentro da cutícula larval todo o caminho até o fim posterior. Aperte as pontas das pinças juntos para agarrar a extremidade posterior da cutícula (Figura 1a) (tente pressionar a cutícula para baixo na superfície Sylgard para tornar mais fácil). Usando o segundo par de fórceps, empurre a cutícula larval dentro para fora. [Passo Crítico: Tente praticar este método algumas vezes antes de tentar a experiência de isolamento de células. Tentar obter as larvas totalmente invertido, para garantir que todos os tecidos moles são expostos à solução para a dissociação fácil.] </li><li> Depois de dissecar as larvas 3-4, transferi-los imediatamente ao fresco, gelada PBS (colocar o tubo no gelo) em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml. </li><li> Repita os passos 3,1-3,4 até que todas as larvas necessários são recolhidos (30-40 larvas neste protocolo). [Passo Crítico:. Antecipar 10-20% de perda durante a dissecção e dissociação, e decidir em conformidade] </li></ol> 4. Remoção de vagamente aderente não-específicos de células: (2-3 minutos) [Este passo ajuda a compensação de vagamente aderente não-específica tecidos, tais como corpos gordos e CNS.] <ol><li> Pegue o tubo de microcentrífuga 1,6 ml contendo as cutículas invertida larval e substituir o sobrenadante, com cerca de 700-800 mL de doce gelada PBS. </li><li> Pulso vortex-o tubo de microcentrífuga 5 vezes (3 segundos por pulso) em plena velocidade. </li><li> Desprezar o sobrenadante e substituí-la por cerca de 700-800 mL fresco, gelada PBS. </li><li> Repita os passos 4.2 e 4.3 três vezes. </li><li> Resuspend as cutículas larval em 400 mL de fresco, gelada PBS </li></ol> 5. Dissociar o tecido em uma suspensão única célula: (18-20 minutos) [Passo Crítico: Over-dissociação pode causar a perda do marcador de superfície celular, levando à produção de células pobres e viabilidade celular baixa. O tecido larval pode ser dissociada por qualquer dissociação mecânica (ultra-som, douncing), dissociação enzimática (tripsina, colagenase, etc) ou uma combinação de ambos. Como estes tecidos larval são difíceis de dissociar, descobrimos que uma combinação de ambos dissociação mecânica e enzimática rendeu os melhores resultados.] <ol><li> Adicione 1,5 mL de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 unidades nsch W / frasco) para a cutícula larval suspensos em 400 mL de PBS. </li><li> Vortex a solução 2-3 vezes para cada um segundo a configuração máxima (Isto deve remover as células frouxamente aderente da cutícula na solução). </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente (22-25 ° C) por 5 minutos. [Passo Crítico: O tempo de incubação afeta grandemente a eficiência de classificação final, celular. O tempo de incubação recomendado deve ser suficiente para soltar o tecido. Não exceder 15 minutos.] </li><li> Pulso vortex-tubo 20-30 vezes em configurações máximas de 2 segundos por pulso em plena velocidade. Isto deve libera o músculo e outros tecidos para a solução. Inspecionar uma pequena amostra da solução em uma fluorescente estereomicroscópio em cada etapa. (Com a experiência deve ser capaz de determinar o nível de dissociação, observando o tubo de microcentrífuga diretamente sob uma fluorescência habilitado estereomicroscópio) </li><li> Lavar as cutículas larval 2-3 vezes com peixe fresco e gelado PBS e, finalmente, ressuspender-los em 500 mL de doce gelada PBS, contendo BSA 1%. </li><li> Para evitar a cutícula larval adere à superfície de vidro do moedor 2 ml Kontes tecido e um pilão grande folga, revestimento de pré-o moedor de tecido e com um pilão BSA 1% em solução PBS e depois de um breve lavar descartar a solução BSA. Posteriormente, usando um fogo-polido Pasteur pipeta, transferir as cutículas do passo 5.5 para o moedor de tecido revestido BSA. [Passo Critical: Pré-cool moedor do tecido / pilão, colocando-o no gelo por alguns minutos para evitar danos às células / lise]. </li><li> Dounce o tecido com pinceladas lenta e constante, evitando a formação de espuma (aproximadamente 20-30 AVC). [Passo Crítico:. Dounce lenta e progressivamente, caso contrário, as células podem lisar] </li><li> Para avaliar os níveis de células dissociação, limpe a parede externa do moedor de tecido com um tecido Kimwipe limpa, e inspecione-a sob um fluorescentes estereomicroscópio. Os neurônios deveria ter separado da cutícula, e pode ser visto na solução. Se este for encontrado para ser difícil, alternativamente pipeta uma pequena amostra da solução, e observá-la sob um fluorescentes estereomicroscópio. Uma boa indicação de célula de dissociação é a ausência de neurônios a partir da cutícula larval. No entanto, se um ainda observa os neurônios ligados à cutícula, ou observa células incompletamente dissociados, Dounce ainda mais até que as células alcançar uma suspensão única célula. </li><li> Triturar a solução 5 vezes com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 50% do diâmetro da ponta standard, seguido por 10 vezes, com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 25% do diâmetro da ponta padrão. [Passo Crítico: trituração Forceful pode danificar as células. Monitorar as células entre as etapas, e ajustar o procedimento de acordo]. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de células 30 mm e recolher o filtrado de células em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml. A solução resultante deve consistir de uma única célula de suspensão e está agora pronto para separação de células magnéticas. </li></ol> 6. Separação de células magnéticas Bead: (45 - 75 minutos, dependendo do tempo de incubação de anticorpos) <ol><li> Adicionar 15 mL de anticorpo esferas magnéticas revestidas a 500 mL de suspensão de células (passo 5.10). Os restantes anticorpo conjugado esferas magnéticas podem ser armazenados até ser necessário para isolamentos de células subseqüentes. </li><li> Incubar as células com o anticorpo esferas magnéticas revestidas por 30-60 minutos em gelo, com ocasionais hand-mistura. [Passo Crítico: Incubação a uma temperatura mais alta ou mais tempo pode resultar em ligação não específica de anticorpos.] </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga em um campo magnético forte por 2 minutos. Todas as células positivamente selecionado junto com miçangas unbound vai separar para o lado do tubo. </li><li> Pipeta lentamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Lave as células 3-4 vezes em fresco, gelada PBS para remover qualquer remanescentes não-específicos de células. </li><li> Ressuspender as células em 30 mL de fresco, gelada PBS. </li><li> Para a pureza e rendimento aproximado de células, pipetas mL 5 da susp celularension na superfície polida de um hemocitômetro e contar todas as células visíveis fluorescente sob a fluorescente estereomicroscópio. Também verificar a quantidade de células não-fluorescentes e todos os sinais de impurezas. Tipicamente, a amostra será altamente enriquecido para as células fluorescentes. </li></ol> 7. Isolamento de RNA Bead Magnética Células Ordenado: (60 - 75 minutos) <ol><li> Após a contagem, agregar as células em um campo magnético, desprezar o sobrenadante e adicionar 20 mL de tampão de extração do RNA ™ PicoPure Isolation Kit (dispositivos Molecular). Dependendo do número de células pode-se necessário acrescentar um maior volume de tampão de extração. </li><li> Vortex do tubo a uma velocidade máxima de permitir a mistura de pellet celular com tampão de extracção. </li><li> Incubar o tubo a 42 ° C por 30 minutos. </li><li> Para assegurar a remoção das esferas magnéticas antes da purificação da coluna do RNA (veja o passo 7.5), o tubo é centrifugado brevemente em 2000 (x) g por 2 minutos para agregar as esferas magnéticas. O tubo é então colocado em um campo magnético forte para manter o sedimento, eo sobrenadante é transferido para um tubo de microcentrífuga novo. </li><li> Extrair e purificar o RNA coluna de acordo com as instruções do fabricante PicoPure RNA kit de extração. Tratamento DNAse é opcional, e pode ser realizada na coluna durante a purificação RNA de acordo com a exigência de análise. Finalmente, eluir o RNA ligado total em um volume pequeno (11-30 mL) de tampão de eluição e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. Se desejar uma alíquota de 1 ml pode ser usado para avaliar a qualidade do RNA total em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Resultados representativos: Classificação grânulo magnético foi usado para isolar Drosophila da neurônios (Figura 1). O RNA purificado destas neurônios isolados da (Figura 2a) foi encontrado para ser de excelente qualidade, como indicado pela presença de 5.8S afiada, 18S e 28S ribossomal RNA picos quando analisado em um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). Começando com 30-40 larvas de terceiro estádio fomos capazes de isolar em média 300-500 neurônios classe IV da usando o driver ppk-GAL4 e 1500-2000 neurônios da (Classe I, II, III e IV), utilizando o pan- da neurônio-específica GAL4 21-7 driver. Para avaliar o enriquecimento neuronal específico de nossas células isoladas foi realizada quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR) usando dois genes específicos neuronal marcadores (elav e futsch). Essas análises revelaram enriquecimento vezes significativo de genes tanto marcador indicando um enriquecimento altamente específico para neurônios da em relação ao fluxo através da utilização de nosso protocolo (Figura 3). Finalmente, o RNA isolado de ambos os pan-da neurônios e os neurônios de classe IV da era usado para realizar perfil de expressão transcricional em Drosophila melanogaster microarrays Agilent todo o genoma oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estas análises identificaram numerosas reguladores previamente implicado da morfogênese da dendrito do neurônio, além de um amplo espectro de moléculas já descaracterizados e vias de sinalização de transdução de putativos que desempenham importantes papéis funcionais no desenvolvimento da neurônio. Estudos destinados a avaliar o papel potencial (s) destas moléculas anteriormente descaracterizados na mediação da desenvolvimento dos neurônios, e morfogênese especificamente dendrite, estão atualmente em andamento. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Esquemática da classificação grânulo magnético dos neurônios da Drosophila (a) Idade combinado larvas de terceiro estádio que ostenta a da neurônio-específica GAL4, UAS-mCD8-GFP repórter transgene são dissecados, invertendo a cutícula larval de dentro para fora, para expor o PNS à dissociação buffer e conservado em gelo frio PBS. (b) dissociação enzimática é realizada através da adição Liberase Blendzyme 3 para a solução contendo cutícula larval. (c) Os tecidos larval são mais dissociadas por uma combinação de trituração vórtex e douncing para retirar não-tecidos especificamente rotulados como fat-corpos intestino, e do SNC. (d, e) As células são, então, filtrada usando um filtro de células 30 mM. A solução contém uma suspensão de células individuais de diferentes tipos celulares, incluindo epitélio musculares e neurônios. (F) Anti-rato CD8a anticorpos revestido Dynabeads M-280 são adicionados à suspensão celular, e incubado em gelo por 30-60 minutos. ( g) As esferas magnéticas se liga aos neurônios da que estão expressando um rato CD8 tag proteína de fusão GFP. (h, i) O grânulo magnético revestido células são separadas por colocar a solução em um forte campo magnético. O sobrenadante é descartado, e as células são lavadas três vezes para remover qualquer resíduo não-específicos de células, resultando em (j) highly purificada populações de neurônios da. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) Representante da imagem positivamente selecionado, GFP fluorescente neurônios classe IV da célula isolada por dissociação e classificação grânulo magnético. A população de neurônios, resultando estava determinado a ser altamente enriquecido para os neurônios de classe IV da com pouca ou nenhuma célula de impurezas contaminantes. (B) Um Agilent 2100 Bioanalyzer electroferograma (Agilent Technologies, Inc.) de RNA total isolado de grânulo magnético neurônios classificadas da , mostrando uma excelente qualidade de RNA total, como indicado pela presença de 5.8S, 18S, 28S e rRNAs. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: qRT-PCR análise de expressão gênica em marcador neuronal isolada da neurônios (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) eo fluxo através de fração foi realizado em triplicata. Os níveis de expressão dos dois genes neuronal específica marcador (elav e futsch) foram avaliados por qRT-PCR. Valores obtidos a partir dessas análises foram normalizados para o controle endógeno (rp49), e os níveis relativos aos observados no fluxo através fração foram calculados usando o método ΔΔCτ 6. Ambos elav e futsch foram significativamente enriquecido no isolado da população de neurônios, em comparação com o fluxo através de fração. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Representante de classe IV da Cy3 neurônio-específica rotulados microarray arquivo de imagem. Mostrada aqui é um Agilent Drosophila melanogaster todo o genoma oligo microarray (4 x 44K) hibridizados com Cy3-labeld RNA total isolado de neurônios de classe IV da classificação purificado por grânulo magnético. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 4.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o isolamento e purificação de neurônios periféricos que aderem firmemente à superfície interna do estádio terceiro Drosophila cutícula larval usando uma estratégia de triagem magnética talão celular. Embora tenhamos utilizado este protocolo especificamente para isolar neurônios da Drosophila, aplicações deste protocolo para o isolamento de outros tipos de células que se aderem à cutícula larval ou na fase de pupa de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, muscular, outros n...

Equipamento <ul><li> (10) ímãs de neodímio bloco (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativamente DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) podem ser usados. </li><li> Kontes Grinder tecido de vidro, 2 ml de capacidade de trabalho, com pilão grande folga (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtros de celular, por exemplo, MACS Pré-Separação Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 milímetros petri pratos revestido com Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Ferramentas de dissecação: dois pares de fórceps Dumont n º 5 (Ferramentas Ciência Fine, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera micro-tesoura de dissecção (Ferramentas Ciência Fine, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) com pontas </li><li> Hemocitômetro padrão para contar as células e pureza estimativa </li><li> Pipetas Pasteur com pontas de fogo polido de diâmetro padrão, diminuiu para ~ 50% do diâmetro normal e reduzido para ~ 25% do diâmetro padrão para trituração </li><li> Tabela centrífuga micro-top (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscópio (a MZ16FA Leica foi usado neste protocolo) </li></ul>

isolamento e purificação de drosophila neurônios periféricos por classificação bead magnética

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema nervoso periférico (PNS) é um poderoso modelo para investigar os processos complexos de desenvolvimento neuronal e morfogênese dendrite a nível funcional e molecular. Para auxiliar nestas análises, temos desenvolvido uma estratégia para o isolamento de uma subclasse de neurônios chamado PNS arborização dendrítica (da) neurônios que têm sido amplamente utilizados para estudar a morfogênese dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Esses neurônios são muito difíceis de isolar como uma população pura, em parte devido à sua ocorrência extremamente baixa e sua difícil de alcançar localização abaixo da cutícula quitinosa resistente larval. Nosso método recém-desenvolvido supera estes desafios, e é baseado em uma célula de enriquecimento rápido e específico utilizando anticorpos revestido esferas magnéticas. Para os nossos estudos de triagem magnética talão, temos utilizado pareados por idade larvas de terceiro estádio expressar um rato CD8 proteína de fusão com a tag GFP (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sob o controle tanto da arborização dendrítica classe IV (da) neurônio-específica<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Ou o controle da pan-da GAL4 neurônio-específica<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Embora este protocolo foi optimizado para isolar PNS células que estão ligados à parede interna da cutícula larval, variando alguns parâmetros, o mesmo protocolo pode ser usado para isolar muitos tipos de células diferentes ligados à cutícula nas fases larval e pupal de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, músculo, oenocytes etc), ou outros tipos de células de órgãos larval, dependendo do padrão de expressão GAL4 driver específico. O RNA isolada por este método é de alta qualidade e pode ser facilmente usado para jusante análises genômicas, tais como gene microarray estudos de perfil de expressão. Esta abordagem oferece uma nova e poderosa ferramenta para realizar estudos sobre isolado<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendríticas arborização (da) neurônios proporcionando conhecimentos novos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à morfogênese dendrite.

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios periféricos usando um jejum magnética estratégia de triagem talão assistida celular. RNA obtido a partir de células isoladas podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo análises microarray.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

O sistema nervoso periférico (SNP) da Drosophila é um modelo poderoso para investigar os processos complexos do desenvolvimento neuronal e da dendrite...

Larvas de Drosophila portando um transgene repórter de fusão GFP específico de neurônio CD8 são usadas para isolar neurônios DA. As larvas são dissecadas invertendo-se o tegumento para fora, expondo o sistema nervoso periférico. As larvas invertidas são submetidas à dissociação enzimática, seguida por dissociação mecânica por meio de vortex, ativação e downing.As células são então filtradas para obter uma suspensão simples contendo principalmente epitélio, músculo e neurônios. Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são adicionadas à suspensão celular, onde se ligam aos neurônios que expressam a proteína de fusão GFP marcada com CD oito. Por fim, os neurônios revestidos com esferas magnéticas são isolados colocando a solução em um campo magnético forte, resultando em populações altamente purificadas de neurônios.Olá, sou Dan Cox do Departamento de Biologia Molecular e Microbiologia do Instituto Krasno para Estudos Avançados na Universidade George Mason. Olá, sou Ish AER do laboratório do Dr. Dan Cox. Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento e purificação de neurônios periféricos de DLO por separação magnética com microesferas.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os mecanismos moleculares que regulam a morfogênese específica da classe e correta. Então, vamos começar. Para iniciar este procedimento, selecione 30 a 50 larvas de terceiro estágio com idades correspondentes e coloque-as em um tubo microfuga de 1,6 mililitro contendo de 1 a 1,2 mililitros de 1 XPBS.Feche o tubo e vortexe-o na configuração máxima três vezes, durante um segundo cada vez. Utilizando uma alça de vidro flamejada, descarte completamente o sobrenadante. Adicione um mililitro de PBS e repita as etapas de lavagem e vortexagem três vezes até que o sobrenadante esteja visivelmente livre de partículas de alimento e detritos.Repita brevemente a lavagem com um mililitro de etanol a 70%. Em seguida, lave as larvas duas vezes com um mililitro de água duplamente destilada. E, finalmente, repita a lavagem mais uma vez com um mililitro de R nase away e três vezes com um mililitro de água duplamente destilada para remoção completa do RNA away. As larvas estão agora prontas para a dissecação.Coloque 10 a 12 larvas no centro de uma placa de Petri de 35 milímetros revestida com guarda de silício. Posicione-as levemente afastadas umas das outras e descarte qualquer larva que não pareça estar no estágio de desenvolvimento apropriado. Em seguida, use um par de tesouras finas de dissecação para abrir a extremidade anterior das larvas usando um par de pinças rombas Dumont.Número cinco, pinça. Vire as larvas do avesso. Comece inserindo uma pinça dentro da cutícula larval até a extremidade posterior.Aperte as pontas da pin&ccedil;a para segurar a extremidade posterior da cut&iacute;cula. Pressionar a cut&iacute;cula contra a superf&iacute;cie do suporte de s&iacute;lica facilita o procedimento. Usando o segundo par de pin&ccedil;as, empurre a cut&iacute;cula larval para dentro, virando-a ao avesso.Certifique-se de que as larvas estejam completamente invertidas, de modo que todos os tecidos moles fiquem expostos à solução para facilitar a dissociação. Pratique este procedimento algumas vezes antes de tentar dissociar as células. Após dissecar três a quatro larvas, transfira-as imediatamente para PBS fresco e gelado em um tubo de microcentrífuga.Repita até que as 30 a 40 larvas necessárias sejam coletadas antes de prosseguir com a remoção de células não específicas. Tenha em mente que uma perda de 10 a 20% durante a dissecação e associação é esperada agora que todas as larvas foram dissecadas. Remova os tecidos não específicos fracamente aderidos, como corpos de gordura e células do sistema nervoso central.Substituindo o sobrenadante do tubo contendo as cutículas larvais invertidas por 700 a 800 microlitros de PBS fresco e gelado. Por fim, pulse. Vortexe o tubo microfuga cinco vezes durante três segundos por pulso, em velocidade máxima.Em seguida, despreze o sobrenadante e substitua-o por aproximadamente 700 a 800 microlitros de PBS fresco gelado. Repita este passo três vezes e, por fim, re-suspenda as cutículas larvais em 400 microlitros de PBS fresco gelado.PBS frio antes de passar para a dissociação das células a fim de isolar os neurônios larvais de arborização dendrítica ou da. Utilize uma combinação de dissociação enzimática e mecânica. Cuidado com a superdissociação, que pode causar a perda do marcador de superfície celular, levando a baixo rendimento celular e baixa viabilidade celular.Inicie a dissociação adicionando 1,5 microlitros de uma x liase zyme três a 28. Uma vez unidades por frasco às cutículas larvais suspensas em 400 microlitros de PBS. Vortexe a solução de duas a três vezes por um segundo cada vez, no ajuste máximo, para remover as células fracamente aderentes das cutículas para a solução.Em seguida, incubar a solução à temperatura ambiente por cinco minutos. Como o tempo de incubação afeta grandemente a eficiência final de separação celular, não exceder 15 minutos ao final do pulso de incubação.Vortexie o tubo de 20 a 30 vezes em velocidade máxima, com pulsos de dois segundos cada. Isso deve liberar o músculo e outros tecidos não específicos na solução. Examine a amostra periodicamente sob um microscópio estereoscópico com fluorescência para determinar se os neurônios periféricos ainda estão aderidos à cutícula.Inspecione uma pequena amostra da solução observando diretamente o tubo de microcentrífuga em um microscópio estereoscópico com fluorescência para determinar o grau de dissociação. Continue fazendo isso a cada etapa da dissociação, interrompendo a vórtex logo antes de os neurônios periféricos começarem a se dissociar da cutícula e entrarem na solução. Lave brevemente as cutículas larvais com duas a três trocas de um mililitro cada de PBS fresco gelado.E, finalmente, re-suspenda-os em 500 microlitros de PBS fresco e gelado contendo 1% de BSA para continuar com a dissociação mecânica das células. Use um triturador de tecidos de dois mililitros com pistilo de grande folga e solução de 1% de BSA em PBS. Após uma breve lavagem, descarte a solução de BSA.Isso impedirá que as cutículas larvais aderem às superfícies de vidro. Em seguida, pré-resfrie o triturador de tecidos e o pistilo colocando-os em gelo por alguns minutos, a fim de evitar danos celulares ou lise. Em seguida, use uma pipeta com a ponta polida ao fogo para transferir as cutículas para o triturador de tecidos.Agora, homogenize o tecido com movimentos lentos e constantes, evitando formação de espuma, por aproximadamente 20 a 30 movimentos. Certifique-se de homogeneizar lentamente e de forma constante. Caso contrário, as células podem lisear.Para avaliar os níveis de dissociação celular, limpe a parede do triturador de tecidos com um lenço de papel limpo e inspecione ao microscópio estereoscópico fluorescente. Os neurônios devem ter se destacado da cutícula e podem ser vistos na solução. Um bom indicativo de dissociação celular é a ausência de neurônios na cutícula larval.No entanto, se ainda se observar neurônios aderidos à cutícula ou observar em células completamente dissociadas, continue a dissociação mecânica usando uma pipeta com ponta polida ao fogo, reduzida a aproximadamente 50% do diâmetro padrão da ponta, pipetando a solução cinco vezes, seguido por dez vezes com uma pipeta com ponta polida ao fogo.Reduza para aproximadamente 25% do diâmetro padrão da ponta. Observe que uma manipulação vigorosa pode danificar as células. Monitore as células entre os passos e ajuste o procedimento conforme necessário.Finalize filtrando a solução através de um filtro de células de 30 micrômetros e colete o filtrado celular em um tubo microfuge de 1,6 mililitro. A solução resultante deve consistir em uma suspensão de células simples e está agora pronta para a separação magnética de células. Esferas magnéticas revestidas com um anticorpo anti CD oito.Foram preparadas conforme descrito no protocolo escrito anexo e os neurônios DA expressam uma proteína de fusão CD oito GFP direcionada pelo anticorpo. Inicie a classificação celular adicionando 15 microlitros de microesferas magnéticas revestidas com anticorpo a 500 microlitros de suspensão celular. Incube as células com as microesferas magnéticas revestidas com anticorpo por 30 a 60 minutos no gelo, com mistura manual ocasional; a incubação em temperatura mais alta ou por tempo mais longo pode resultar em ligação não específica do anticorpo.Em seguida, coloque o microtubo em um campo magnético forte por dois minutos. Todas as células positivamente selecionadas, juntamente com as microesferas não ligadas, aderirão à parede do tubo; aspire lentamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e lave as células de três a quatro vezes com PBS fresco e gelado. Este passo remove quaisquer células remanescentes não específicas.Por fim, ressuspenda as células em 30 microlitros de PBS fresco e gelado para estimar a pureza e o rendimento das células. Pipete cinco microlitros da suspensão celular sobre a superfície polida de um hemocitômetro e conte todas as células fluorescentes visíveis sob um microscópio estereoscópico de fluorescência. Verifique também a quantidade de células não fluorescentes e quaisquer sinais de impurezas.Normalmente, a amostra será altamente enriquecida com células fluorescentes. Por fim, utilize o kit de isolamento de RNA pico puro para isolar o RNA das células ligadas às microesferas. Adicione o tampão de extração às células classificadas, mas remova as microesferas usando um ímã antes da etapa de purificação em coluna; use um microlitro do RNA extraído para avaliar a qualidade total do RNA em um Agilent Bioanalyzer 2100.O RNA purificado dos neurônios DA isolados apresenta excelente qualidade, conforme indicado pela presença de picos nítidos de RNA ribossômico 5,8 s e 28 s ao ser analisado em um Bioanalisador Agilent 2100. Começando com larvas de 30 a 43 horas de idade, fomos capazes de isolar em média de 300 a 500 neurônios DA da classe quatro utilizando o driver PPK gal4, e de 1500 a 2000 neurônios DA das classes 1, 2, 3 e 4. Usando um driver gal4 específico para neurônios panda, a R-T-P-C-R quantitativa com L11 fch, que são marcadores específicos de neurônios, revelou um enriquecimento significativo em ambos, indicando um alto grau de especificidade no enriquecimento de neurônios DA com o protocolo que demonstramos, em comparação com o fluxo passante. Finalmente, o RNA isolado tanto de neurônios panda quanto de neurônios DA da classe quatro foi utilizado para realizar perfis de expressão transcricional em microarranjos oligonucleotídicos de genoma inteiro de Drosophila melanogaster da Agilent, identificando diversos fatores implicados na morfogênese de neurônios DA.Mostramos como isolar e purificar neurônios periféricos de drosófila por meio de separação magnética com microesferas a partir do estágio de terceiro instar do desenvolvimento larval. Ao realizar este procedimento, é importante equilibrar as etapas de dissociação enzimática e mecânica. Uma dissociação enzimática excessiva pode levar à degradação dos marcadores da superfície celular CD8, resultando em separação celular ineficiente ou falha.É igualmente importante manter condições livres de RNA durante todo o procedimento, a fim de preservar a integridade do RNA purificado dos neurônios isolados. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou...

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total...

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Este vídeo demonstra um método para isolar células oligodendrócitos primárias de uma suspensão de células neurais obtida de um filhote de camundongo usando separação magnética. A técnica emprega esferas magnéticas revestidas com anticorpos específicos para antígenos de oligodendrócitos, permitindo o isolamento seletivo dessas células.

Isolando oligodendrócitos primários murinos usando grânulos imunomagnéticos

Este vídeo demonstra um protocolo para extrair células microgliais de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos usando classificação magnética de células. O protocolo envolve a dissecação do tecido cerebral lesionado contendo células microgliais, o tratamento do tecido com enzimas específicas para obter uma suspensão unicelular e a utilização de esferas magnéticas específicas do receptor microglial para isolar as células microgliais.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Neurônios sensoriais específicos de órgãos são difíceis de identificar. O rastreamento Fast Blue é usado para identificar neurônios nodose que inervam as vias aéreas para classificação celular. Os neurônios nodose classificados são usados para extrair ácido ribonucleico (RNA) de alta qualidade para sequenciamento. Usando este protocolo, a expressão gênica de neurônios específicos das vias aéreas é determinada.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo de dissociação de célula para isolar eficientemente células presentes em baixa abundância dentro do sistema visual de Drosophila através de célula de fluorescência ativada classificação (FACS).

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Descrevemos um protocolo para isolar células microgliais do hipotálamo de camundongo (ou pequenas estruturas cerebrais equivalentes) usando classificação de células ativadas magneticamente (MACS), em um tempo relativamente curto. A microglia hipotalâmica classificada por MACS pode ser usada para análise ex vivo e pode ser plaqueada para realizar ensaios in vitro .

Isolamento da microglia hipotalâmica do cérebro de camundongo adulto recém-perfundido por classificação de células ativadas por magnetismo  

Aprenda a isolar e purificar neurônios periféricos de Drosophila usando classificação por beads magnéticos. Este método rápido permite obter populações altamente purificadas para análises de RNA e estudos de neurociência.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

Explorar mais vídeos