Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Na primeira etapa deste procedimento de injeção, uma concentração de trabalho da solução de DNA é centrifugada em sedimento. As pipetas de injeção de material particulado fabricadas a partir de tubos capilares de vidro de silicato BO são então preenchidas com a solução de DNA. As células são colocadas na platina do microscópio e a visualização do núcleo da célula é otimizada.

A pipeta é alinhada com o núcleo e a célula é injetada. Várias células são injetadas em cada prato no dia seguinte. As células injetadas com sucesso são identificadas pela expressão de um gene repórter.

Olá, sou Van Mu do laboratório do Dr. Stephen Akeda no Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo dos Institutos Nacionais de Saúde. Eu sou Damien Williams, também do Akeda Lab. E eu sou Eugene, do laboratório AKEDA.

Hoje mostraremos o procedimento para a microinjeção INTERCLEAR de construções de CDNA em neurônios dissociados. Este é um método eficaz para a heteroexpressão de proteínas de interesse em células pós-mitóticas, que são tradicionalmente difíceis de transfectar. Usamos essa técnica em nosso laboratório para estudar os mecanismos subjacentes à modulação da proteína G dos canais N.

Então, vamos ter dentes escuros. Comece colocando neurônios de mamíferos adultos dissociados em placas de cultura de células revestidas com 0,1 miligrama por mililitro de poli L lisina de alto peso molecular. Isso ajuda na adesão dos neurônios à superfície inferior dos pratos.

Cilindros de clonagem de vidro podem ser usados para concentrar neurônios revestidos em uma área menor e mais confinada. Para minimizar a distância entre os neurônios a serem injetados. Coloque os pratos em uma incubadora a 37 graus Celsius por três a seis horas antes de realizar microinjeções intranucleares para permitir tempo suficiente para que as células adiram ao fundo dos pratos.

Enquanto os neurônios estão incubando, as pipetas de microinjeção são preparadas usando um extrator marrom flamejante Sutter P 97 e tubos capilares de vidro de silicato boro de paredes finas. Usamos um programa de tração de dois estágios com as seguintes configurações para puxar um e para puxar dois. Como as configurações necessárias variam de acordo com os diferentes lotes de vidro e de acordo com a condição do filamento de aquecimento no extrator, elas devem ser ajustadas conforme necessário.

Devem ser retiradas pelo menos cinco pipetas de injeção por prato de neurónios, caso as pipetas sejam danificadas ou se existam problemas durante a sessão de injeção. As pipetas de injeção puxadas devem ser armazenadas em um recipiente coberto para evitar que a poeira entre na ponta da pipeta de microinjeção imediatamente antes de os CDNAs de plasmídeo de injeção serem diluídos até a concentração de trabalho. Coloque um pequeno pedaço de paraforma na superfície de trabalho e remova o suporte de papel.

Adicione a solução estoque de CD NA e o tampão TE ao parâmetro. Para diluir o CD NA, recomendamos o uso de uma concentração final de CDNA inferior a 200 nanogramas por microlitro e um volume total entre dois e 10 microlitros. Se a proteína codificada pelo CD NA não for marcada, uma codificação de plasmídeo repórter, EGFP, por exemplo, pode ser co-injetada com o CD experimental NA.To confirmar a injeção e expressão bem-sucedidas, misture as soluções de CD NNA pipetando para cima e para baixo várias vezes no perfil.

Ter cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar para sedimentar quaisquer partículas na solução de cDNA que possam posteriormente bloquear a pipeta de microinjeção. Use uma ponta de pipeta microcarregadeira para transferi-la para um tubo de hematócrito preparado que foi limpo, cortado e selado em uma extremidade. Em seguida, coloque o tubo de hematócrito em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire por 15 a 30 minutos.

10.000 GS à temperatura ambiente. Quando a centrifugação estiver concluída, reserve o tubo que contém a solução de injeção de cDNA. A solução pode ser mantida à temperatura ambiente durante a sessão de injeção, uma a duas horas.

Após o revestimento das células, remova os cilindros de clonagem de vidro. Em seguida, retorne as células plaqueadas para a incubadora pelo restante do período de incubação antes da sessão de injeção. Para começar a injetar, primeiro, pegue um prato de neurônios revestidos da incubadora e coloque-o no estágio do microscópio de uma configuração de injeção.

A configuração consiste em um microscópio de contraste de fase invertida, um injetor de pressão conectado a um manipulador microm e um sistema de monitoramento de vídeo. Sob contraste de fase, os neurônios aparecem como células esféricas com um núcleo claramente visível como uma organela redonda central com uma membrana escura e podem conter um único ou vários nucléolos. Usando uma ponta de pipeta microcarregadeira, retire dois microlitros do CD NA preparado do tubo de hematócrito.

Tomando cuidado para evitar a solução perto do fundo do tubo, onde as partículas podem ter se depositado. Transfira a solução para uma pipeta de microinjeção. O filamento na pipeta de microinjeção deve ajudar a puxar a solução para a ponta.

Mas se pequenas bolhas de ar persistirem, sacuda suavemente a lateral do vidro para desalojá-las, certifique-se de que o suporte capilar do injetor de pressão esteja fixado em um ângulo de 45 graus. Em seguida, insira a pipeta de microinjeção no suporte capilar e prenda o suporte ao micromanipulador. Em seguida, abaixe a pipeta de microinjeção no prato usando o manipulador de micrômetros à medida que a pipeta entra no meio de cultura, forma-se um menisco que altera o caminho da luz através da amostra e, assim, reduz a qualidade da imagem dos neurônios.

Para aliviar esse problema, ajuste a torre de fase até que os núcleos dos neurônios estejam claramente visíveis. Antes de iniciar as injeções. Use a função de limpeza do sistema de injeção de pressão para limpar a pipeta de detritos e verificar a qualidade das pipetas de microinjeção.

A solução ejetada deve estar visível na tela. Ao usar esta função, o fluido de uma ponta de pipeta de tamanho ideal é ejetado como um jato fino. Se a pipeta de microinjeção estiver entupida ou muito estreita, ela não ejetará fluido quando a função de limpeza for usada.

Se a ponta for muito larga ou tiver sido quebrada, o fluido será ejetado da ponta como um fluxo largo. Se a ponta parecer abaixo do ideal durante as injeções, substitua a pipeta de injeção e centralize a pipeta de microinjeção no viewmonitor. Mantendo o núcleo em foco, abaixe a ponta da pipeta até que esteja em foco adjacente a um neurônio.

Defina esta posição como o limite inferior do eixo Z no micro manipulador. Esta posição é a profundidade para a qual a pipeta de microinjeção avançará durante as injeções. Em seguida, posicione a ponta aproximadamente 30 micrômetros acima deste ponto.

Assim, a pipeta de microinjeção limpa a parte superior dos neurônios. Agora programe as configurações do manipulador microm para micro injeções. Defina o modo de injeção de um manipulador einor microm para ligado e a função de empalamento para desligado para minimizar os danos às células.

Durante a microinjeção, designe um caminho de injeção diagonal selecionando o modo axial. Defina a velocidade de injeção para 300 micrômetros por segundo e sincronize o acúmulo de pressão no limite. Próximo programa.

As configurações do injetor de pressão definem a pressão de injeção ou PI entre 100 e 200 Hector Pascals ou HPA, a duração da injeção ou ti para 0,3 segundos e a pressão de compensação ou PC para 30 HPA. Uma vez ajustadas as configurações do manipulador, podem ser realizadas injeções intranucleares. Usando a posição de controle do estágio do eixo XY do microscópio, o neurônio sob a ponta da pipeta de microinjeção.

Alinhe a ponta da pipeta acima do centro do núcleo, concentrando-se para cima e para baixo entre a ponta e o núcleo. Injete o núcleo pressionando o botão de injeção no micro manipulador. A injeção da viscosidade relativamente baixa.

A solução de CDNA geralmente aparece como uma pluma branca no núcleo. Quando visto sob óptica de contraste de fase. Continue injetando neurônios reposicionando o microscópio stage para alinhar o próximo neurônio sob a pipeta de microinjeção.

Navegue sistematicamente pelo prato. Continuando a injetar núcleos. Use a função de limpeza descrita anteriormente a cada 10 a 15 injeções para verificar a qualidade da pipeta de microinjeção.

Se a pipeta estiver entupida ou danificada, substituída por uma nova injeção. O desnível da pipeta na superfície inferior das placas de cultura de tecidos pode fazer com que a pipeta de injeção perca a célula ou impeça que a pluma branca seja visível no núcleo. Nesses casos, basta ajustar a ponta da pipeta de microinjeção para o mesmo plano de foco do núcleo e defini-la como o novo limite do eixo x.

Em seguida, continue injetando neurônios. Às vezes, a pipeta de microinjeção não penetra na membrana nuclear e simplesmente cutuca o núcleo. Se isso acontecer, uma segunda tentativa de injeção na mesma posição pode levar a uma injeção bem-sucedida de DNA no núcleo.

O inchaço da célula geralmente é indicativo de injeção citoplasmática não intencional. Depois de injetar de 50 a cem núcleos, retorne o prato de neurônios à incubadora para incubação durante a noite. Após 16 horas, os neurônios injetados com sucesso podem ser identificados pela expressão de um gene repórter.

Neste campo, um gânglio cervical superior ou neurônio SCG foi injetado e pode ser identificado pela expressão de EGFP. Os neurônios SCG não injetados, que não possuem proteína G endógena acoplada para retificar internamente os canais de potássio ou grk, não dão origem a correntes mensuráveis durante uma rampa de tensão. Quando exposto ao agonista do receptor acoplado à proteína G norepinefrina em comparação, injeção bem-sucedida de codificação de plasmídeo CD NA, um canal grk funcional dá origem a grandes correntes durante uma rampa de voltagem quando exposto à norepinefrina.

As correntes medidas aqui são típicas dos canais de Kirk e são caracterizadas pela ativação pela retificação interna da norepinefrina e inibição pelo suposto bloqueador do canal grk. Bário, acabamos de mostrar como injetar CD NA no núcleo dos neurônios. Ao realizar esta técnica, é importante lembrar de quatro coisas.

Um, para girar o DNA antes da injeção. Dois, para garantir que o núcleo seja claramente visível. Três, para reajustar o limite do eixo Z ao navegar ao redor do prato.

E quatro, verificar regularmente a qualidade da ponta estimulante entre as injeções. Então, isso é um agradecimento por assistir e boa sorte com seu experimento.