Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Meu nome é Kelly Shea e sou gerente do laboratório e também técnica de pesquisa no Laboratório Neilsen, o que é difícil porque muitas pessoas não sabem como distinguir as diferentes camadas teciduais. Então, o que você precisa fazer é essencialmente afastar todas as camadas teciduais para expor o embrião subjacente, que, neste momento, não é muito vascularizado. Por isso, é muito transparente e difícil de distinguir.

Use pinças e tesouras bastante grossas. A primeira coisa que você deve fazer é pinçar o animal ao redor da linha média e fazer um primeiro corte. A partir desse ponto, basta puxar a pele para os lados, expondo o abdômen do animal.

Há uma fina camada do peritônio que você vai levantar com a pinça e, em seguida, cortar com a tesoura e afastar para trás. Você deve cortar ao longo da linha média do animal e separar os dois cornos uterinos, que estão conectados no centro. Pode-se cortar diretamente na base.

Você provavelmente obterá muita gordura junto com ele. E retire todo o corneto uterino do animal. Coloque-o diretamente no PBS.

Então, isso está no chifre. Estes são os locais de implantação, 1, 2, 3, 4, 5. O que você deve fazer é apenas separá-los.

Você pode basicamente cortar entre os sítios de implantação bem aqui. Basta segurar o embrião em seu lado e, essencialmente, separá-lo. Neste momento, você está expondo o deum, que é um tecido mais esponjoso localizado abaixo.

Portanto, o embrião deve estar exatamente no meio, bem aqui. Este é o ápice do decíduo. Você deve orientá-lo voltado para cima, com o ápice para cima.

O que você vai acabar fazendo é cortar cerca de um quinto do caminho a partir do ápice. O embrião deve ficar exatamente no meio bem aqui. O que acabo fazendo é orientá-lo de lado, pegar um par de pinças e segurá-lo, mantê-lo pressionado com a outra, cortar a ponta e, em seguida, separá-lo.

Então, uma vez que a cápsula seja removida, coloque o embrião em sua borda. E como você pode ver, há uma abertura exatamente onde você removeu a cápsula. Basta inserir a pinça nesse local. Sim.

Neste momento, o embrião está muito solto dentro do deum. Uma vez que você abre o deum, praticamente pode removê-lo com relativa facilidade, desde que consiga se posicionar sob sua base. É muito pequeno.

Existem também alguns tecidos ainda aderidos ao embrião. Há o cone ectoplacentário, que está bem aqui no ápice do embrião. E também há alguns outros tecidos ainda aderidos.

Então, eu simplesmente pego a pipeta e o aspiro. Neste momento, você deseja fixar os embriões. Então, eu tenho apenas um recipiente com PFA.

Queríamos analisar genes candidatos. Basicamente, estamos utilizando técnicas de RNA in situ em preparações inteiras para visualizar a produção de ácidos nucleicos in situ dentro de um embrião. Esses genes específicos que nos interessam muito codificam marcadores putativos de precursoras de células germinativas e também são preditos para serem expressos no embrião de camundongo em um ponto temporal específico que auxilia no desenvolvimento e maturação das células germinativas a partir de precursoras putativas em células germinativas.

Um desses fatores que nos interessa muito em primeiro lugar, e o primeiro fator que realmente analisamos por hibridização in situ em preparações inteiras nesses embriões do dia 6,5, foi a proteína morfogenética óssea, ou BMP4. Trata-se de um membro da superfamília TGF-beta. É muito importante e absolutamente necessária na maturação das células germinativas.

E também é necessário que as células germinativas transloquem ao longo do embrião e se localizem próximas à estria primitiva do embrião. E a BMP-4 desempenha um papel fundamental tanto na sinalização quanto na maturação que as células germinativas precisam atravessar para se alojarem na estria primitiva. Portanto, você deve, em primeiro lugar, certificar-se de que sabe o que está procurando, conhece o seu tamanho reduzido, em que escala está trabalhando, e também sentar-se e planejar com muita atenção.

A técnica, especialmente com que tipo de microscópio estereoscópico você vai trabalhar. Uma das dificuldades técnicas é que isso envolve muita manipulação e movimentos de mão muito, muito firmes para que você não danifique o embrião. Portanto, você precisa de um microscópio estereoscópico com bastante espaço para manipulação, e também deve garantir que tudo o que for necessário para o experimento esteja previamente organizado, para que você não precise realizar mais manipulações do que o estritamente necessário durante a dissecação.

Portanto, além disso, acho que você precisa avançar muito devagar e remover camada por camada do tecido com muita calma, para saber exatamente com o que está lidando. E certifique-se de saber onde o embrião está posicionado.